라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

요약

우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.

초록

주로 최면/균주 적 성장률의 변화에 의존하는 필라멘트 균류의 식민지 성장이 식민지 크기를 비교하여 고화된 미디어에 거시적으로 추정된다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 그러나, 다른 환경/성장 조건(pH, 온도, 탄소 및 질소 원, 항생제 등)하에서 유전적으로 다른 곰팡이 균주 또는 균주의 성장 속도를 정량적으로 측정하는 것은 도전적이다. 따라서, 성장 운동학을 정량화하기 위한 보완적인 접근법의 추구는 곰팡이 세포 성장을 더 잘 이해하기 위해 필수적이다. 또한, 아스퍼질러스 스프를 포함한 필라멘트 균류는 고체 미디어 또는 침수 된 문화에 대한 공중 조건하에서 뚜렷한 성장과 차별화 모드를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 여기서는 침수된 배양과 고체 매체 모두에서 라이브 이미징을 사용하여 모델 균주 아스퍼질러스 니둘란스의성장 운동학을 분석하기 위한 정량적 현미경 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 사용자의 사전 이미지 분석 전문 지식을 필요로하지 않는 방식으로, 오픈 소스, 바이오 이미지 (예를 들어, 피지)에 대한 무료 소프트웨어를 사용하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 방식으로 다른 곰팡이 균주의 성장 속도를 캡처합니다.

서문

필라멘트 균류는 큰 사회 경제적 및 생태학적 중요성, 효소 및 항생제 생산을위한 산업 / 농업 도구로 모두 중요하다^1,2 및 작물 식물^3의병원균으로, 해충 곤충⁴ 및 인간^3. 더욱이, 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 필라멘트 균류는 유전학, 세포 및 진화 생물학연구뿐만 아니라 최면 연장^5의연구와 같은 근본적인 연구를 위한 모델 유기체로서 널리 사용된다. 필라멘트 균류는 연장 팁^6에서막 지질 /단백질의 지속적인 공급과 세포벽의 드 노보 합성을 통해 길게 하는 매우 편광 된 유기체이다. 최면 팁 성장 및 극성 유지 보수의 중심적인 역할은 주로 사이토스켈레탈 성분과 골기^6,7,8의편광 분포로 구성된 고도로 정렬된 구조인 'Spitzenkorper'(SPK)라는 특수 구조이다.

환경 자극/신호, 이러한 물 공기 인터페이스, 빛,_CO2 농도 및 영양 상태는 이러한 금형^9에의해 이루어진 발달 결정에 대한 책임이 있다. 침수(액체) 배양에서 A. nidulans의 분화는 억압되고 성장은 최면 팁 신장^6에의해 발생한다. 식물 성장 중, 무성 포자 (코니디아) 정수 확장에 의해 발아, 상호 연결된 최면 세포의 미분화 네트워크를 형성, 균사체, 영양분과 공간을 사용할 수있는 한 무기한 성장을 계속 할 수있다. 한편, 고체 미디어 최면 팁에 잔인하고 식물성장의 정의된 기간(발달 능력) 후, 무성생식이 개시되고, 공중 호디오포레 줄기는 균사체^6의전문 발 세포로부터 확장된다. 이들은 유리한 환경 조건하에서 성장을 다시 시작할 수 있는 haploid conidia^10의 긴 사슬을 생성하는 conidiophores에게 불린 특화된 발달 다세포 구조물을 초래합니다.

필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 널리 사용되는 방법은 페트리 접시에 함유 된 영양소 천에 포자를 접종하고 매크로로 며칠 후 식민지의 직경을 측정하는 것입니다^11. 식민지의 직경/면적은 근생 성장속도의 변화에 가장 의존하고,^12밀도에덜 의존하는 것으로, 성장의 가치로 사용된다. 고체 표면에서 성장하는 곰팡이 인구 (식민지) 크기를 측정하는 것은 매우 적절하지만 결코 가장 정확한 성장 척도는 아닙니다. 인구 수준 평균(곰팡이 식민지 크기의 평균)에 비해, 단일 세포 측정은 세포 집단의 이질성을 포착하고 세포의 새로운 하위 집단의 식별을 허용할 수 있으며,^13,역학, 경로뿐만 아니라 세포가 내인성 및 환경 변화에 반응하는 생물학적^{메커니즘을 14,15.} 시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 틀림없이 가장 널리 사용되는 정량적 단일 세포 관찰 접근법입니다.

본 명세서에서는, 전염된 광 현미경 기술(예: 위상 대조, 차동 간섭 대조(DIC), 편광 현미경 검사법을 사용하여 라벨없는 라이브 이미징 프로토콜을 상세히 설명하여 이미지를 캡처하는데, 이는 형광 현미경 현미경의 결합된 사용과 는 독립적으로 A. nidulans 균주의 극성 성장을 분석하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다.

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프로토콜

1. 접종 준비

참고: 모든 단계는 라미나르 흐름 캐비닛 아래에서 수행해야 합니다.

1. 멸균 접종 루프를 이용한 글리세롤 육수(-80°C)로부터, 최소 미디어(MM)의 플레이트에 스트레인 검사와 관련된 적절한 영양 요건으로 보충된 글리세롤 스톡(-80°C)으로부터 관심있는 곰팡이 균주를 줄무늬 [MM: 10.0g/L 포도당, 20mL/L 염용액:26g/L KCl, 26g/L KCl, 26g/L/Mg/Mg.L 76 g/L KH₂PO_4,2.0 mL/L 클로로폼) 및 1 mL/L 미량 원소(미량 원소: 40 mg/L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 mg/L CuSO_4,8 g/L ZnSO_4,800 mg/L MnSO_4,800 mg/L FePO_4),pH를 1M NaOH로 6.8로 조정하고, 1%(w/v) 한도및^16및 오토클라브에 설명된 바와 같이 필요한보충제를1%로 추가하였다.
   참고: 소금 용액, 미량 원소 솔루션 및 보충제는 자동화됩니다.
2. 37 °C에서 2 -3 일 동안 배양하십시오.
3. 멸균 이쑤시개(또는 접종 루프)를 사용하여 소량의 코니디아를 단일 식민지에 부드럽게 만지고 완전한 미디어(CM) [CM: 10.0g/L 포도당, 2.0 g/L 펩톤, 1.0 g/L 효모 추출물, 1.0 g/L 카산산, 20mL/L 솔트 솔루션, 비타민 1m/ L/ mL 용액 1mL/L 용액, 비타민 1m/L 용액 0.1 g/L 리보플라빈, 0.1 g/L 니코티나미드, 0.01 g/L p-아미노 벤조산, 0.05 g/L 피리독신 HCl, 1.0 mg/L 비오틴), pH를 1M NaOH로 6.8로 조정하고, 1%(w/v) agar 및^160억 을 추가합니다. 4°C의 어두운 병에 비타민 용액을 저장하여 오토클레이브를 저장합니다.
   참고: 곰팡이 성장이 너무 조밀하여 개별 식민지를 식별하고 격리할 수 없는 경우, 단일 식민지를 얻기 위해 새 한천 판으로 다시 행진합니다.
4. 37 °C에서 3-4 일 동안 배양하십시오.
5. CM 천판에서 자란 콘리디아드 곰팡이 콜로니의 표면으로부터 약 2 x 10⁶ 셀/mL의 정중 현탁액을 획득하여 멸균 이쑤시개(도S1)를사용한다.
   참고: 필요한 경우 혈류계로 코니디아를 계산합니다.
6. 멸균 1.5 mL 원심분리기 튜브에 A. nidulans의 수확 conidias 0.05% (v/v) Tween 80 코니아 덩어리의 수를 감소시키기 위한 자동 증류수의 1.0 mLL.
   참고: 코니디아는 생존 가능성의 관련 손실없이 4 °C에서 최대 2-3 주 동안 저장할 수 있습니다 (A. 아타나소풀로스와 V. 소피아노풀루, 게시되지 않은 데이터). 그러나, 간원부부종을 방지하기 위해, 균류 부품및 영양분을 제거하기 위해 편정 현탁액을 필터링 및/또는 세척하는 것이 좋습니다.

2. 한천 (고체) 매체에서 성장하는 화상 진찰 필라멘트 곰팡이 준비

참고: '반전 된 한천 방법^17,18의 수정 된 버전이 사용됩니다.

1. 처음에는 페트리 접시(Ø9cm) 15mL에 1%(w/v) 한천(그림 2)을 여러 지점에서 격렬하게 소용돌이로 장식한 원원(약 2 x 10⁴ 셀/mL)의 10μL 알리쿼트(그림2)를발견한다.
   참고: '반전 된 천 방법'의 수정 된 버전을 사용하여, 성장 최면에 명백한 해로운 효과없이 많은 시간 동안 곰팡이 샘플을 이미지 할 수있다.
2. 조사될 개발 단계에 따라 실험 문화를 배양한다.
3. 멸균 메스를 사용하여 식민지를 함유한 ≈0.8mm² 블록의 한고를 슬라이스합니다.
   참고: 슬라이스할 한천 블록의 치수는 나중에 배치할 장비의 치수에 따라 달라집니다. 현재 작업에서는 8개의 잘 μ 슬라이드가 사용됩니다(아래 참조).
4. 반전하고 라이브 이미징에 적합한 커버 슬립과 μ 슬라이드 또는 유사한 8 챔버 커버 글래스의 우물에 한천 블록을 배치합니다.
   참고: 송신된 광 현미경 검사법은 형광(labeling) 현미경 검사법과 병용될 경우, 한천 블록은 이미징 직전에 살아있는 세포 염색염을 함유하는 액체 배지의 액적에 반전될 수 있다.

3. 액체 매체에서 자라는 필라멘트 곰팡이 에 대한 준비

1. 적절한 보충제를 함유한 8웰 μ 슬라이드(액체) MM의 우물에서^10μL 알리쿼트(위 참조)를 이송한다.
2. 원하는 온도에서 원하는 시간에 대해 배양한다(도3).
   참고: 전염된 광 현미경 검사가 형광(labeling) 현미경 검사법과 병용하여 사용될 경우, 액체 배양은 실험¹⁹동안 원하는 시점에서 형광염료를 첨가할 수 있다는 큰 장점이 있다.

4. 이미지 캡처

참고: 현미경의 선택은 사용 가능한 장비에 따라 달라집니다. 어떤 경우에 현미경 설치는 반전 단계, 환경 챔버 또는 정밀한 공기 온도 제어가 있는 적어도 방을 포함해야 합니다.

1. 37°C에서 열성 현미경 챔버를 예열하여 (달리 표시되거나 사용된 곰팡이 종에 적합하지 않는 한) 시작하기 전에 온도를 안정화시한다. 이 챔버는 시간 경과 실험 중 현미경 광학 및 샘플 단계의 온도 변조를 허용합니다. 일반 침수 오일(23°C에서 사용하도록 설계된) 오일이 37°C 이상에서 사용될 때 광학^{수차(20)가} 도입된다는 점에 유의하십시오.
   참고 : 꽉 예산에, 인큐베이션 챔버는 골판지 및 절연 포장 재료^(21)로 만들 수 있습니다 또는 3D 프린터^(22)를사용하여.
2. 현미경, 스캐너 전원, 레이저 전원 및 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다. 현미경 단계와 초점에 μ 슬라이드 (이전에 준비)를 배치합니다.
3. 이미지 분석 중에 성장 측정을 용이하게 하기 위해 격리되거나 겹치지 않는 셀(또는 적어도 혼잡하지 않은)을 포함하는 뷰 필드를 찾습니다. 강력한 통계 분석을 허용하기 위해 샘플당 적어도 50개의 성장하는 세포를 캡처합니다.
4. 원하는 전송된 광 현미경 현미경 접근법을 선택합니다. 다른 곳에서 설명한 바와 같이, 노출 시간 또는 레이저 전력 및 픽셀 거주 시간 및/또는 핀홀 직경을 증가시켜 곰팡이 세포의 광표백을 ^{최소화한다.}
5. 현미경을 설정하여 원하는 시간 간격으로 이미지를 획득하고 타임시리즈 수집을 시작합니다.
   참고: 열 드리프트, 다양한 셀 크기 및 셀 모션으로 인해 시간이 지남에 따라 초점 드리프트를 수정하려면 현미경 소프트웨어에서 사용할 수 있는 경우 자동 초점 전략을 사용합니다.

5. 이미지 분석

참고: 이 섹션에서는 A. nidulans의성장률을 측정하기 위한 시간 경과 현미경 이미지를 처리하는 주요 단계를 설명합니다. 이미지의 개방, 시각화 및 처리는 오픈 소스 ImageJ /피지 소프트웨어^(25)로수행됩니다.

1. 플러그인 | 사용하여 피지에 이미지를 가져 오기 바이오 포맷 | 기본 설정피지 메뉴에서 바이오 포맷가져오기(그림 4A).
   참고: Bio-Formats 가져오기자가 이미지 보정을 제대로 인식하는지 확인합니다. 상측 정보 필드 이미지 창에 표시된 그림 차원은 원래 그림 치수(도4B)와같아야 한다. ImageJ/Fiji 소프트웨어에서 이미지 속성을 표시하고 변경하려면 시프트 + P를 누릅니다.
2. 필요한 경우, 다른 프레임 사이의 조명 보정을 위해 히스토그램 일치^26을 사용합니다(이미지 | 조정 | 표백제 보정 | 히스토그램 매칭)(그림 4C).
3. 필요한 경우 SIFT 알고리즘(플러그인 | 사용 등록 | 이미지 스택정렬또는 일치를 위한 SIFT와의 선형 스택정렬(그림 4D). 예상 변환 메뉴에서"번역"을선택하면 x-y 드리프트를 수정하기에 충분해야 합니다.
   참고: 다른 플러그인을 사용하여 이미지 안정기(https://imagej.net/Image_Stabilizer) 또는 StackReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)와 같은 이미지 조각 스택을 정렬할 수도 있습니다.
4. 기울어진 것을 피하면서 커버슬립에 평행하게 자라는 최해를 선택하십시오. 극확장에 의해 전파되는 최면을 선택하고 측면 및/또는 액면 분기를 제시하는 최해를 피하십시오.
5. MTrackJ(플러그인 | 사용 MTrackJ)플러그인 성장 하이팔 팁을 추적(그림 4E)²⁷. 트랙을 추가하려면 도구 모음에서 추가 단추를 선택하고 마우스의 왼쪽 클릭을 사용하여 최면 팁에 첫 번째 점을 배치합니다. 타임 시리즈는 자동으로 다음 프레임으로 이동합니다. 추적 프로세스를 완료하려면 마지막 지점에서 마우스를 두 번 클릭하거나 Esc 키를 누릅니다(그림4F). 초기 시간 프레임에서 다른 관심 지점(즉, 하이팔 팁 증가)으로 이동하여 다른 하이파의 성장률을 측정하여 절차를 다시 시작합니다.
   참고: MTrackJ를 설치하려면 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 제시된 지침을 따르십시오.
6. MTrackJ 대화상자(그림 4G)에서 측정 버튼을 클릭하여 출력 테이블을 엽니다. 트랙 측정저장(파일 | 원하는 파일 형식(예: csv)에 저장하고 분석하고 플롯합니다(그림4H).
   참고: 동영상 버튼을 선택하면 이미지와 트랙 진행을 보여주는 동영상이 생성됩니다.

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결과

이 프로토콜에 따라 필라멘트 균개 A. nidulans의다양한 성장/발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 이 연구에서 제시된 데이터는 피지 소프트웨어를 사용하여 처리되고 분석되었습니다. 측정은 판다, numpy, 통계 모델, matplotlib 및 seaborn과 같은 소프트웨어 라이브러리를 사용하여 상용 통계 소프트웨어 및 /또는 Python 프로그래밍 언어를 사용하여 그래프로 통계적으로 ...

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토론

시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 특정 약물 치료 및/또는 유전 적 개입이 시간이 지남에 따라 검출 가능한 세포 성장 또는 표현성 차이의 결과인지 여부를 실시간으로 정량적으로 정확하게 결정하는 강력한 접근법입니다.

본 연구에서는, 신뢰할 수 있는 살아있는 세포 이미징 방법론이 A. nidulans에서세균관및 최면 팁 성...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4