Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

Resumo

Apresentamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida para capturar imagens, analisar e quantificar a cinética de crescimento do fungo filamentoso A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida. Este protocolo pode ser usado em conjunto com microscopia de fluorescência.

Resumo

Está bem estabelecido que o crescimento de fungos filamentosos, principalmente dependentes de mudanças na taxa de crescimento hifa/micáceico, é macroscopicamente estimado em mídia solidificada comparando o tamanho da colônia. No entanto, medir quantitativamente a taxa de crescimento de cepas ou cepas fúngicas geneticamente diferentes sob diferentes condições ambientais/de crescimento (pH, temperatura, fontes de carbono e nitrogênio, antibióticos, etc.) é um desafio. Assim, a busca de abordagens complementares para quantificar a cinética do crescimento torna-se obrigatória para entender melhor o crescimento das células fúngicas. Além disso, é sabido que fungos filamentosos, incluindo aspergillus spp., possuem modos distintos de crescimento e diferenciação sob condições sub-aéreas em mídia sólida ou culturas submersas. Aqui, detalhamos um método microscópico quantitativo para analisar a cinética de crescimento do fungo modelo Aspergillus nidulans, utilizando imagens vivas em culturas submersas e mídia sólida. Capturamos imagens, analisamos e quantificamos as taxas de crescimento de diferentes cepas fúngicas de forma reprodutível e confiável usando um software livre de código aberto para bioimagens (por exemplo, Fiji), de uma forma que não exija qualquer experiência prévia de análise de imagem do usuário.

Introdução

Os fungos filamentosos são de grande importância socioeconômica e ecológica, sendo tanto cruciais quanto ferramentas industriais/agrícolas para a produção de enzimas e antibióticos^1,2 e como patógenos de plantas agrícolas³, insetos de^{pragas 4} e humanos³. Além disso, fungos filamentosos como os nidulans Aspergillus são amplamente utilizados como organismos-modelo para pesquisas fundamentais, como estudos em genética, biologia celular e evolutiva, bem como para o estudo da extensão hifal⁵. Fungos filamentosos são organismos altamente polarizados que alongam o fornecimento contínuo de lipídios/proteínas de membrana e a nova síntese da parede celular na ponta de extensão⁶. Um papel central no crescimento da ponta hífa e na manutenção da polaridade é uma estrutura especializada chamada 'Spitzenkorper' (SPK), uma estrutura altamente ordenada composta principalmente por componentes citoesqueléticos e distribuição polarizada do Golgi^6,7,8.

Estímulos/sinais ambientais, tais interface água-ar, luz, concentração de CO₂ e o estado nutricional são responsáveis pelas decisões de desenvolvimento tomadas por esses moldes⁹. Nas culturas submersas (líquidas) a diferenciação de A. nidulans é reprimida e o crescimento ocorre por alongamento da ponta hiphal⁶. Durante o crescimento vegetativo, esporos assexuados (conidia) germinam por extensão apical, formando uma rede indiferenciada de células hifamais interconectadas, o micélio, que pode continuar a crescer indefinidamente enquanto nutrientes e espaço estiverem disponíveis. Por outro lado, em pontas higiféricas de mídia sólida alongam e após um período definido de crescimento vegetativo (competência do desenvolvimento), inicia-se a reprodução assexual e os talos de conidiophore aéreo se estendem das células especializadas do pé do^{micélio 6}. Estes dão origem a estruturas multicelulares especializadas de desenvolvimento chamadas conidioforos, que produzem longas cadeias de conidia¹⁰ haploide que podem reiniciar o crescimento em condições ambientais favoráveis.

Um método amplamente utilizado para medir o crescimento fúngico filamentoso é inocular esporos em ágar nutrientes contidos em uma placa de Petri e medir macroscopicamente o diâmetro da colônia alguns dias^{depois 11}. O diâmetro/área da colônia, mais dependente de mudanças na taxa de crescimento micelial e menos na densidade conidiophore^12,é então usado como um valor de crescimento. Embora, medir o tamanho da população fúngica (colônia) crescendo em superfícies sólidas seja bastante adequado, não é de forma alguma a medida mais precisa de crescimento. Em comparação com as médias populacionais (médias do tamanho da colônia fúngica), as medições de células únicas podem capturar a heterogeneidade de uma população celular e permitir a identificação de novas subsédias de células, afirma¹³, dinâmicas, caminhos, bem como os mecanismos biológicos pelos quais as células respondem a mudanças endógenas e ambientais^14,15. Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é, sem dúvida, a abordagem de observação de células únicas quantitativas mais amplamente empregadas.

Aqui, detalhamos um protocolo de imagem ao vivo sem rótulos usando técnicas de microscopia de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia polarizada) para capturar imagens, que independentemente do uso combinado de microscopia de fluorescência podem ser empregadas para analisar e quantificar o crescimento polar de cepas de A. nidulans em culturas submersas e mídia sólida.

Protocolo

1. Preparação inóculo

NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um gabinete de fluxo laminar.

1. Estirpe de interesse fúngico, a partir de um estoque de glicerol (-80 °C) utilizando um laço de inoculação estéril, em placas de mídia mínima (MM) complementadas com os requisitos nutricionais adequados relevantes para a cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glicose, solução de sal de 20 mL/L (solução de sal: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H_2,O 76 g/L KH₂PO₄, 2,0 mL/L clorofórmio) e 1 mL/L de traços (elementos de traço: 40 mg/L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 mg/L CuSO₄, 8 g/L ZnSO₄, 800 mg/L MnSO₄, 800 mg/L FePO₄), ajuste o pH para 6,8 com 1 M NaOH, adicione 1 % (w/v) ágar e os suplementos necessários conforme descrito em¹⁶ e autoclave] (Figura 1).
   NOTA: Solução de sal, solução de elementos de rastreamento e suplementos são autoclaved.
2. Incubar por 2-3 dias a 37 °C.
3. Use um palito estéril (ou um laço de inoculação), transfira um pequeno número de conídios, tocando suavemente uma única colônia, para placas de mídia completa (CM) [CM: 10,0 g/L de glicose, 2,0 g/L peptone, 1,0 g/L extrato de levedura, 1,0 g/L casaminoácidos, solução de sal de 20 mL/L, elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: 20 mL/L), elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas de 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: 20 mL/L, elementos de traço de 1 mL/L, solução de vitaminas 5 mL/L (solução de vitaminas: solução de vitaminas: solução de vitaminas: 1 mL/L) 0,1 g/L riboflavina, 0,1 g/L nicotinamida, 0,01 g/L p-amino benzoico ácido, 0,05 g/L piridoxina HCl, 1,0 mg/L biotina), ajuste pH para 6,8 com 1 M NaOH, adicione 1 % (w/v) ágar e os suplementos necessários conforme descrito em¹⁶ e autoclave]. Autoclave e armazene a solução de vitaminas em uma garrafa escura a 4 °C.
   NOTA: No caso de o crescimento fúngico ser muito denso para identificar e isolar colônias individuais, re-traço em uma nova placa de ágar para obter colônias únicas.
4. Incubar por 3-4 dias a 37 °C.
5. Obtenha uma suspensão conidial de aproximadamente 2 x 10⁶ células/mL, arranhando 1 cm da superfície de uma colônia fúngica conidiada cultivada em placas de ágar CM, utilizando um palito estéril(Figura S1).
   NOTA: Quando necessário, conte conidia com um hemótmetro.
6. Colher conidia de A. nidulans em um tubo de centrífuga de 1,5 mL estéril com 1,0 mL de água autoclavada destilada contendo 0,05% (v/v) Tween 80 para reduzir o número de aglomerados de conidia.
   NOTA: Conidia pode ser armazenada por até 2-3 semanas a 4 °C sem uma perda relevante de viabilidade (A. Athanasopoulos e V. Sophianopoulou, dados inéditos). No entanto, recomenda-se filtrar e/ou lavar suspensão conidial para remover partes e nutrientes micelial, a fim de evitar o inchaço conidial.

2. Preparação para fungos filamentosos de imagem crescendo em meios de ágar (sólidos)

NOTA: É utilizada uma versão modificada do método ágar invertido^17,18.

1. Inicialmente, spot 10 μL alíquotas de conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 10⁴ células/mL) em vários pontos em placas de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM com 1% (w/v) ágar(Figura 2).
   NOTA: Usando a versão modificada do "método ágar invertido", é possível imaginar amostras fúngicas por muitas horas sem efeitos deletérios aparentes no cultivo de hifas.
2. Incubar a cultura experimental de acordo com o estágio de desenvolvimento destinado a ser investigado.
3. Corte um bloco de ágar^≈0,8 mm 2 contendo a colônia usando um bisturi estéril.
   NOTA: As dimensões do bloco de ágar a ser fatiado dependem das dimensões do equipamento a serem colocadas posteriormente. No presente trabalho, são utilizados 8 slides bem μ (veja abaixo).
4. Inverta e coloque o bloco de ágar em um poço de μ-slide ou um vidro de cobertura de 8 câmaras semelhante com tampas adequadas para imagens ao vivo.
   NOTA: Caso a microscopia de luz transmitida seja usada em combinação com microscopia de fluorescência (rotulagem), o bloco de ágar pode ser invertido em uma gota de meio líquido contendo o corante de coloração de células vivas, pouco antes da imagem.

3. Preparação para fungos de imagem filamentosos crescendo em meio líquido

1. Transfira 10 alíquotas de μL de uma suspensão conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 10⁴ células/mL) nos poços de um slide de 8 poços μ contendo 200 μL de MM (líquido) com os suplementos apropriados (ver acima).
2. Incubar para o tempo desejado na temperatura desejada(Figura 3).
   NOTA: Se a microscopia luminosa transmitida for usada em combinação com microscopia de fluorescência (rotulagem), as culturas líquidas têm a grande vantagem de que os corantes fluorescentes podem ser adicionados a qualquer ponto de tempo desejado durante o experimento¹⁹.

4. Capture imagens

NOTA: A escolha do microscópio depende do equipamento disponível. Em qualquer caso, a configuração do microscópio deve incluir um estágio invertido, uma câmara ambiental ou pelo menos uma sala com controle preciso da temperatura do ar.

1. Pré-aqueça a câmara de microscópio termostato a 37 °C (a menos que indicado de outra forma ou adequado para as espécies fúngicas usadas) para estabilizar a temperatura antes de começar. Esta câmara permite a modulação da temperatura da óptica do microscópio e o estágio amostral durante experimentos de lapso de tempo. Esteja ciente de que as aberrações ópticas²⁰ são introduzidas quando óleos normais de imersão (projetados para uso a 23 °C) são usados a 37 °C ou superior.
   NOTA: Em um orçamento apertado, as câmaras de incubação podem ser feitas de papelão e material de embalagem isolante²¹ ou usando uma impressora 3D²².
2. Ligue o microscópio, a potência do scanner, a potência do laser e o computador, e carregue o software de imagem. Coloque o μ-slide (preparado anteriormente) no estágio do microscópio e no foco.
3. Encontre campos de visão que contenham células isoladas/não sobrepostas (ou pelo menos não superlotadas), a fim de facilitar as medições de crescimento durante a análise da imagem. Capture pelo menos 50 células em crescimento por amostra para permitir uma análise estatística robusta.
4. Selecione a abordagem de microscopia de luz transmitida desejada. Reduza o tempo de exposição ou a potência do laser e o tempo de moradia dos pixels e/ou aumente os diâmetros do orifício, a fim de minimizar o fotobleaching das células fúngicas, como descrito em outros lugares ^23,24.
5. Defina microscópio para adquirir imagens nos intervalos de tempo desejados e iniciar a aquisição da série de tempo.
   NOTA: Para corrigir a deriva focal ao longo do tempo (especialmente para experimentos longos), devido à deriva térmica, tamanhos de células diversos e movimento celular use uma estratégia de foco automático se disponível em seu software de microscópio.

5. Análise de imagem

NOTA: Esta seção descreve as principais etapas do processamento de imagens de microscopia de lapso de tempo para medir a taxa de crescimento de A. nidulans. Abertura, visualização e processamento de imagens é realizada com o software ImageJ/Fiji de código aberto²⁵.

1. Importe as imagens para Fiji usando plugins | Bioformiagens | Importador de bioformitos do menu Fiji com configurações padrão(Figura 4A).
   NOTA: Verifique se o Importador de Bioformiagens reconhece corretamente a calibração da imagem. A dimensão da imagem mostrada na janela de imagem do campo de informações superiores deve ser igual às dimensões originais da imagem(Figura 4B). Pressione Shift + P para exibir e alterar propriedades de imagem no software ImageJ/Fiji.
2. Quando necessário, use histograma correspondente²⁶ para correção de iluminação entre diferentes quadros(Imagem | Ajuste | | de correção de alvejante Histograma correspondente)(Figura 4C).
3. Quando necessário, use o algoritmo SIFT(Plugins | | de inscrição Alinhamento linear da pilha com SIFT) para alinhar ou combinar pilhas de imagens(Figura 4D). Selecionar "Tradução" do menu de transformação esperado deve ser suficiente para corrigir qualquer deriva x-y.
   NOTA: Outros plugins também podem ser usados para alinhar uma pilha de fatias de imagem, como estabilizador de imagem (https://imagej.net/Image_Stabilizer) ou StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. Selecione hifas que crescem paralelamente ao deslizamento de cobertura, evitando aqueles que estão inclinados. Certifique-se de selecionar hifas que se propagam por extensão polar e evitar hifas apresentando ramificações laterais e/ou apical.
5. Use MTrackJ (Plugins | Plugin MTrackJ) para rastrear as pontas de higfê-lo em crescimento(Figura 4E)²⁷. Para adicionar uma faixa, selecione o botão Adicionar na barra de ferramentas e coloque o primeiro ponto em uma ponta de hignênfa usando o clique esquerdo do mouse. A série de tempo passará automaticamente para o próximo quadro. Para concluir o processo de rastreamento, clique duas vezes no mouse no ponto final (ou pressione a tecla Esc) (Figura 4F). Mova-se para outro ponto de interesse (ou seja, ponta hignífa em crescimento) no período inicial e reinicie o procedimento medindo a taxa de crescimento de outro hypha.
   NOTA: Para instalar o MTrackJ siga as instruções apresentadas em https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. Clique no botão Medir na caixa de diálogo MTrackJ (Figura 4G) para abrir a tabela de saída. Salvar medidas de faixa(| de arquivos Salve As) para o formato de arquivo desejado (por exemplo, csv), analise e plote-os(Figura 4H).
   NOTA: Ao selecionar o botão Filme, um filme é produzido mostrando a imagem e a progressão da faixa.

Resultados

Seguindo este protocolo, capturamos e analisamos várias imagens correspondentes a diferentes estágios de crescimento/desenvolvimento do fungo filamentoso A. nidulans. Os dados apresentados neste estudo foram processados e analisados utilizando-se o software Fiji. As medições foram salvas como arquivos csv, estatisticamente analisadas e preparadas como gráficos usando software estatístico comercial e/ou linguagem de programação Python usando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels, matplot...

Discussão

Monitorar o crescimento e o fenótipo das células fúngicas por microscopia de lapso de tempo é uma abordagem poderosa para avaliar o comportamento celular em tempo real e quantitativamente e com precisão e determinar com precisão se um tratamento medicamentoso específico e/ou intervenção genética resulta em crescimento celular detectável ou diferenças fenotípicas ao longo do tempo.

Neste estudo, foi descrita uma metodologia confiável de imagem de células vivas para medir e analis...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4