Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source

Résumé

Nous présentons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie optique transmise pour capturer des images, analyser et quantifier la cinétique de croissance du champignon filamenteux A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides. Ce protocole peut être utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.

Résumé

Il est bien établi que la croissance des colonies de champignons filamenteux, qui dépend principalement des changements dans le taux de croissance apicale des hyphes et des mycéliums, est estimée macroscopiquement sur les milieux solidifiés en comparant la taille des colonies. Cependant, mesurer quantitativement le taux de croissance de souches ou de souches fongiques génétiquement différentes dans différentes conditions environnementales / de croissance (pH, température, sources de carbone et d’azote, antibiotiques, etc.) est difficile. Ainsi, la poursuite d’approches complémentaires pour quantifier la cinétique de croissance devient obligatoire afin de mieux comprendre la croissance des cellules fongiques. En outre, il est bien connu que les champignons filamenteux, y compris Aspergillus spp., ont des modes distincts de croissance et de différenciation dans des conditions subaérivoles sur des milieux solides ou des cultures submergées. Ici, nous détaillons une méthode microscopique quantitative pour analyser la cinétique de croissance du champignon modèle Aspergillus nidulans, en utilisant l’imagerie en direct dans les cultures submergées et les milieux solides. Nous capturons des images, analysons et quantifions les taux de croissance de différentes souches fongiques de manière reproductible et fiable à l’aide d’un logiciel open source et gratuit pour les bio-images (par exemple, Fidji), d’une manière qui ne nécessite aucune expertise préalable en analyse d’images de la part de l’utilisateur.

Introduction

Les champignons filamenteux sont d’une grande importance socio-économique et écologique, étant à la fois cruciaux en tant qu’outils industriels / agricoles pour la production^d’enzymeset d’antibiotiques^1,2 et en tant qu’agents pathogènes des plantes cultivées³, insectes nuisibles⁴ et humains³. De plus, les champignons filamenteux tels que Aspergillus nidulans sont largement utilisés comme organismes modèles pour la recherche fondamentale, comme les études en génétique, biologie cellulaire et évolutive ainsi que pour l’étude de l’extension hyphale⁵. Les champignons filamenteux sont des organismes hautement polarisés qui s’allongent grâce à l’apport continu de lipides/protéines membranaires et à la synthèse de novo de la paroi cellulaire à l’extrémité extensible⁶. Un rôle central dans la croissance de la pointe hyphale et le maintien de la polarité est une structure spécialisée appelée « Spitzenkorper » (SPK), une structure hautement ordonnée composée principalement de composants cytosquelettes et de la distribution polarisée du Golgi^6,7,8.

Les stimuli/signaux environnementaux, tels que l’interface eau-air, la lumière, la concentration de CO₂ et l’état nutritionnel sont responsables des décisions de développement prises par ces moisissures⁹. Dans les cultures submergées (liquides), la différenciation d’A. nidulans est réprimée et la croissance se produit par allongement de la pointe hyphale⁶. Au cours de la croissance végétative, les spores asexuées (conidies) germent par extension apicale, formant un réseau indifférencié de cellules hyphales interconnectées, le mycélium, qui peut continuer à croître indéfiniment tant que les nutriments et l’espace sont disponibles. D’autre part, sur les milieux solides, les pointes hyphales s’allongent et après une période définie de croissance végétative (compétence développementale), la reproduction asexuée est initiée et les tiges de conidiophores aériennes s’étendent à partir de cellules spécialisées du pied du mycélium⁶. Ceux-ci donnent naissance à des structures multicellulaires de développement spécialisées appelées conidiophores, qui produisent de longues chaînes de conidies haploïdes¹⁰ qui peuvent relancer la croissance dans des conditions environnementales favorables.

Une méthode largement utilisée pour mesurer la croissance fongique filamenteuse consiste à inoculer des spores sur une gélose nutritive contenue dans une boîte de Pétri et à mesurer macroscopiquement le diamètre de la colonie quelques jours plus tard¹¹. Le diamètre/surface de la colonie, le plus dépendant des changements du taux de croissance mycéliale et moins de la densité des conidiophores^12,est alors utilisé comme valeur de croissance. Bien que la mesure de la taille de la population fongique (colonie) qui pousse sur des surfaces solides soit tout à fait adéquate, ce n’est en aucun cas la mesure la plus précise de la croissance. Par rapport aux moyennes au niveau de la population (moyennes de la taille des colonies fongiques), les mesures unicellulaires peuvent saisir l’hétérogénéité d’une population cellulaire et permettre l’identification de nouvelles sous-populations de cellules, états^13,dynamique, voies ainsi que les mécanismes biologiques par lesquels les cellules répondent aux changements endogènes et environnementaux^14,15. La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est sans doute l’approche d’observation quantitative unicellulaire la plus largement utilisée.

Ici, nous détaillons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie à lumière transmise (telles que le contraste de phase, le contraste d’interférence différentielle (DIC) et la microscopie polarisée) pour capturer des images, qui, indépendamment de l’utilisation combinée de la microscopie à fluorescence, peuvent être utilisées pour analyser et quantifier la croissance polaire des souches d’A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides.

Protocole

1. Préparation de l’inoculum

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sous une armoire à flux laminaire.

1. Striez la souche fongique d’intérêt, à partir d’un stock de glycérol (-80 °C) à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, sur des plaques de milieu minimal (MM) complétées par les besoins nutritionnels appropriés en rapport avec la souche examinée [MM: 10,0 g/L de glucose, solution saline de 20 mL/L (solution saline: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H₂O, 76 g/L KH₂PO₄, 2,0 mL/L de chloroforme) et 1 mL/L oligo-éléments (oligo-éléments : 40 mg/L Na₂B₄O₇· H2 O, 400 mg/L CuSO₄, 8 g/L ZnSO₄, 800 mg/L MnSO₄, 800 mg/L FePO₄), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit dans¹⁶ et autoclave] (Figure 1).
   REMARQUE: La solution saline, la solution d’oligo-éléments et les suppléments sont autoclavés.
2. Incuber pendant 2-3 jours à 37 °C.
3. Utiliser un cure-dent stérile (ou une boucle d’inoculation), transférer un petit nombre de conidies, en touchant doucement une seule colonie, sur des plaques de milieu complet (CM) [CM : 10,0 g/L de glucose, 2,0 g/L de peptone, 1,0 g/L d’extrait de levure, 1,0 g/L d’acides casaminés, 20 mL/L de solution saline, 1 mL/L d’oligo-éléments, 5 mL/L de solution vitaminique (solution vitaminique : 0,1 g/L de riboflavine, 0,1 g/L de nicotinamide, 0,01 g/L d’acide p-aminobenzoïque, 0,05 g/L de pyridoxine HCl, 1,0 mg/L de biotine), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M de NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit au^{point 16} et autoclave]. Autoclavez et conservez la solution vitaminique dans une bouteille sombre à 4 °C.
   REMARQUE: Dans le cas où la croissance fongique est trop dense pour identifier et isoler les colonies individuelles, re-streak sur une nouvelle plaque de gélose pour obtenir des colonies uniques.
4. Incuber pendant 3-4 jours à 37 °C.
5. Obtenir une suspension conidiale d’environ 2 x 10⁶ cellules/mL en grattant 1 cm de la surface d’une colonie fongique conidiée cultivée sur des plaques de gélose CM, à l’aide d’un cure-dent stérile(Figure S1).
   REMARQUE: Si nécessaire, comptez les conidies avec un hémocytomètre.
6. Récolter les conidies d’A. nidulans dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL avec 1,0 mL d’eau distillée autoclavée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 80 pour réduire le nombre d’amas de conidies.
   REMARQUE: Conidia peut être stocké jusqu’à 2-3 semaines à 4 ° C sans perte de viabilité pertinente (A. Athanasopoulos et V. Sophianopoulou, données non publiées). Cependant, il est recommandé de filtrer et / ou de laver la suspension conidiale pour éliminer les parties mycéliales et les nutriments, afin de prévenir le gonflement conidial.

2. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur des milieux agar (solides)

REMARQUE: Une version modifiée de la méthode de la 'gélose inversée^17,18 est utilisée.

1. Initialement, repérer des aliquotes de 10 μL de conidial vigoureusement vortexé (environ 2 x 10⁴ cellules/mL) en plusieurs points sur des boîtes de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM avec 1% (p/v) de gélose(Figure 2).
   REMARQUE: En utilisant la version modifiée de la « méthode de la gélose inversée », il est possible d’imager des échantillons fongiques pendant de nombreuses heures sans effets délétères apparents sur les hyphes en croissance.
2. Incuber la culture expérimentale en fonction du stade de développement destiné à être étudié.
3. Découper un bloc de gélose de ≈0,8 mm² contenant la colonie à l’aide d’un scalpel stérile.
   REMARQUE: Les dimensions du bloc de gélose à découper dépendent des dimensions de l’équipement à placer par la suite. Dans le présent ouvrage, 8 diapositives bien μ sont utilisées (voir ci-dessous).
4. Inverser et placer le bloc de gélose dans un puits d’un verre de couverture à glissière μ ou similaire à 8 chambres avec couvercle adapté à l’imagerie en direct.
   REMARQUE: Dans le cas où la microscopie à lumière transmise sera utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), le bloc de gélose peut être inversé sur une gouttelette de milieu liquide contenant le colorant de coloration des cellules vivantes, juste avant l’imagerie.

3. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur un milieu liquide

1. Transférer 10 μL d’aliquotes d’une suspension conidiale vigoureusement vortexée (environ 2 x 10⁴ cellules/mL) dans les puits d’une lame de 8 puits μ contenant 200 μL de MM (liquide) avec les suppléments appropriés (voir ci-dessus).
2. Incuber pendant le temps souhaité à la température souhaitée (Figure 3).
   REMARQUE: Si la microscopie à lumière transmise est utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), les cultures liquides ont le grand avantage que des colorants fluorescents peuvent être ajoutés à n’importe quel moment souhaité au cours de l’expérience¹⁹.

4. Capturez des images

REMARQUE: Le choix du microscope dépend de l’équipement disponible. Dans tous les cas, la configuration du microscope doit inclure un étage inversé, une chambre environnementale ou au moins une pièce avec un contrôle précis de la température de l’air.

1. Préchauffer la chambre thermostatée du microscope à 37 °C (sauf indication contraire ou comme convenant aux espèces fongiques utilisées) pour stabiliser la température avant de commencer. Cette chambre permet la modulation de température de l’optique du microscope et de l’étage d’échantillonnage lors d’expériences time-lapse. Sachez que des aberrations optiques²⁰ sont introduites lorsque des huiles d’immersion normales (conçues pour être utilisées à 23 °C) sont utilisées à 37 °C ou plus.
   REMARQUE: Avec un budget serré, les chambres d’incubation peuvent être fabriquées à partir de carton et de matériau d’emballage isolant²¹ ou à l’aide d’une imprimante 3D²².
2. Allumez le microscope, la puissance du scanner, l’alimentation laser et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie. Placez la lame μ (préparée précédemment) dans la phase de microscope et faites la mise au point.
3. Trouvez des champs de vision qui contiennent des cellules isolées/qui ne se chevauchent pas (ou du moins qui ne sont pas surpeuplées), afin de faciliter les mesures de croissance lors de l’analyse d’images. Capturez au moins 50 cellules en croissance par échantillon pour permettre une analyse statistique robuste.
4. Sélectionnez l’approche de microscopie à lumière transmise souhaitée. Réduire le temps d’exposition ou la puissance laser et le temps de séjour des pixels et/ou augmenter les diamètres des trous d’épingle, afin de minimiser le photobleachage des cellules fongiques, comme décrit ailleurs ^23,24.
5. Réglez le microscope pour acquérir des images aux intervalles de temps souhaités et commencer l’acquisition de séries chronologiques.
   REMARQUE: Pour corriger la dérive focale au fil du temps (en particulier pour les longues expériences), en raison de la dérive thermique, de la diversité des tailles de cellules et du mouvement des cellules, utilisez une stratégie de mise au point automatique si disponible dans votre logiciel de microscope.

5. Analyse d’images

REMARQUE: Cette section décrit les étapes clés du traitement des images de microscopie time-lapse pour mesurer le taux de croissance d’A. nidulans. L’ouverture, la visualisation et le traitement des images sont réalisés avec le logiciel open source ImageJ/Fiji²⁵.

1. Importez les images aux Fidji à l’aide de Plugins | Bio-Formats | Importateur de bio-formats dans le menu Fidji avec les paramètres par défaut (Figure 4A).
   REMARQUE: Vérifiez si l’importateur de bio-formats reconnaît correctement l’étalonnage de l’image. La dimension de l’image affichée dans la fenêtre d’image du champ d’information supérieur doit être égale aux dimensions de l’image d’origine(Figure 4B). Appuyez sur Maj + P pour afficher et modifier les propriétés de l’image dans le logiciel ImageJ/Fiji.
2. Si nécessaire, utilisez l’histogramme correspondant^{à 26} pour la correction de l’éclairage entre différentes images (Image | Ajuster | | de correction de l’eau de Javel Correspondance de l’histogramme) (Figure 4C).
3. Si nécessaire, utilisez l’algorithme SIFT (Plugins | | d’inscription Alignement linéaire de la pile avec SIFT) pour aligner ou faire correspondre des piles d’images (Figure 4D). Sélectionner "Traduction" dans le menu de transformation attendue devrait suffire à corriger toute dérive x-y.
   REMARQUE: D’autres plugins peuvent également être utilisés pour aligner une pile de tranches d’image, telles que Stabilisateur d’image (https://imagej.net/Image_Stabilizer) ou StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. Sélectionnez les hyphes qui poussent parallèlement au couvercle, en évitant ceux qui sont inclinés. Assurez-vous de sélectionner les hyphes qui se propagent par extension polaire et évitez les hyphes présentant des ramifications latérales et/ ou apicales.
5. Utilisez MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin pour suivre les pointes hyphales en croissance (Figure 4E)²⁷. Pour ajouter une piste, sélectionnez le bouton Ajouter dans la barre d’outils et placez le premier point à une pointe hyphale à l’aide du clic gauche de la souris. La série chronologique passera automatiquement à l’image suivante. Pour terminer le processus de suivi, double-cliquez avec la souris sur le point final (ou appuyez sur la touche Échap) (Figure 4F). Passez à un autre point d’intérêt (c.-à-d. la croissance de la pointe hyphale) dans le laps de temps initial et recommencez la procédure en mesurant le taux de croissance d’un autre hyphe.
   REMARQUE: Pour installer MTrackJ, suivez les instructions présentées à https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. Cliquez sur le bouton Mesure dans la boîte de dialogue MTrackJ (Figure 4G) pour ouvrir la table de sortie. Enregistrer les mesures de piste (Fichier | Enregistrer sous) au format de fichier souhaité (par exemple, csv), analysez-les et tracez-les(Figure 4H).
   REMARQUE: En sélectionnant le bouton Film, un film est produit montrant l’image et la progression du suivi.

Résultats

Suite à ce protocole, nous avons capturé et analysé diverses images correspondant à différents stades de croissance/développement du champignon filamenteux A. nidulans. Les données présentées dans cette étude ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel Fidji. Les mesures ont été enregistrées sous forme de fichiers csv, analysées statistiquement et préparées sous forme de graphiques à l’aide de logiciels statistiques commerciaux et / ou d’un langage de programmation Python utili...

Discussion

La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est une approche puissante pour évaluer le comportement cellulaire en temps réel et déterminer quantitativement et avec précision si un traitement médicamenteux particulier et / ou une intervention génétique entraîne une croissance cellulaire détectable ou des différences phénotypiques au fil du temps.

Dans cette étude, une méthodologie fiable d’imagerie des cellules vivantes a é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4