Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Resumen

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Resumen

Está bien establecido que el crecimiento de colonias de hongos filamentosos, en su mayoría dependiente de cambios en la tasa de crecimiento apical de hifas/micelios, se estima macroscópicamente en medios solidificados comparando el tamaño de la colonia. Sin embargo, medir cuantitativamente la tasa de crecimiento de cepas o cepas de hongos genéticamente diferentes bajo diferentes condiciones ambientales / de crecimiento (pH, temperatura, fuentes de carbono y nitrógeno, antibióticos, etc.) es un desafío. Por lo tanto, la búsqueda de enfoques complementarios para cuantificar la cinética del crecimiento se vuelve obligatoria para comprender mejor el crecimiento de células fúngicas. Además, es bien sabido que los hongos filamentosos, incluido Aspergillus spp., tienen distintos modos de crecimiento y diferenciación en condiciones subaésperas en medios sólidos o cultivos sumergidos. Aquí, detallamos un método microscópico cuantitativo para analizar la cinética de crecimiento del hongo modelo Aspergillus nidulans,utilizando imágenes en vivo tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Capturamos imágenes, analizamos y cuantificamos las tasas de crecimiento de diferentes cepas de hongos de una manera reproducible y confiable utilizando un software libre de código abierto para bio-imágenes (por ejemplo, Fiji), de una manera que no requiere ninguna experiencia previa en análisis de imágenes por parte del usuario.

Introducción

Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos^1,2 y como patógenos de plantas de cultivo^3,insectos plaga⁴ y humanos^3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal⁵. Los hongos filamentosos son organismos altamente polarizados que se alargan a través del suministro continuo de lípidos/proteínas de membrana y la síntesis de novo de la pared celular en la punta extensible⁶. Un papel central en el crecimiento de la punta hifal y el mantenimiento de la polaridad es una estructura especializada llamada 'Spitzenkorper' (SPK), una estructura altamente ordenada que consiste principalmente en componentes citoesqueléticos y la distribución polarizada de los^6,7,8de Golgi.

Los estímulos/señales ambientales, como la interfaz agua-aire, la luz, la concentración de CO₂ y el estado nutricional son responsables de las decisiones de desarrollo tomadas por estos mohos⁹. En cultivos sumergidos (líquidos) se reprime la diferenciación de A. nidulans y se produce el crecimiento por elongación de la punta hifal⁶. Durante el crecimiento vegetativo, las esporas asexuales (conidios) germinan por extensión apical, formando una red indiferenciada de células hifales interconectadas, el micelio, que pueden continuar creciendo indefinidamente mientras los nutrientes y el espacio estén disponibles. Por otro lado, en las puntas hifales de medios sólidos alargadas y después de un período definido de crecimiento vegetativo (competencia del desarrollo), se inicia la reproducción asexual y los tallos de conidióforos aéreos se extienden desde las células especializadas del pie del micelio⁶. Estos dan lugar a estructuras multicelulares de desarrollo especializadas llamadas conidióforos, que producen largas cadenas de conidios haploides¹⁰ que pueden reiniciar el crecimiento en condiciones ambientales favorables.

Un método ampliamente utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos es inocular esporas en agar nutriente contenido en una placa de Petri y medir macroscópicamente el diámetro de la colonia unos días después¹¹. El diámetro/área de la colonia, más dependiente de los cambios en la tasa de crecimiento micelial y menos de la densidad del conidióforo^12,se utiliza entonces como valor de crecimiento. Aunque, medir el tamaño de la población fúngica (colonia) que crece en superficies sólidas es bastante adecuado, de ninguna manera es la medida más precisa del crecimiento. En comparación con los promedios a nivel poblacional (promedios del tamaño de las colonias de hongos), las mediciones de una sola célula pueden capturar la heterogeneidad de una población celular y permitir la identificación de nuevas subpoblaciones de células, estados^13,dinámicas, vías, así como los mecanismos biológicos por los cuales las células responden a los cambios endógenos y ambientales^14,15. El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es posiblemente el enfoque cuantitativo de observación de células individuales más ampliamente empleado.

A continuación, detallamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía polarizada) para capturar imágenes, que independientemente del uso combinado de microscopía de fluorescencia se puede emplear para analizar y cuantificar el crecimiento polar de cepas de A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos.

Protocolo

1. Preparación del inóculo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.

1. Extraer la cepa fúngica de interés, de una cepa de glicerol (-80 °C) utilizando un bucle de inoculación estéril, en placas de medios mínimos (MM) complementadas con los requisitos nutricionales apropiados relevantes para la cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glucosa, 20 ml/L de solución salina (solución salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H₂O, 76 g/L KH₂PO₄, 2,0 mL/L cloroformo) y 1 mL/L oligoelementos (oligoelementos: 40 mg/L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 mg/L CuSO₄, 8 g/L ZnSO₄, 800 mg/L MnSO₄, 800 mg/L FePO₄), ajustar el pH a 6,8 con 1 M NaOH, añadir 1 % (p/v) de agar y los suplementos requeridos como se describe en¹⁶ y autoclave](Figura 1).
   NOTA: La solución de sal, la solución de oligoelementos y los suplementos se esterilizan en autoclave.
2. Incubar durante 2-3 días a 37 °C.
3. Use un palillo de dientes estéril (o un lazo de inoculación), transfiera un pequeño número de conidios, tocando suavemente una sola colonia, a placas de medios completos (CM) [CM: 10.0 g / L de glucosa, 2.0 g / L de peptona, 1.0 g / L de extracto de levadura, 1.0 g / L de casaminoácidos, 20 ml / L de solución salina, 1 ml / L de oligoelementos, 5 ml / L de solución de vitaminas (solución de vitaminas: 0,1 g/L de riboflavina, 0,1 g/L de nicotinamida, 0,01 g/L de ácido p-amino benzoico, 0,05 g/L de piridoxina HCl, 1,0 mg/L de biotina), ajuste el pH a 6,8 con 1 M de NaOH, agregue 1 % (p/v) de agar y los suplementos requeridos como se describe en¹⁶ y autoclave]. Autoclave y guarde la solución vitamínica en un frasco oscuro a 4 °C.
   NOTA: En caso de que el crecimiento de hongos sea demasiado denso para identificar y aislar colonias individuales, vuelva a rayar en una nueva placa de agar para obtener colonias individuales.
4. Incubar durante 3-4 días a 37 °C.
5. Obtener una suspensión conidial de aproximadamente 2 x 10⁶ células/ml rascando 1 cm de la superficie de una colonia fúngica conidiada cultivada en placas de agar CM, utilizando un palillo estéril (Figura S1).
   NOTA: Cuando sea necesario, cuente los conidios con un hemocitómetro.
6. Cosechar conidios de A. nidulans en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml con 1,0 ml de agua destilada en autoclave que contenga 0,05% (v/v) Tween 80 para reducir el número de grupos de conidios.
   NOTA: Los conidios pueden almacenarse hasta 2-3 semanas a 4 °C sin una pérdida relevante de viabilidad (A. Athanasopoulos y V. Sophianopoulou, datos no publicados). Sin embargo, se recomienda filtrar y/o lavar la suspensión conidial para eliminar las partes micelares y los nutrientes, con el fin de prevenir la hinchazón conidial.

2. Preparación para la obtención de imágenes de hongos filamentosos que crecen en medios de agar (sólidos)

NOTA: Se utiliza una versión modificada del método 'agar invertido^17,18.

1. Inicialmente, puntual 10 μL alícuotas de conidiales vigorosamente vórtices (aproximadamente 2 x 10⁴ células/ml) en varios puntos sobre placas de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM con 1% (p/v) de agar (Figura 2).
   NOTA: Utilizando la versión modificada del "método de agar invertido", es posible obtener imágenes de muestras de hongos durante muchas horas sin efectos nocivos aparentes en las hifas en crecimiento.
2. Incubar el cultivo experimental de acuerdo con la etapa de desarrollo que se pretende investigar.
3. Cortar un bloque de agar de ≈0,8 mm² que contiene la colonia con un bisturí estéril.
   NOTA: Las dimensiones del bloque de agar a cortar dependen de las dimensiones del equipo que se colocará después. En el presente trabajo, se utilizan 8 diapositivas μ (ver más abajo).
4. Invierta y coloque el bloque de agar en un pozo de un μ-slide o similar de 8 cámaras con cubierta adecuada para imágenes en vivo.
   NOTA: En caso de que se utilice la microscopía de luz transmitida en combinación con la microscopía de fluorescencia (etiquetado), el bloque de agar se puede invertir en una gota de medio líquido que contiene el tinte de tinción de células vivas, justo antes de la toma de imágenes.

3. Preparación para la obtención de imágenes de hongos filamentosos que crecen en medio líquido

1. Transferir 10 μL alícuotas de una suspensión conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 10⁴ células/ml) en los pozos de un portaobjetos de 8 pozos μ que contenga 200 μL de MM (líquido) con los suplementos apropiados (ver arriba).
2. Incubar durante el tiempo deseado a la temperatura deseada (Figura 3).
   NOTA: Si se utilizará microscopía de luz transmitida en combinación con microscopía de fluorescencia (etiquetado), los cultivos líquidos tienen la gran ventaja de que se pueden agregar colorantes fluorescentes en cualquier punto de tiempo deseado durante el experimento¹⁹.

4. Captura imágenes

NOTA: La elección del microscopio depende del equipo disponible. En cualquier caso, la configuración del microscopio debe incluir una etapa invertida, una cámara ambiental o al menos una habitación con un control preciso de la temperatura del aire.

1. Precaliente la cámara del microscopio termostatizada a 37 °C (a menos que se indique lo contrario o como adecuada para las especies de hongos utilizadas) para estabilizar la temperatura antes de comenzar. Esta cámara permite la modulación de la temperatura de la óptica del microscopio y la etapa de la muestra durante los experimentos de lapso de tiempo. Tenga en cuenta que las aberraciones ópticas²⁰ se introducen cuando los aceites de inmersión normales (diseñados para su uso a 23 °C) se utilizan a 37 °C o más.
   NOTA: Con un presupuesto ajustado, las cámaras de incubación pueden estar hechas de cartón y material de embalaje aislante²¹ o mediante el uso de una impresora 3D²².
2. Encienda el microscopio, la potencia del escáner, la alimentación del láser y la computadora, y cargue el software de imágenes. Coloque el μ-slide (preparado previamente) en la etapa de microscopio y enfoque.
3. Encuentre campos de visión que contengan celdas aisladas / no superpuestas (o al menos no superpobladas), para facilitar las mediciones de crecimiento durante el análisis de imágenes. Capture al menos 50 células en crecimiento por muestra para permitir un análisis estadístico robusto.
4. Seleccione el enfoque de microscopía de luz transmitida que desee. Reducir el tiempo de exposición o la potencia del láser y el tiempo de permanencia de los píxeles y/o aumentar los diámetros estenopeicos, con el fin de minimizar el fotobleaching de las células fúngicas, como se describe en otra parte ^23,24.
5. Configure el microscopio para adquirir imágenes a intervalos de tiempo deseados e iniciar la adquisición de series de tiempo.
   NOTA: Para corregir la deriva focal a lo largo del tiempo (especialmente para experimentos largos), debido a la deriva térmica, los diversos tamaños de células y el movimiento celular, use una estrategia de enfoque automático si está disponible en su software de microscopio.

5. Análisis de imágenes

NOTA: En esta sección se describen los pasos clave del procesamiento de imágenes de microscopía de lapso de tiempo para medir la tasa de crecimiento de A. nidulans. La apertura, visualización y procesamiento de imágenes se logra con el software de código abierto ImageJ/Fiji²⁵.

1. Importar las imágenes a Fiji usando Plugins | | de bioformaformas Importador de bioformas desde el menú de Fiji con la configuración predeterminada (Figura 4A).
   NOTA: Compruebe si el Importador de Bioformaformas reconoce correctamente la calibración de la imagen. La dimensión de la imagen que se muestra en la ventana de imagen del campo de información superior debe ser igual a las dimensiones de la imagen original (Figura 4B). Presione Mayús + P para mostrar y cambiar las propiedades de la imagen en el software ImageJ/Fiji.
2. Cuando sea necesario, utilice el histograma que coincida^{con 26} para la corrección de la iluminación entre diferentes fotogramas(Imagen | Ajustar | | de corrección de lejía Coincidencia de histogramas) (Figura 4C).
3. Cuando sea necesario, utilice el algoritmo SIFT(Plugins | | de registro Alineación lineal de la pila con SIFT) para alinear o hacer coincidir pilas de imágenes (Figura 4D). Seleccionar "Traducción" en el menú de transformación esperado debería ser suficiente para corregir cualquier deriva x-y.
   NOTA: También se pueden usar otros complementos para alinear una pila de segmentos de imagen, como Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) o StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. Seleccione hifas que crezcan paralelas a las cubiertas, evitando las que están inclinadas. Asegúrese de seleccionar las hifas que se propagan por extensión polar y evite que las hifas presenten ramificaciones laterales y / o apicales.
5. Utilice MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin para rastrear el crecimiento de puntas de hifal (Figura 4E)²⁷. Para agregar una pista, seleccione el botón Agregar en la barra de herramientas y coloque el primer punto en una punta hifal con el clic izquierdo del mouse. La serie temporal se moverá automáticamente al siguiente fotograma. Para completar el proceso de seguimiento, haga doble clic con el ratón en el punto final (o pulse la tecla Esc) (Figura 4F). Muévase a otro punto de interés (es decir, la punta hifal creciente) en el marco de tiempo inicial y reinicie el procedimiento midiendo la tasa de crecimiento de otra hifa.
   NOTA: Para instalar MTrackJ siga las instrucciones presentadas en https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. Haga clic en el botón Medir en el cuadro de diálogo MTrackJ(Figura 4G)para abrir la tabla de salida. Guardar mediciones de seguimiento (Archivo | Guardar como) en el formato de archivo deseado (por ejemplo, csv), analizarlos y trazarlos (Figura 4H).
   NOTA: Al seleccionar el botón Película, se produce una película que muestra la imagen y la progresión de la pista.

Resultados

Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento/desarrollo del hongo filamentoso A. nidulans. Los datos presentados en este estudio se procesaron y analizaron utilizando el software de Fiji. Las mediciones se guardaron como archivos csv, se analizaron estadísticamente y se prepararon como gráficos utilizando software estadístico comercial y / o lenguaje de programación Python utilizando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsm...

Discusión

El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es un enfoque poderoso para evaluar el comportamiento celular en tiempo real y determinar cuantitativa y precisamente si un tratamiento farmacológico en particular y / o intervención genética da como resultado un crecimiento celular detectable o diferencias fenotípicas a lo largo del tiempo.

En este estudio, se describió una metodología confiable de imágenes de células vivas para medir y a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4