Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Resumen

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Resumen

Está bien establecido que el crecimiento de colonias de hongos filamentosos, en su mayoría dependiente de cambios en la tasa de crecimiento apical de hifas/micelios, se estima macroscópicamente en medios solidificados comparando el tamaño de la colonia. Sin embargo, medir cuantitativamente la tasa de crecimiento de cepas o cepas de hongos genéticamente diferentes bajo diferentes condiciones ambientales / de crecimiento (pH, temperatura, fuentes de carbono y nitrógeno, antibióticos, etc.) es un desafío. Por lo tanto, la búsqueda de enfoques complementarios para cuantificar la cinética del crecimiento se vuelve obligatoria para comprender mejor el crecimiento de células fúngicas. Además, es bien sabido que los hongos filamentosos, incluido Aspergillus spp., tienen distintos modos de crecimiento y diferenciación en condiciones subaésperas en medios sólidos o cultivos sumergidos. Aquí, detallamos un método microscópico cuantitativo para analizar la cinética de crecimiento del hongo modelo Aspergillus nidulans,utilizando imágenes en vivo tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Capturamos imágenes, analizamos y cuantificamos las tasas de crecimiento de diferentes cepas de hongos de una manera reproducible y confiable utilizando un software libre de código abierto para bio-imágenes (por ejemplo, Fiji), de una manera que no requiere ninguna experiencia previa en análisis de imágenes por parte del usuario.

Introducción

Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos^1,2 y como patógenos de plantas de cultivo^3,insectos plaga⁴ y humanos^3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal^5<....

Protocolo

1. Preparación del inóculo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.

1. Extraer la cepa fúngica de interés, de una cepa de glicerol (-80 °C) utilizando un bucle de inoculación estéril, en placas de medios mínimos (MM) complementadas con los requisitos nutricionales apropiados relevantes para la cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glucosa, 20 ml/L de solución salina (solución salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H₂O, 76 g/L KH₂PO₄, 2,0 mL/L cloroformo) y 1 mL/L oligoelementos (oligoelementos: 40 mg/L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 mg/L....

Resultados

Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento/desarrollo del hongo filamentoso A. nidulans. Los datos presentados en este estudio se procesaron y analizaron utilizando el software de Fiji. Las mediciones se guardaron como archivos csv, se analizaron estadísticamente y se prepararon como gráficos utilizando software estadístico comercial y / o lenguaje de programación Python utilizando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsm.......

Discusión

El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es un enfoque poderoso para evaluar el comportamiento celular en tiempo real y determinar cuantitativa y precisamente si un tratamiento farmacológico en particular y / o intervención genética da como resultado un crecimiento celular detectable o diferencias fenotípicas a lo largo del tiempo.

En este estudio, se describió una metodología confiable de imágenes de células vivas para medir y a.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4