Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом

Резюме

Мы представляем протокол визуализации в реальном времени без меток, использующий методы микроскопии пропускаемого света для захвата изображений, анализа и количественной оценки кинетики роста нитевидного гриба A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Этот протокол может использоваться в сочетании с флуоресцентной микроскопией.

Аннотация

Хорошо известно, что рост колонии нитевидных грибов, в основном зависящий от изменений скорости роста гиф/мицелия, макроскопически оценивается на затверделых средах путем сравнения размеров колоний. Однако количественно измерить скорость роста генетически различных грибковых штаммов или штаммов в различных условиях окружающей среды / роста (рН, температура, источники углерода и азота, антибиотики и т. Д.) Является сложной задачей. Таким образом, стремление к комплементарным подходам к количественной оценке кинетики роста становится обязательным, чтобы лучше понять рост грибковых клеток. Кроме того, хорошо известно, что нитевидные грибы, включая Aspergillus spp., имеют различные способы роста и дифференциации в субвоздушных условиях на твердых средах или погруженных культурах. Здесь мы подробно описываем количественный микроскопический метод анализа кинетики роста модельного гриба Aspergillus nidulans,используя живую визуализацию как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Мы захватываем изображения, анализируем и количественно определяем темпы роста различных штаммов грибов воспроизводимым и надежным способом, используя бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для биоизобликов (например, Фиджи), таким образом, чтобы не требовал от пользователя какого-либо предварительного опыта анализа изображений.

Введение

Нитевидные грибы имеют большое социально-экономическое и экологическое значение, будучи как промышленными/сельскохозяйственными инструментами для производства ферментов и^{антибиотиков 1,2,} так и патогенами сельскохозяйственных растений^3,насекомых-вредителей⁴ и человека^3. Кроме того, нитевидные грибы, такие как Aspergillus nidulans, широко используются в качестве модельных организмов для фундаментальных исследований, таких как исследования в области генетики, клеточной и эволюционной биологии, а также для изучения гифально....

протокол

1. Приготовление инокулятов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться под ламинарной проточной шкафом.

1. Вывод интересующих грибкового штамма из запаса глицерина (-80 °C) с использованием стерильной петли инокуляции на пластины с минимальной средой (MM), дополненной соответствующими требованиями к питанию, относящимися к исследуемому штамму [MM: 10,0 г / л глюкозы, 20 мл / л раствора соли (раствор соли: 26 г / л KCl, 26 г / л MgSO₄· 7H₂O, 76 г/л KH₂PO₄, 2,0 мл/л хлороформа) и 1 мл/л микроэлементов (микроэлементы: 40 мг/л Na₂B₄O₇· H_2O,400 мг/л CuS....

Результаты

Следуя этому протоколу, мы захватили и проанализировали различные изображения, соответствующие различным стадиям роста/развития нителезного гриба A. nidulans. Данные, представленные в этом исследовании, были обработаны и проанализированы с использованием программного обеспечения Fij.......

Обсуждение

Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии является мощным подходом к оценке клеточного поведения в режиме реального времени и количественно и точно определить, приводит ли конкретное лекарственное лечение и / или генетическое вмешательство к обна?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4