ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח

Summary

אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Abstract

זה מבוסס היטב כי צמיחת המושבה של פטריות חוטים, תלוי בעיקר בשינויים בהייפאה / תפטירי שיעור הצמיחה apical, מוערך מקרוסקופית על מדיה מוצקה על ידי השוואת גודל המושבה. עם זאת, כדי למדוד כמותית את קצב הצמיחה של זנים פטרייתיים שונים מבחינה גנטית או זנים בתנאי סביבה / צמיחה שונים (pH, טמפרטורה, פחמן ומקורות חנקן, אנטיביוטיקה, וכו ') הוא מאתגר. לכן, המרדף אחר גישות משלימות לכמת קינטיקה צמיחה הופך חובה על מנת להבין טוב יותר את צמיחת התא הפטרייתי. יתר על כן, ידוע כי פטריות חוטיות, כולל אספרגילוס spp., יש מצבים ברורים של צמיחה ובידול בתנאים תת-אוויריים על מדיה מוצקה או תרבויות שקועות. כאן, אנו מפרטים שיטה מיקרוסקופית כמותית לניתוח קינטיקה צמיחה של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות הדמיה חיה הן תרבויות שקועות ומדיה מוצקה. אנו לוכדים תמונות, מנתחים וכימתים שיעורי גדילה של זנים פטרייתיים שונים באופן ניתן לשחזור ואמין באמצעות קוד פתוח, תוכנה חופשית לביו-תמונות (למשל, פיג'י), באופן שאינו דורש מומחיות קודמת בניתוח תמונה מהמשתמש.

Introduction

פטריות סיבים הן בעלי חשיבות חברתית-כלכלית ואקולוגית רבה, הן חיוניות ככלים תעשייתיים / חקלאיים לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה^1,2 והן כפתוגנים של צמחי^{יבול 3}, חרקי מזיקים⁴ ובני אדם³. יתר על כן, פטריות חוטיות כגון אספרגילוס nidulans נמצאים בשימוש נרחב כמו אורגניזמים מודל למחקר בסיסי, כגון מחקרים בגנטיקה, תאים וביולוגיה אבולוציונית, כמו גם לחקר הרחבת hyphal⁵. פטריות חוטיות הן אורגניזמים מקוטבים מאוד המאריכים דרך האספקה המתמשכת של שומנים / חלבונים ממברנה ואת סינתזת דה נובו של דופן התא בקצה המאריך⁶. תפקיד מרכזי בצמיחת קצה ההיפהל ותחזוקת הקוטביות הוא מבנה מיוחד בשם 'Spitzenkorper' (SPK), מבנה מסודר מאוד המורכב בעיקר מרכיבי שלד והתפלגות מקוטבת של Golgi^6,7,8.

גירויים / אותות סביבתיים, ממשק אוויר מים כגון, אור, ריכוז CO_2, ואת המצב התזונתי אחראים על ההחלטות ההתפתחותיות שנעשו על ידי תבניות אלה⁹. בתרבויות שקועות (נוזליות) הבידול של A. nidulans מודחק והצמיחה מתרחשת על ידי התארכות טיפ היפלה⁶. במהלך צמיחה וגטטיבית, נבגים א-מיניים (conidia) לנבוט על ידי הרחבה apical, יצירת רשת לא מופרעת של תאים היפל מחוברים, תפטיר, אשר עשוי להמשיך לגדול ללא הגבלת זמן כל עוד חומרים מזינים ומרחב זמינים. מצד שני, על טיפים היפל מדיה מוצק להאריך ולאחר תקופה מוגדרת של צמיחה וגטטיבית (יכולת התפתחותית), רבייה א-מינית הוא יזם וגבעולי conidiophore אוויר להרחיב מתאי רגל מיוחדים של תפטיר⁶. אלה מעוררים מבנים רב תאיים התפתחותיים מיוחדים הנקראים conidiophores, המייצרים שרשראות ארוכות של conidia הפלואיד¹⁰ שיכולים להתחיל מחדש את הצמיחה בתנאים סביבתיים נוחים.

שיטה נפוצה למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא לחסן נבגים על אגר מיזיני הכלול בצלחת פטרי ולמדוד באופן מקרוסקופי את קוטר המושבה כמה ימים לאחר^{מכן 11}. הקוטר / אזור של המושבה, התלוי ביותר בשינויים בקצב הצמיחה שלי ושל תריסתיים ופחות בצפיפות conidiophore¹², משמש לאחר מכן כערך של צמיחה. אמנם, מדידת גודל האוכלוסייה הפטרייתית (מושבה) גדל על משטחים מוצקים הוא די הולם, זה בשום אופן לא המדד המדויק ביותר של צמיחה. בהשוואה לממוצעי רמת האוכלוסייה (ממוצעים של גודל מושבה פטרייתית), מדידות תאים בודדים יכולות ללכוד את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים ולאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות חדשניות של תאים, מדינות¹³, דינמיקה, מסלולים כמו גם המנגנונים הביולוגיים שבאמצעותם תאים מגיבים לשינויים אנדוגניים וסביבתיים^14,15. ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות היא ללא ספק הגישה התצפית כמותית של תא יחיד המועסק ביותר.

להלן, אנו מפרטים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות (כגון ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופיה מקוטבת) כדי ללכוד תמונות, אשר ללא תלות בשימוש המשולב במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות ניתן להשתמש כדי לנתח ולכמת את הצמיחה הקוטבית של זני A. nidulans הן בתרבויות שקועות והן במדיה מוצקה.

Protocol

1. הכנה לאנוקולום

הערה: כל השלבים צריכים להתבצע תחת ארון זרימה למינארי.

1. פס החוצה זן פטרייתי של עניין, ממלאי גליצל (-80 °C) באמצעות לולאת חיסון סטרילית, על לוחות של מדיה מינימלית (MM) בתוספת הדרישות התזונתיות המתאימות הרלוונטיות לזן שנבדק [MM: 10.0 גרם / L גלוקוז, פתרון מלח 20 מ"ל / ליטר (פתרון מלח: 26 גרם / L KCl, 26 גרם / L MgSO₄·7H₂O, 76 גרם/ ליטר KH₂PO₄, 2.0 מ"ל / L כלורופורם) ו 1 mL / L יסודות קורט (יסודות קורט: 40 מ"ג / L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 מ"ג /L CuSO₄, 8 גרם / L ZnSO₄, 800 מ"ג / L MnSO₄, 800 מ"ג / L FePO₄), להתאים את ה- pH ל 6.8 עם 1 M NaOH, להוסיף 1 % (w / v) אגר ואת התוספים הנדרשים כמתואר¹⁶ ו autoclave] (איור 1).
   הערה: פתרון מלח, פתרון יסודות קורט ותוספי מזון הם autoclaved.
2. דגירה במשך 2-3 ימים ב 37 °C (50 °F).
3. השתמש קיסם סטרילי (או לולאת חיסון), להעביר מספר קטן של conidia, על ידי נגיעה עדינה מושבה אחת, לצלחות של מדיה מלאה (CM) [CM: 10.0 גרם / L גלוקוז, 2.0 גרם / L פפטון, 1.0 גרם / L תמצית שמרים, 1.0 גרם / L חומצות casamino, 20 mL / L פתרון מלח, 1 mL / L אלמנטים קורט, 5 mL / L פתרון ויטמין (פתרון ויטמין: 0.1 גרם/ליטר ריבופלבין, 0.1 גרם/ל' ניקוטינאמיד, 0.01 גרם/ליטר חומצה בנזואית, 0.05 גרם/ליטר פירידוקסין HCl, 1.0 מ"ג/ל' ביוטין), כווננו את רמת החומציות ל-6.8 עם 1 M NaOH, הוסיפו 1 % (w/v) אגר והתוספים הנדרשים כמתואר^ב-16 ובאוטופלבה]. יש לאחסן אוטומטית את תמיסה ויטמין בבקבוק כהה ב 4 °C (7 °F).
   הערה: במקרה שצמיחה פטרייתית צפופה מכדי לזהות ולבודד מושבות בודדות, יש להתייצב מחדש על צלחת אגר חדשה כדי להשיג מושבות בודדות.
4. דגירה במשך 3-4 ימים ב 37 °C (50 °F).
5. השג השעיה קונדיאלית של כ 2 x 10⁶ תאים / מ"ל על ידי גירוד 1 ס"מ מפני השטח של מושבה פטרייתית conidiated גדל על לוחות אגר CM, באמצעות קיסם סטרילי(איור S1).
   הערה: בעת הצורך, לספור conidia עם hemocytometer.
6. קונדיה קציר של A. nidulans בצינור צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל עם 1.0 מ"ל של מים מזוקקים אוטומטית המכילים 0.05% (v / v) Tween 80 להפחתת מספר גושי conidia.
   הערה: Conidia ניתן לאחסן עד 2-3 שבועות ב 4 °C (4 °C) ללא אובדן רלוונטי של הכדאיות (א. אתנסופולוס ו V. Sophianopoulou, נתונים שלא פורסמו). עם זאת, מומלץ לסנן ו/או לשטוף השעיה conidial כדי להסיר חלקים תפטירי וחומרים מזינים, על מנת למנוע נפיחות conidial.

2. הכנה להדמיה פטריות חוטיות הגדלות על מדיומים אגר (מוצקים)

הערה: נעשה שימוש בגירסה שונה של שיטת אגר^{הפוכה 17,18.}

1. בתחילה, לזהות 10 עליקוטים μL של חבית מערבולת נמרצת (כ 2 x 10⁴ תאים / מ"ל) בכמה נקודות על מנות פטרי (Ø9 ס"מ) 15 מ"ל של MM עם 1% (w / v) אגר (איור 2).
   הערה: באמצעות הגירסה שהשתנתה של 'שיטת אגר הפוכה', ניתן לדמיין דוגמאות פטרייתיות במשך שעות רבות ללא השפעות מזיקות לכאורה על hyphae גדל.
2. לדגור על התרבות הניסיונית על פי השלב ההתפתחותי שנועד להיחקר.
3. פורסים גוש אגר^≈0.8 מ"מ המכיל את המושבה באמצעות אזמל סטרילי.
   הערה: הממדים של בלוק אגר שיש לפרוס תלויים בממדי הציוד שיוצב לאחר מכן. בעבודה הנוכחית, נעשה שימוש ב-8 שקופיות μ היטב (ראה להלן).
4. הפוך והנח את בלוק אגר לתוך באר של שקופית μ או 8 שעון כיסוי תא דומה עם כיסוי מתאים הדמיה חיה.
   הערה: במקרה מיקרוסקופיית אור מועברת תשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (תיוג), בלוק אגר יכול להיות הפוך על טיפה של מדיום נוזלי המכיל את צבע הכתמת התא החי, ממש לפני הדמיה.

3. הכנה להדמיה פטריות חוטיות הגדלות על מדיום נוזלי

1. העבר 10 עליקוטים μL של השעיה conidexed נמרץ (כ 2 x 10⁴ תאים / מ"ל) בבארות של 8 μ שקופית המכילה 200 μL של MM (נוזלי) עם התוספים המתאימים (ראה לעיל).
2. דגירה לזמן הרצוי בטמפרטורה הרצויה (איור 3).
   הערה: אם מיקרוסקופיית אור מועברת תשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (תיוג), לתרבויות נוזליות יש את היתרון הגדול שניתן להוסיף צבעים פלואורסצנטיים בכל נקודת זמן רצויה במהלך הניסוי¹⁹.

4. לכידת תמונות

הערה: הבחירה במיקרוסקופ תלויה בציוד הזמין. בכל מקרה הגדרת המיקרוסקופ צריכה לכלול שלב הפוך, תא סביבתי או לפחות חדר עם בקרת טמפרטורת אוויר מדויקת.

1. מחממים מראש את תא המיקרוסקופ התרמוסטטי ב-37 מעלות צלזיוס (אלא אם כן צוין אחרת או מתאים למינים הפטרייתיים המשמשים) כדי לייצב את הטמפרטורה לפני תחילתה. תא זה מאפשר אפנון טמפרטורה של אופטיקה מיקרוסקופית ושלב מדגם במהלך ניסויים בזמן לשגות. שים לב כי סטיות אופטיות²⁰ מוצגים כאשר שמנים רגילים טבילה (מיועד לשימוש ב 23 °C (7 °F) שמנים משמשים ב 37 °C (50 °F) ומעלה.
   הערה: בתקציב מצומצם, תאי דגירה יכולים להיות עשויים מקרטון ומבודד חומר אריזה²¹ או באמצעות מדפסת תלת-ממד²².
2. הפעל את המיקרוסקופ, את כוח הסורק, את כוח הלייזר והמחשב, וטען את תוכנת ההדמיה. מקם את שקופית μ (שהוכנה קודם לכן) בשלב המיקרוסקופ ובמוקד.
3. מצא שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים/לא חופפים (או לפחות לא צפופים), כדי להקל על מדידות צמיחה במהלך ניתוח תמונה. לכוד לפחות 50 תאים גדלים לכל מדגם כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק.
4. בחר את הגישה הרצויה למיקרוסקופיית אור. צמצם את זמן החשיפה או את כוח הלייזר ואת זמן השתהות הפיקסלים ו/או הגדל את קטרי חור הסיכה, על מנת למזער את ההלבנה של תאים פטרייתיים, כמתואר במקומות אחרים ^23,24.
5. הגדר מיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות במרווחי זמן רצויים ורכישת סדרת זמן התחלה.
   הערה: כדי לתקן את הסחף המוקד לאורך זמן (במיוחד עבור ניסויים ארוכים), עקב סחיפה תרמית, גדלי תאים מגוונים ותנועה סלולרית השתמש באסטרטגיית מיקוד אוטומטי אם זמין בתוכנת המיקרוסקופ שלך.

5. ניתוח תמונה

הערה: סעיף זה מתאר את השלבים העיקריים של עיבוד תמונות מיקרוסקופיות בזמן לשגות למדידת קצב הצמיחה של A. nidulans. פתיחה, תצוגה חזותית ועיבוד של תמונות מתבצע עם תוכנת ImageJ / פיג'י בקוד פתוח²⁵.

1. יבא את התמונות לפיג'י באמצעות תוספים | ביו-פורמטים | יבואן ביו-פורמטים מתפריט פיג'י עם הגדרות ברירת מחדל(איור 4A).
   הערה: בדוק אם יבואן Bio-Formats מזהה כראוי את כיול התמונה. ממד התמונה המוצג בחלון תמונת שדה המידע העליון חייב להיות שווה למידות התמונה המקוריות (איור 4B). הקש Shift + P כדי להציג ולשנות מאפייני תמונה בתוכנת ImageJ/Fiji.
2. במידת הצורך, השתמש בהיסטוגרמה התואמת²⁶ לתיקון תאורה בין מסגרות שונות(תמונה | כוונון | | תיקון אקונומיקה התאמת היסטוגרמה) (איור 4C).
3. במידת הצורך, השתמש באלגוריתם SIFT (תוספים | | רישום יישור מחסנית ליניארית עם SIFT) ליישור או התאמת ערימות תמונות(איור 4D). בחירת "תרגום" מתפריט ההמרה הצפוי צריכה להספיק כדי לתקן כל סחיפה x-y.
   הערה: ניתן להשתמש בתוספים אחרים גם כדי ליישר ערימה של פרוסות תמונה, כגון מייצב תמונה (https://imagej.net/Image_Stabilizer) או StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. בחר hyphae שגדל במקביל כיסוי, הימנעות אלה מוטה. הקפידו לבחור hyphae המתפשטים על ידי הרחבת קוטב ולהימנע hyphae הצגת הסתעפות לרוחב ו / או apical.
5. השתמש ב- MTrackJ (תוספים | MTrackJ) תוסף כדי לעקוב אחר טיפים hyphal גדל (איור 4E)²⁷. כדי להוסיף רצועה, בחר בלחצן הוסף בסרגל הכלים ומקם את הנקודה הראשונה בעצה היפל בלחיצה הימנית של העכבר. סידרת הזמן תעבור באופן אוטומטי למסגרת הבאה. כדי להשלים את תהליך המעקב, לחץ פעמיים על העכבר בנקודה הסופית (או הקש על מקש Esc) (איור 4F). עבור לנקודת עניין אחרת (כלומר, טיפ היפל גדל) במסגרת הזמן הראשונית ולהפעיל מחדש את ההליך על ידי מדידת קצב הצמיחה של hypha אחר.
   הערה: כדי להתקין MTrackJ בצע את ההוראות המוצגות ב- https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. לחץ על לחצן מדידה בתיבת הדו-שיח MTrackJ (איור 4G) כדי לפתוח את טבלת הפלט. שמירת מידות רצועה(קובץ | שמור בשם) בתבנית הקובץ הרצויה (למשל, csv), נתח והתווה אותם (איור 4H).
   הערה: על-ידי בחירת לחצן 'סרט', נוצר סרט המציג את התמונה ומעקוב אחר ההתקדמות.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, תפסנו וניתחנו תמונות שונות המתאימות לשלבי צמיחה / התפתחות שונים של הפטרייה הסיבית A. nidulans. הנתונים שהוצגו במחקר זה עובדו ונותחו באמצעות תוכנת פיג'י. המדידות נשמרו כקבצי csv, נותחו סטטיסטית והוכנו כגרפים באמצעות תוכנה סטטיסטית מסחרית ו/או שפת תכנות פייתון באמצעות ספר?...

Discussion

ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה בזמן לשגות היא גישה רבת עוצמה כדי להעריך את ההתנהגות התאית בזמן אמת וכמותית ומדויקת לקבוע אם טיפול תרופתי מסוים ו/או התערבות גנטית גורמים לצמיחת תאים הניתנים לזיהוי או הבדלים פנוטיפיים לאורך זמן.

במחקר זה תוארה מתודולוג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Imaging slides
4-Aminobenzoic acid	Merck	A9878
azhAΔ ngnAΔ			Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids	Gibco	223030
Biotin	Merck	B4639
Chloroform	Merck	67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate	Merck	C8027
Glucose	Merck	G8270
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Statistical Software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software
Inoculating Loop	Merck	I8263-500EA
Iron(III) phosphate	Merck	1.03935
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	63138
Manganese(II) sulfate monohydrate	Merck	M7899
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)	Supelco	47865-U
Peptone	Millipore	68971
Petri Dishes for Microbiology Culture	KISKER	G090
Potassium chloride	Merck	P4504
Potassium phosphate monobasic	Merck	P5655
Pyridoxine hydrochloride	Merck	P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile	KISKER	G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile	KISKER	G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL	KISKER	VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL	KISKER	VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear	KISKER	GC.TIPS.B
Riboflavin (B2)	Supelco	47861
Scalpel blades NO. 11	OdontoMed2011	S2771
Sodium chloride	Merck	S7653
Sodium hydroxide	Merck	S8045
Sodium tetraborate decahydrate	Merck	S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP)			Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT			Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract	Millipore	70161
ZnSO4