通过在线生长测量和可定制的光照模式操作实验室光生物反应器

摘要

本出版物描述了具有可定制光照状态的实验室光生物反应器（PBR）的设计。使用碳酸氢盐作为其碳源的蓝藻或微藻的生长通过测量体积氧气产生来连续监测。这些PBR有助于快速，重复的实验室生长比较，在实验过程中几乎没有用户干预。

摘要

微藻的实验室研究在实验上可能具有挑战性。除了非光合微生物的培养要求外，光养生物还需要照明。通常，研究人员寻求提供定制的光供应，即改变其传递的光强度和时间。这种灵活性对于标准台式灯来说是困难的。通常，栽培研究还需要在实验处理之间进行生长比较。通常，在较长的持续时间内评估生长，例如，在为期一周的试验中每天多次。手动测量可能非常耗时且缺乏数据分辨率。因此，具有自动生长监测和可定制光源的光生物反应器（PBR）对于多次处理的重复实验非常有用。目前的工作介绍了实验室PBR的设计，建造和操作。这些材料易于采购且相对便宜。该设计可以用适度的技巧复制。每个结构的占地面积约为40 cm²，并装有三个1 L玻璃瓶，用于一式三份复制。瓶子放在装有磁力搅拌器的平台上，垂直排列在1米高，直径15厘米的聚氯乙烯（PVC）管内。管道内部衬有发光二极管 （LED）。这些 LED 产生 0–2400 μmol 光子 ^{m-2 s-1} 光合作用有效辐射 （PAR） 的连续光强度。用户设计自定义照明方案。光强度可以每秒调整一次，也可以保持恒定更长时间。光合作用产生的氧气通过单向体积气体传感器排出每个瓶子。软件用于记录气体传感器数据。产生的氧气量可以与生物质生长相关。如果需要生物质样品，可以使用注射器提取培养物。该方法适用于以碳酸氢盐为碳源生长的微藻。这些PBR对于需要重复实验，光态灵活性和连续高分辨率生长数据的实验室很有价值。

引言

微藻和蓝藻，为了简单起见统称为微藻，因其在可持续生物技术中的潜力而受到拥护。它们是有吸引力的候选者，因为它们的快速增长，在非耕地上耕种的能力，以及它们利用阳光来驱动二氧化碳转化为生物质^1，2，3。微藻生物质可以转化为产品，例如石油或天然气形式的生物能源，食品染料和营养补充剂，以及生物聚合物^1，4，^5，6，7等材料。此外，它们还可用于处理废水或通过消耗过量的营养物质来修复水体^8，9。鉴于此，微藻研究是广泛和成熟的。随着社会重新考虑当前制造和能源生产方法的碳强度和环境可持续性，该领域也在不断发展。

基于实验室的微藻研究的三个基本要求是培养容器、光源和量化生长的方法。术语光生物反应器（PBR）描述了一种将培养容器照亮¹⁰的设置。通常，微藻的研究旨在比较两种或多种处理之间的生长，例如，不同的生长培养基，光照状态或物种^11，12，13。为了统计相关性，应重复每种情况，例如治疗和控制。如果对照和处理同时进行，这意味着在实验期间必须对许多PBR进行监测和采样。操作多个PBR的挑战是双重的。首先，为每个PBR提供均匀的光强度对于再现性至关重要，但可能很困难。入射到容器表面的光量受其与光源的距离、来自相邻容器的阴影和背景光波动的影响¹⁴。其次，必须选择一种准确量化增长的方法。

生长通常通过细胞计数，光密度（OD），叶绿素A含量，干重（DW）密度和无灰干重（AFDW）密度¹⁵来测量。细胞计数、叶绿素 A 含量和重量法是生成离散数据点的手动过程。可以使用分光光度计连续无创地测量OD，前提是它根据另一种方法（例如AFDW密度¹⁵）进行了良好的校准。然而，OD测量值和叶绿素A含量可能不可靠，因为结果在不同培养条件下有所不同，例如，物种之间和整个生长周期^15，16。对于叶绿素A，提取方法也会影响色素收率¹⁷。叶绿素A含量在追踪微生物群落内微藻的生长特别有用，其中也含有非光合生物^17，18。在选择确定生长的方法时，必须考虑悬浮液的形态。当生物体聚集并且没有很好地混合时，OD和细胞计数是不可能的¹⁵。单一方法并不适合所有实验应用 - 研究人员必须决定哪些方法是实用的并且与其实验目标相关。

AFDW是一种可靠的方法，可以在各种培养条件之间进行生长比较，特别是物种和培养基之间的生长比较^15，19，20。为了计算AFDW，首先通过过滤或离心浓缩微藻培养物样品，然后干燥。在此阶段，可以确定 DW。通常，DW样品含有至少8-10%的灰无机材料，如盐和颗粒物¹⁵。DW跟踪增长趋势，但如果无机物的贡献发生变化，则可能会扭曲。为了确定AFDW密度，干燥的生物质在高温下燃烧;这蒸发了有机或有用的部分，同时留下了灰烬（无机物）¹⁹。为了计算 AFDW，从 DW 分数中减去灰分的权重。通常，在微藻悬浮液中，AFDW的范围为0.1-3 g / L^12，21，22。少量稀释悬浮液产生很少的干生物质，<10毫克。燃烧后，灰分可能仅重1毫克。因此，根据培养密度，该方法需要5-100 mL之间的体积，分析刻度精确到0.1 mg^{，12，15，19，22}。实验室PBR通常很小，最多几升，因此每个液体样品都会耗尽培养体积。此外，AFDW方法是手动的，需要2-3天。对于重复和重复的实验，自动化和连续的过程是优选的。

对于使用碳酸氢盐作为碳源的微藻，可以连续测量两个额外的生长指标。光合作用消耗碳酸氢盐并产生氧气。碳酸氢盐的消耗量可提高中等pH^值23。浸入式pH电极可以测量这种变化。光合氧产生增加介质的溶解氧（DO）浓度，直到介质饱和。超过饱和度，氧气以气泡的形式存在。制氧量通过许多不同的技术进行测量:探头测量溶解氧浓度，测压装置评估顶空压力，气相色谱法测量顶空成分，体积传感器记录气体流出^{量24，25，26，27}。当氧气用作生长代用物时，培养容器必须完全密封或仅允许气体流出。对于pH和氧气测量，碳必须以碳酸氢盐的形式提供，而不是通过CO₂ 喷射。CO₂ 喷射会降低介质 pH^{值 23} ，并且作为气体会干扰氧气测量。与光密度相比，pH和氧气的一个优点是，如果微藻形成团块，则该方法不会受到影响。虽然是间接的，但pH值和氧气在比较治疗之间的生长方面都是有效的。

目前使用的PBR的复杂性各不相同。实验室可以使用简单的台式烧瓶、定制原型或市售产品。对于寻求从烧瓶升级的研究小组来说，商业PBR的成本或构建许多原型所需的技术技能和零件制造可能是一个障碍。本手稿旨在描述弥合这一差距的实验室PBR的逐步设计，构建和操作。这些PBR具有可定制的光照状态，并通过记录体积氧气产生来连续监测生长。该设计包含三个用于一式三份复制的培养容器，并且可以使用适度的技能和易于获取的材料进行构建。这种PBR是实验室的宝贵补充，希望在不投资技术性或昂贵产品的情况下扩大其微藻研究能力。在选择购买或构建PBR时，研究人员必须考虑设计是否适合其文化条件，财务状况和研究问题。

研究方案

1. 铂族橡胶展台的建设

1. 使用手持式钢锯，切割五个380毫米长度和两个200毫米长度的弯槽钢。用螺栓和大角支架固定在一起，制成支架底座（图1A）。在安全端盖上胶水。
2. 将两个垂直长度的弯槽钢连接到底座。用螺栓和金属角撑板固定（图1B）。在安全端盖上胶水。
3. 切割四个 65 mm 平长的开槽钢。以 90° 角将其固定到垂直支撑上 - 将两个支撑连接到每个支架上，一个从底座向上 130 mm（图 1C），一个从顶部向下 60 mm。
4. 将垂直支撑固定在其顶部，将长度为140 mm的水平平开槽钢（横梁）用螺栓固定在框架的背面（图2A）。

2. 光室的建造

1. 将直径为 153 mm 的白色聚氯乙烯 （PVC） 管切割成 1070 mm 的长度。用带锯将管道纵向切成两半。打磨所有边缘。
2. 均匀地空间和中心四个铝制散热器通道垂直于管道内部。请勿连接距离管道切割边缘 20 mm 以内的通道。使用小螺栓，将通道固定在其顶部和底部（图2B）。
3. 将管道的一半用螺栓固定到支架上，使用在步骤1.3中成型的水平支撑。
4. 放下反应堆，并通过将它们粘在一起来重新连接管道的一半。钢琴铰链沿一条切口线居中。跟踪铰链孔并相应地钻探管道。使用铆钉枪和中等长度的铆钉将铰链固定在管道上。
5. 使用一根小蹦极绳（参见 材料表）将管道固定（图1C）。
6. 请咨询电工以连接 LED 灯并安装以下四个组件:LED 驱动器、数字多路复用 （DMX） 解码器、DMX 照明控制器和开关盒（请参见 材料表）。根据 图2A将所有组件固定在PBR的背面。

3. 瓶子平台的建造

1. 使用计算机数控（CNC）铣削，从硬塑料中切割出平台形状（图3A），例如高密度聚乙烯（HDPE）（参见 材料表）。每个形状制作三个。
   注:建议切割备用的顶部和底部层。
2. 用胶带将底部和顶层粘在一起。在两种形状上标记并钻五个直径为6 mm的小孔（图3A）。使用较大的钻头，小心地展开这些孔的表面，以便螺栓头可以凹陷（图3B）。
3. 对于三个平台中的每一个，将两个小角支架用螺栓固定在管道的后半部分。
   注意:牙套顶部之间的距离应为350毫米。
4. 将每个底层置于其大括号的顶部居中。从牙套下方标记钻孔的位置。钻两个直径为 6 mm 的孔。使用较大的钻头，小心地扩大孔的表面，以便螺栓可以凹陷。
5. 用螺栓将底层固定在其牙套上（图 3B–C）。
6. 切割 15 块 12 mm 长 6.35 mm 外径 （OD） 的硬管。在每个顶层和底层之间夹住五块刚性管。将层和管子与长而窄的螺栓固定在一起，如图 3B–D所示。
7. 在每个平台后面的PVC管上钻一个大孔。将每个微型磁力搅拌器插入其平台。将每个搅拌器的电缆穿过这些新切割的孔（图3C–E）。将每个搅拌器连接到其各自的控制单元以及电源插座。
8. 在每个平台上放置一个1升的瓶子。在瓶颈水平的后管中添加吊环螺栓。在每个瓶颈上缠绕一根小蹦极绳以增加稳定性（图4A）。
   注意:在整个实验方案中，颜色编码平台、瓶子、磁力搅拌器以及所有相关的电缆和传感器都会有所帮助。

4. 液体取样口的构造（可选）

1. 切割三根长度为 60 mm 的 6.35 mm 外径硬管。使用5毫米钻头，在每个橡胶塞上钻孔。将刚性管长度推过塞子。
2. 切割三根长度为 60 mm 的 3.18 mm 外径刚性管。用直式减速器将它们连接到每个塞子底部的突出管上。
3. 在每个塞子表面上的突出管中插入单向旋塞阀（例如，端口1 =母鲁尔，端口2 =公滑轮）（图4A）。
4. 切割三根 30 mm 长度为 3.18 mm 的挠性软管。在任一端插入鲁尔接头（例如，公鲁尔到软管倒钩和母鲁尔到软管倒钩）。
5. 将步骤4.4中制造的部件连接到每个橡胶塞子表面上的旋塞阀（图4A）。
   注意:旋塞阀和鲁尔接头的许多组合可以产生相同的结果。该设计应允许 液体通过 注射器抽出或插入。

5. 连接体积气体传感器

1. 根据制造商的说明准备气体传感器。
   注:这主要涉及用包装液体填充气体传感器（图4B）。
2. 要制作气体管路，请切割三个长度为1000 mm的3.18 mm外径柔性管。
3. 在后部 PVC 管上钻三个直径为 4 mm 的孔。将铰链旁边的孔放置在瓶颈高度。将气体管线穿过这些孔（图4A）。
4. 在PVC管内气体管路的末端，添加一个鲁尔接头（例如，软管倒钩到公鲁尔）并连接一个单向旋塞阀（例如，端口1 =母鲁尔，端口2 =公鲁尔）。
   注:仅当还安装了液体取样口时才需要该阀。
5. 使用直式减速器将气体管路的另一端连接到气体传感器的入口端口。用拉链系带固定此连接。
6. 使用插孔插头电缆将所有气体传感器连接到数字输入模块 （DIM），并将 DIM 连接到附近的计算机。
7. 在 Windows 操作系统上安装数据采集软件（请参见 材料表），并插入许可密钥转换器。将传感器校准文件添加到软件的校准目录中。

6. 光照状态的编程

1. 使用后部的开/关开关，打开 PBR 并通过微型 USB 电缆将 DMX 照明控制器连接到计算机。
2. 下载商店升级工具 （SUT） 和 LED 控制软件（请参见 材料表）。在线注册 DMX 照明控制器。
3. 打开 LED 控制软件，然后选择 单击此处使用 USB-DMX 接口:寿司-RB-RJ。
4. 在"扫描库"框中的"设置"选项卡下，选择"通用"文件夹和"单通道"。将"扫描库"设置更改为 DMX 宇宙 1，将固定装置数量更改为 4，将索引号更改为 1。在右上角，将下拉框更改为"列表视图"。最后，单击"修补程序"（补充图 1）。
   注:在 DMX 世界中，一个框通过滑动调光器按钮或在文本框中输入数值来测试每个 LED 灯条的控制。
5. 制作一条标准曲线，将照明控制软件中的数字光设置与PVC管中心经历的光强度相关联（图5）。使用悬挂在PVC管中心的小球形探头（参见 材料表）测量内部光强度。
6. 前进到 编辑器 选项卡。要构建自定义光源程序，请创建一个新场景并开始添加 步骤。有关示例16:8 h昼夜程序，请参阅 补充表1 。将场景设置为循环。
   注意:步骤将场景分解为多个时间块，每个时间块都可以设置为不同的光强度。步长范围从1秒到43分钟。在这里，30分钟的台阶是最方便的。多个场景可以加载到一个DMX照明控制器设备上。
7. 创建一个可立即识别的附加辅助场景，例如，四个 LED 中的两个亮起。
   注意:可以使用 DMX 照明控制器侧面的按钮手动循环切换场景。如果所需的灯光程序在夜间开始，则无法区分灯光程序是否已经开始。帮助程序场景用作 DMX 照明控制器正常工作的指示器。
8. 保存场景并前进到" 独立 "选项卡。写入 DMX 照明控制器的内存，然后断开设备与计算机的连接。
9. 使用微型 USB 将 DMX 照明控制器连接到其电源。
10. 在开始实验之前，通过记录内部光强度24小时来测试光程序。如果感兴趣的液体温度，请使用浸没式温度探头同时记录（图6）。

7. 开始实验

1. 对介质、瓶子、搅拌棒、橡胶塞、取样口、螺纹孔螺钉盖和管子进行灭菌。
   注:除阀门和鲁尔配件外，此设计中使用的所有组件都是可高温高压灭菌的 - 还有其他制造商的可高温高压灭菌替代品。
2. 打开数据采集软件并填写配置页面（补充图2）。将校准文件分配给其各自的传感器。
3. 在 "目录文件名" 下，选择相应的 DIM 端口号文件夹。单击 "当前文件夹"并对所有端口重复此操作。
4. 单击 "确定" 转到日志记录页。
5. 用培养基将瓶子填充到所需体积（补充表2，3）。
   注意:这些瓶子中的每一个最多可容纳约1.1升，顶部空间小（约80毫升，包括气体管路）。
6. 将储备培养物在三个平衡的50 mL管中以4500× g 离心15分钟以产生三个沉淀。向每个瓶子中加入一个沉淀 - 用血清移液管和新鲜培养基在颗粒中洗涤。
   注:第0天的培养密度也称为初始生物量浓度（IBC）。测量国际商业公司，单位为g_AFDW。^L-1，另外50 mL管可以在步骤7.6中离心。所得的颗粒随后可干燥并燃烧^15，19。步骤7.6可能需要根据用户的个人目标及其实验进行修改。
7. 将磁力搅拌器（25 x 8 mm）放入每个瓶子中。
8. 用橡胶塞和螺纹孔径螺旋盖密封每个瓶子开口（图4A）。如果安装了可选的取样口，请关闭阀门。
9. 找到PVC管内每条气体管路的末端（在步骤5.4中构建），并将针头连接到阀门的外螺纹鲁尔端口上。
10. 通过用相应的针刺穿每个橡胶塞，将每个瓶子连接到其气体传感器。
11. 通过选中屏幕左侧的复选框，单击 "开始"，然后输入文件名，单独启动每个气体传感器。单击 "确定" ，然后对所有传感器重复上述步骤（补充图3）。
    注:记录时，请勿退出数据采集窗口。将计算机的电源和睡眠设置设置为 从不 ，并在实验期间推迟计算机更新。
12. 打开 PBR 并确保 DMX 照明控制器已插入电源。第一个编程的场景将自动开始。请参阅步骤 6.7 以确认 DMX 照明控制器是否正常工作。

8. 瓶子取样（可选）

1. 在开始实验之前，再制备500mL的新鲜培养基（补充表2）。
   注意:如果一个具有16:8小时昼夜周期的24小时光计划于上午9点开始，那么黄昏和黎明之前的采样时间将在上午8点和下午4点下降（补充表1）。在这里，黎明和黄昏是指将灯光从ON转换到OFF的30分钟步骤，反之亦然。
2. 关闭气体管路上的阀门。
3. 将注射器（10 mL）连接到取样口阀（图4A）。
4. 打开取样口阀并取出8 mL培养物。
   注意:建议使用 5–10 mL。去除液体会在顶部空间中产生真空，使>10 mL的体积难以提取。
5. 关闭取样口阀并断开注射器。
6. 将含有 8 mL 新鲜培养基（从步骤 8.1 开始）的注射器连接到取样口阀。
7. 打开取样口阀并注入新鲜介质。
   注意:用新鲜培养基替换取样培养物的体积有助于保持相等的顶部空间体积和压力，并冲洗取样口管路。
8. 在断开注射器连接之前关闭取样口阀。
9. 在每个采样时间重复步骤 8.2–8.8。

9. 结束实验

1. 选中数据采集窗口中的所有活动端口复选框，然后单击 停止。
2. 若要导出数据，请选择" 文件 和 脱机数据"。选择所有相关的日志文件。将数据导出到电子表格软件并保存。
3. 对于每个瓶子，使用理想气体定律将测量的氧气总体积（以mL为单位）转换为摩尔。预测生长的生物质（gAFDW）的重量，如果每生产一摩尔生物量产生1.05摩尔O₂ 。取生物质的摩尔重量为24.6克^mol-1。
4. 手动整理流速数据。使用 mL/h 和 3 点移动平均线的单位。

结果

这里的氧气流速是培养物光合速率的量度。较高的光合作用率，以及因此引起的碳固定，转化为更高的增长率。这意味着用户可以比较不同处理和运行天数之间的氧气流速，作为生长的代理。简而言之，气体传感器的工作原理是在双室测量池中捕获和释放气泡（图4B）。来自传感器底部入口的气泡向上穿过包装液。气泡积聚在测量池的一个腔室中，体积约为3.2 mL。一旦达到此阈值，测量单元就会提示。这将释放气体并重置系统。数据采集软件记录每个尖端。

在示例数据中，比较了具有不同日间光照强度和初始生物量浓度（IBC）的三种处理的生长速率。这些治疗方法是出于演示目的而任意选择的。它们是（A）300微摩尔_光子^{m-2 s-1}和0.03 g_AFDW ^L-1，（B）600微摩尔_光子^{m-2 s-1}和0.13 g_AFDW ^L-1，以及（C）600微摩尔_光子^{m-2 s-1}和0.40 g_AFDW ^L-1。这些辐照度是在将瓶子放在平台上之前，用PVC管中心的球形探头测量的。培养深度和密度会影响光衰减。因此，微藻所经历的实际光强度可能与报道的强度不同。每次处理一式三份进行 - 在一个含有三个瓶子的PBR内。

在这里，一个成功的实验的特点是紧密复制的气体生产的昼夜模式（图7A-C）。在照明时间（白天），天然气产量稳步增加，在非照明小时（夜间），天然气生产停止（图7A–C）。微藻产生两种气体，光合作用产生的氧气和呼吸产生的二氧化碳²⁸。光合作用仅限于照明时间，而呼吸连续发生，但在^夜间28最活跃。光合作用建立，而呼吸分解代谢生物量²⁸。最初，顶空气体的组成与大气的组成相同。每次翻转测量池时，O₂都会置换大气中的气体。因此，气体传感器读数归因于O₂的产生，即使输出的气体不是纯O₂。气体传感器的最小进气压力极低，为8-9 mbar，使瓶子顶部空间压力仅略高于大气（海平面为1.01 bar）。因此，气体传感器读数在O₂气泡离开介质后不久就开始了。

呼吸释放的 CO₂ 对气体传感器读数没有影响，原因有两个。首先，在碱性介质中，CO₂ 与碳酸氢盐反应，降低pH值（图8）。其次，如果 CO₂ 确实逸出，气体传感器会填充液体 Silox，在 CO₂ 气泡到达测量池之前将其溶解，从而在液体表面₂₉ 处除气 CO²。这得益于缺乏隔夜气体传感器读数。在熄灯后不久就记录了那些确实发生的事件，表明读数代表了白天残留的氧气释放（图7）。

在实验设置中（使用局部温度和压力数据），环境压力下的80 mL顶空需要340 mL的已溶解O_2以 建立99%的O₂ 分压。在这里，4天内产生的氧气总体积范围从处理A中的316（SEM±11）mL到处理C中的902（SEM±51）mL（表1）。因此，到实验结束时，所有瓶子的顶部空间将主要包含O₂。顶空O₂浓度的增加，以及N₂浓度的降低，将影响这些气体的分压和饱和度。在 99% O₂ 顶部空间下，DO 增加 5 倍。相反，据估计，向1%N₂ 顶空的转变会导致15 mL的N₂ 脱落。这意味着在接近纯氧的顶空下，溶解的O₂ 比N₂ 更多的位移。因此，由于介质中仍然存在更多的O₂ ，这种效应会导致产生的光合氧量略有低估。

当培养物变得密集时，这种方法的主要挑战就出现了。随着更多的生物质，因此更多的呼吸，对O₂ 的需求增加。夜间O₂ 消耗在压力下产生了顶空。这导致气体传感器包装液体向上穿过气体管路。当O₂ 生产恢复时，包装液必须被送回气体传感器。这导致第一个气体传感器读数延迟。然而，在第四天晚上，这种欠压的幅度导致包装液到达并滴入处理B的三个重复中的两个，产生表面浮油。由于填料液位降低，气体传感器短路，将未测量的O₂ 直接释放到大气中。这导致数据收集趋于平整（图7B）。

欠压也可能是由温度引起的顶空容积收缩引起的。但是，这里的影响微乎其微。散热器通道和气流充分散发了多余的热量。在试验的两种光照方案中，最大温度变化使顶空体积减小了1%或更少，相当于80 mL顶空中的800μL填料液位移。对于300μmol_光子^{m-2 s-1}方案，最大昼夜温度波动为^1.4°C（图6），对于600μmol_光子^{m-2 s-1}方案，最大昼夜温度波动为3.2°C。300和600 μmol_光子^{m-2 s-1}方案的日间平均温度上升分别为0.7和1.8 °C。培养温度在一夜之间恢复到基线（图6）。

高分辨率的增长率数据可以揭示可能被忽视的趋势。考虑治疗B和C。尽管它们具有不同的中型散货箱，但两者都产生了相同量的总生物量（g_AFDW），这导致中等pH值的相同变化（表1）。仅给定起始和最终数据点，个体可以正确地假设两种处理之间的平均增长率没有差异（表1）。然而，在线氧气流速数据显示，每次治疗都有不同的每日生长速率。这些变化也反映在每日两次的pH测量中（图8）。第一天，治疗B的生长速度低于治疗C。到第三天，这种情况逆转了，治疗B的生长速度超过了治疗C（图7B，C）。氧气流速数据表明，在治疗B的第三天发生最高的生长速率（图7B）。

三种处理中每个瓶子产生的氧气总量用于估计它们各自的总生物量变化（g_AFDW）。这是使用光合生物质合成的通用方程实现的:CO₂ + 0.2 NH₃ + 0.6 H₂O = CH_1.8 O_0.5 N_0.2 + 1.05 O₂。顶空O₂ 分压的增加和随后的DO饱和度的上升预计将导致对生物量增长的轻微低估。七个例子中有五个是正确的（表2）。平均而言，估计的生物质增长在测量的生物质增长的10%以内。一些估计与测量的生长仅相差1-3毫克。两个例子高估了生长，即产生的氧气比生物质生长所能解释的要多。呼吸在一夜之间消耗的任何O₂ 都应反映在第二天O₂ 生产的滞后中。在这里，实验在晚上结束时被终止。通过这种方式，在每个实验的最后8小时内过夜生物质分解代谢是无法测量的。这可能导致高估生物量生长，特别是在密集培养物中。因此，建议在照明时间结束时终止实验。

图 1:反应器支架 （A） 底座组件的尺寸（以毫米为单位） （B） 固定两个垂直支撑的金属角撑板的方向。（C） 四个短钢长度中的一个将PVC管的后半部分连接到反应器支架。 请点击此处查看此图的大图。

（A） PBR 的后视图显示了电气组件的顶横梁和配置。（二）轻型安装后PBR的前视图。请点击此处查看此图的大图。

（A） 顶层和底层的尺寸（以毫米为单位）（B） 将螺栓头嵌入两层。（C）支架将底层直接连接到PVC管的后半部分。（D） 安装在窄螺栓上的五根短管将顶层和下层分开。（E）当瓶子平台完成时，表面应齐平。请点击此处查看此图的大图。

图 4:气体管路和可选采样端口 （A） 气管路将每个瓶子顶部空间连接到外部气体传感器。如果需要取样口，气体管路应包括针头下游的单向阀。（B） 容积式气体传感器。液体包装液位应接触跟踪螺钉。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:将 LED 控制软件设置与内部光强度相关的标准曲线。 白色圆圈和灰色三角形分别代表一个单独的 PBR。对于每个照明设置，所有四个灯具都设置为相同的值。 请点击此处查看此图的大图。

图6:300μmol_光子^{m-2 s-1}光照状态的培养温度变化。 在24小时，16:8小时的日间程序中，LED增加了白天的培养温度。蓝色箭头表示最低和最高温度之间的差异。灯光程序错误导致黄昏前温度下降;这在实验开始之前就得到了纠正。请点击此处查看此图的大图。

图7:三种独特实验条件下的产氧量。 每个反应器接受光强度和初始生物量浓度（IBC）的不同组合;（A）300微摩尔_光子^{m-2 s-1}和IBC 0.03克_AFDW ^L-1，（B）600微摩尔_光子^{m-2 s-1}和中型散货箱0.13克_AFDW ^L-1，（C）600微摩尔_光子^{m-2 s-1}和中型散货箱0.40克_AFDW ^L-1。顶部图表显示累积产氧量 （mL） 和气体流速 （mL/h）。黑色实线、蓝色虚线和红色虚线是仿行。每个实验的运行时间为104小时，其中包括四个完整的16:8小时昼夜循环。深橙色底纹表示夜间小时数，浅橙色日间小时数表示。请注意，在处理B中，氧气生产平坦在第4天为三个重复中的两个。请点击此处查看此图的大图。

图 8:pH 响应。 每个反应器接受光强度和IBC的不同组合;（绿色钻石）300 微摩尔_光子 ^{m-2 s-1} 和 IBC 0.03 g_AFDW ^L-1，（红色三角形） 600 μmol_光子 m^{2 s-1} 和 IBC 0.13 g_AFDW ^L-1，（紫色圆圈） 600 μmol_光子 ^{m-2 s-1} 和 IBC 0.40 g_AFDW ^L-1.深橙色底纹表示夜间小时数，浅橙色日间小时数表示。误差线表示均值的标准误差。请点击此处查看此图的大图。

治疗	光强度 （微摩尔光子 m-2 s-1）	中型散货箱（gAFDW L-1）	Δ 总生物量（克）氢氧化氢	Δ 酸碱度	总产氧量（毫升）
一个	300	0.031	0.289 （± 0.01）	0.15 （± 0.01）	316.2 （±11.4）
B	600	0.130	0.674 （± 0.02）	0.52 （± 0.27）	834.6*
C	600	0.400	0.675 （± 0.02）	0.55 （± 0.03）	902.2 （±50.5）
* 三次重复中只有一次成功

表 1:增长指标从小时 0 到 104 的变化。 括号表示均值的标准误差。

治疗	光强度 （微摩尔光子 m-2 s-1）	中型散货箱（gAFDW L-1）	测量的生物量增长（克	预测的生物量增长（克	低估 （%）
一个	300	0.031	0.289	0.288	0.5
一个	300	0.031	0.311	0.270	13.1
一个	300	0.031	0.268	0.247	7.9
B	600	0.13	0.708	0.705	0.4
C	600	0.4	0.718	0.796	-10.9
C	600	0.4	0.640	0.830	-29.7
C	600	0.4	0.668	0.659	1.3

表2:基于总测量氧量的增长估计。 从300μmol_光子^{m-2 s-1}和IBC = 0.13 g_AFDW ^L-1处理中只有一个重复运行到完成。

补充图 1:来自 LED 控制软件的屏幕截图。 四个灯具中的每一个都可以通过滑动调光器按钮或在文本框中输入数值来独立控制。 请按此下载此档案。

补充图2:数据采集软件配置窗口的屏幕截图。请按此下载此档案。

补充图3:数据采集软件记录窗口的屏幕截图。 亮绿色矩形表示在线气体传感器。数据实时显示。 请按此下载此档案。

附表1:实施例24 h光照状态。对于16:8小时的昼夜计划，每组有48组30分钟。星号表示建议的采样时间。 请按此下载此表格。

附表2:高碱度高pH值介质组合物。请按此下载此表格。

附表3:微量元素溶液。 向基础培养基中加入 1 mL/L 的最终浓度。 请按此下载此表格。

讨论

在该协议中，关注以下步骤会增加生成可重复的高质量数据的可能性。在建造反应堆支架（步骤1）时，底座必须坚固，并带有对齐良好的垂直支撑。开槽钢具有锋利的边缘，因此添加安全帽至关重要。瓶子平台表面需要完全平坦，磁力搅拌器和螺栓头都应位于顶层表面下方（步骤3.2-3.6）。根据制造商的说明，气体传感器包装液体应填充到"液位示踪螺钉"中，以便进行准确的氧气测量。应定期检查该液位，因为包装液的蒸发会使测量池短路。步骤5.2中制造的所有三条气体管路的长度应相同;这意味着复制具有相同的顶空卷。在开始实验之前，建议通过在24小时内记录光强度来测试编程的光照状态（步骤6.11）。如果担心液体温度升高，此测试还应包括带有内部温度探头的密封瓶（步骤6.11）。记录时，不要退出数据采集软件窗口;这将终止日志记录。如果采集培养样本，请注意不要通过以错误的顺序打开阀门来释放顶空气体（步骤8.2-8.8）。在查看实验数据时应注意，数据采集软件自动生成流量的移动平均值。这夸大了一夜之间生成的一个或两个流速读数的值。手动整理气体传感器日志以纠正此问题。

这种方法最常见的挫折是，如果液体填料水平下降，气体传感器可能会短路。有两种方法可以发生这种情况。首先，蒸发可以缓慢降低液位。然而，这在短期（<7天）实验²⁹中不太可能。其次，高呼吸速率可以将氧气吸入溶液中，并在压力下产生顶空。当光能不可用时，微藻使用有氧呼吸来提供细胞维持和修复^{所需的能量28}。因此，在非照明时间的致密培养物中，氧气消耗和由此产生的压力不足可能是巨大的。这会将包装液体从气体传感器吸入气体管路。包装液的行进距离与夜间呼吸量成正比。如果包装液进入瓶子，则会在液体表面产生浮油。

如果预计夜间呼吸率很高，可以对方案进行修改。避免压力过大的最简单方法是让瓶子顶部空间打开一夜。这还具有通过降低O₂的部分顶空压力来缓解DO水平的优点。高溶解氧浓度被认为对生长有害，因为O₂ 会阻碍Rubisco的活性，并可能引发氧化应激^30，31。培养悬浮液即使在与大气^25，32接触时达到4倍过饱和度的情况并不少见。要打开顶空，请断开气体管路与跨越橡胶塞的针头的连接。夜间时间可以作为一个窗口，为气体传感器填充液体或操纵连续实验，而对数据收集几乎没有影响。例如，可以改变培养密度，更新营养物质，添加修正剂或引入病原体。瓶子必须重新密封，并在灯重新亮起之前重新连接气体传感器线。从闭合与开放夜间顶空的实验中收集的氧气测量值将有所不同。

当瓶子保持密封时，夜间耗氧量减少了顶部空间中O₂ 的摩尔数。这会导致填料液体爬上气体传感器管路，以保持顶空压力。当灯亮起时，氧气产生恢复。在开始计算流速读数之前，必须将包装液推回气体传感器。因此，这种滞后与夜间呼吸的程度成正比。这样，当顶空保持闭合时，O₂ 读数表示净O₂ 生产（光合产生 - 呼吸消耗）。相反，当顶空在夜间打开时，大气气体取代了消耗的顶空O₂ ，并且没有包装液进入气体管路。结果是呼吸 O₂ 消耗量未计入 O₂ 生产数据。这可能会降低AFDW生物量增长估计的准确性。然而，它不应影响使用日间O₂ 生产作为比较治疗之间生长的指标的效用。

所有实验室PBR都受到相同限制的折磨;人造光无法复制太阳光谱。微藻使用波长在400-700nm之间的光进行光合作用。这个区域被称为光合作用有效辐射（PAR）³³。阳光和人造光在此范围内波长的相对贡献各不相同。这与有利的温度和恒定的光供应一起，意味着实验室生长数据通常无法可靠地推断到室外条件。然而，这些PBR可以解决实验室PBR光源的局限性之一。阳光强度在一天中变化很大，云层覆盖在入射PAR中产生瞬态波动。照明控制软件和 DMX 照明控制器可提供 0 至 2400 μmol_光子 ^{m-2 s-1} 及以上的光强度。光照状态可以分解为短至1 s的单独增量。可调光强度允许用户比标准PBR设置更接近地模拟户外光模式。在这里，模拟的30分钟黎明和黄昏间隔一起淡出昼夜周期（补充表1）。

尽管AFDW密度已成为生长的标准衡量标准，但这种方法可能需要大量的培养量，2-3天的处理周期，并且一次生成一个数据点。此外，如果条件变得不利并且细胞死亡，AFDW密度不会区分主动光合作用细胞和正在分解的细胞。量化光合氧产生速率可作为替代生长代理。这种PBR设计可以连续记录氧气的产生，几乎不需要用户干预，同时节省培养体积。通过选择测量池体积较小的气体传感器（例如1 mL），可以提高数据分辨率。此外，如果培养物混合良好，用户可以决定安装分光光度计以获得连续的光密度读数。如果需要对介质进行温度控制，可以添加一个循环冷却器。这些PBR是实验室的宝贵补充，希望在不进行大量财务投资的情况下扩大其微藻研究能力。它们特别适合那些使用高碱度，高pH值物种（如 螺旋藻）的人。这些PBR提供轻态灵活性，适用于快速、重复的实验室生长比较。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4	LED World	AC-AR1-1M	Required as a heat sink
Bungee cords, small Quantity: 5	-	-	To secure bottles
Computer - desktop/laptop Quantity: 1	-	-	-
Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1	HOBO, Hoskin	U30-NRC-VIA-10-S100-000	Records light sensor information
Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1	Ritter	N/A	This is to transmit gas sensor data to the computer
DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1	LITECH, LED World	LT-840-6A	Transmit messages which alter the light pattern
DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1	Arcolis, Nicolaudie America Inc.	SUSHI-RB-RJ DMX	Encodes the lighting program
Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L	Ritter	https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox
Gas sensor, volumetric Quantity: 3	Ritter	MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en)	Measures oxygen production
Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-1L	Culture vessels
Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10	Paulin, Home Depot	142-612	To cover sharp edges of slotted steel
Hardware - eye hooks Quantity: 6	-	-	To secure bottles
Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8	-	-	Larger brackets to construct metal stand
Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6	-	-	Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe
Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-616	Flat brackets to construct metal stand
Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1	-	-	Connects two halves of PVC pipe
Hardware - rivets Quantity: 40	-	-	To attach piano hinge to PVC tubing
Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60	-	-	Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers
Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30	-	-	Larger shorter bolts are required to build the metal stand
LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1	Magnitude Lighting, LED World	CVN96L24DC	Regulates power to the lights
LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll	EvenBright, LED World	FA128M57-4M-24V-X	Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube
Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1	LI-COR	LA-250A	Calibrate the reactors light intensity
Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2	HOBO, Hoskin	S-LIA-M003	Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned
Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3	2Mag, 2MAG USA	MF 40300	Stirrers sit sandwiched in bottle platforms
Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1	-	-	This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor
Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1	-	-	Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles
Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6	Inventables	30291-01	For bottle platforms which house magentic stirrers
Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3	Duran, VWR	76289-760	Seals culture vessels
Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-45HTSC	Generates seal of culture vessels
Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-202	Makes up the body of the metal stand
Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3	Paulin, Home Depot	142-222	Makes up the body of the metal stand
Software - Easy Stand Alone (ESA)		https://www.dmxsoft.com/#apps	AKA LED control software
Software - Rigamo v3.1			AKA data acquisition software
Software - Storage Upgrade Tools (SUT)		https://store.dmxsoft.com//
Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3	Fisherbrand	14-513-59	Stirs culture
Switch box Quantity: 1	-	-	Turns power on/off to reactor
Syringe, 10 mL Quantity: Multiple	-	-	Optional if you wish to extract culture
Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6	Masterflex, Cole Palmer	RK-12023-33	Close/open culture vessel line
Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-40616-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-02	Line from culture vessel to gas sensor
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-05	Gas sensor standard tubing size
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-27	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-30	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Zip ties, small Quantity: 1 packet			Secure tube fittings