Operação de Fotobioreatores laboratoriais com Medições de Crescimento Online e Regimes de Luz Personalizáveis

Resumo

Esta publicação descreve o desenho de fotobioreatores laboratoriais (PBRs) com regimes de luz personalizáveis. O crescimento de cianobactérias ou microalgas, usando bicarbonato como fonte de carbono, é monitorado continuamente pela medição da produção volumétrica de oxigênio. Esses PBRs facilitam comparações rápidas e replicadas de crescimento laboratorial com pouca intervenção do usuário durante os experimentos.

Resumo

O estudo laboratorial das microalgas pode ser experimentalmente desafiador. Além dos requisitos de cultivo de microrganismos não fotossintéticos, fototróficos também requerem iluminação. Rotineiramente, os pesquisadores buscam fornecer suprimentos de luz personalizados, ou seja, variar a intensidade da luz e o tempo sobre o qual é entregue. Essa flexibilidade é difícil com as luzes padrão do bancada. Geralmente, estudos de cultivo também requerem comparações de crescimento entre tratamentos experimentais. Frequentemente, o crescimento é avaliado ao longo de uma duração prolongada, por exemplo, várias vezes por dia durante um teste de uma semana. As medições manuais podem ser demoradas e falta de resolução de dados. Portanto, fotobioreatores (PBRs) com monitoramento automático de crescimento e fornecimento de luz personalizável são úteis para experimentos replicados com múltiplos tratamentos. A obra atual apresenta o projeto, construção e operação de PBRs laboratoriais. Os materiais são de origem fácil e relativamente baratos. O projeto pode ser duplicado com habilidade moderada. Cada estrutura tem uma pegada de ~40 cm² e hospeda três garrafas de vidro 1 L para replicação triplicada. As garrafas repousam sobre plataformas que contêm agitadores magnéticos e são dispostas verticalmente dentro de um tubo de cloreto de polivinil de 1 m de altura e 15 cm de diâmetro (PVC). O interior da tubulação é forrado com diodos emissores de luz (LEDs). Estes LEDs produzem intensidades contínuas de luz de 0-2400 fótons μmol ^{m-2 s-1} de radiação fotossintética ativa (PAR). Os usuários projetam um programa de iluminação personalizado. A intensidade da luz pode ser ajustada a cada segundo ou mantida constante por durações mais longas. O oxigênio produzido a partir da fotossíntese sai de cada garrafa através de um sensor gás volutrico unidirecionário. O software é usado para gravar dados de sensores de gás. A quantidade de oxigênio produzida pode estar correlacionada com o crescimento da biomassa. Se forem necessárias amostras de biomassa, uma seringa pode ser usada para extrair cultura. O método é adequado para microalgas cultivadas com bicarbonato como fonte de carbono. Esses PBRs são valiosos para um laboratório que requer experimentos replicados, flexibilidade de regime leve e dados contínuos de crescimento de alta resolução.

Introdução

Microalgas e cianobactérias, coletivamente chamadas de microalgas para a simplicidade, são defendidas por seu potencial em biotecnologia sustentável. Eles são candidatos atraentes devido ao seu rápido crescimento, capacidade de serem cultivados em terras não aráveis, e pelo uso da luz solar para impulsionar a conversão de dióxido de carbono em biomassa ^1,2,3. A biomassa microalgal pode ser convertida em produtos como bioenergia na forma de óleo ou gás, corantes alimentares e suplementos nutricionais, e materiais como biopolímeros 1,4,5,6,7. Além disso, podem ser usados para tratar águas residuais ou remediar corpos d'água, consumindo nutrientes em excesso ^8,9. Diante disso, a pesquisa microalgal é generalizada e estabelecida. O campo cresce à medida que a sociedade reconsidera a intensidade de carbono e a sustentabilidade ambiental das abordagens atuais de fabricação e geração de energia.

Três requisitos fundamentais de estudos microánguicos baseados em laboratório são um vaso cultural, fonte de luz e método para quantificar o crescimento. O termo fotobioreator (PBR) descreve uma configuração na qual os vasos culturais são iluminados¹⁰. Comumente, estudos de microalgas visam comparar o crescimento entre dois ou mais tratamentos, por exemplo, diferentes mídias de crescimento, regimes leves ou espécies 11,12,13. Para relevância estatística, cada condição, por exemplo, tratamento e controle, deve ser replicada. Se o controle e o tratamento forem executados simultaneamente, isso significa que muitos PBRs devem ser monitorados e amostrados durante a duração de um experimento. O desafio com a operação de vários PBRs é duas vezes. Em primeiro lugar, fornecer uma intensidade de luz uniforme a cada PBR é essencial para a reprodutibilidade, mas pode ser difícil. A quantidade de incidente de luz na superfície do vaso é influenciada por sua distância da fonte de luz, sombreamento de vasos adjacentes e flutuações de luz de fundo¹⁴. Em segundo lugar, deve ser selecionado um método para quantificar com precisão o crescimento.

O crescimento é comumente medido pela contagem de células, densidade óptica (OD), teor de clorofila A, densidade de peso seco (DW) e densidade de peso seco livre de cinzas (AFDW)¹⁵. Contagem de células, teor de clorofila A e métodos gravimétricos são processos manuais que produzem pontos de dados discretos. OD pode ser medido continuamente e não invasivamente com um espectrofotômetro, desde que seja bem calibrado contra outro método, como a densidade AFDW¹⁵. No entanto, as medidas de OD e o teor de Clorofila A podem não ser confiáveis, pois os resultados variam em diferentes condições culturais, por exemplo, entre espécies e ao longo do ciclo^{de crescimento 15,16}. Para clorofila A, o método de extração também pode impactar o rendimento do pigmento¹⁷. Clorofila O conteúdo é particularmente útil no acompanhamento do crescimento de microalgas dentro de comunidades microbianas que também contêm organismos não fotossintéticos^17,18. Ao escolher um método para determinar o crescimento, é essencial considerar a morfologia da suspensão. Quando os organismos se aglomeram e não são bem misturados, a OD e a contagem de células não são possíveis¹⁵. Um único método não é adequado para todas as aplicações experimentais — os pesquisadores devem decidir quais métodos são práticos e relevantes para seus objetivos experimentais.

O AFDW é um método confiável que permite comparações de crescimento entre várias condições culturais, notadamente, entre espécies e meios culturais 15,19,20. Para calcular afdw, uma amostra de cultura microálga é primeiro concentrada, seja por filtração ou centrifugação, e seca. Nesta fase, a DW pode ser determinada. Normalmente, a amostra DW contém pelo menos 8-10% de material inorgânico de cinzas, como sais e material particulado¹⁵. A DW acompanha as tendências de crescimento, mas pode ser distorcida se a contribuição dos inorgânicos variar. Para determinar a densidade de AFDW, a biomassa seca é queimada a altas temperaturas; isso vaporiza a porção orgânica ou útil, deixando as cinzas (inorgânicas) para trás¹⁹. Para calcular o AFDW, o peso da fração de cinzas é subtraído do da fração DW. Normalmente, em suspensões microánguas, o AFDW varia de 0,1 a 3 g/L 12,21,22. Pequenos volumes de suspensões diluídos produzem pouca biomassa seca, <10 mgs. Após a combustão, as cinzas podem pesar apenas 1 mg. Portanto, dependendo da densidade cultural, este método requer volumes entre 5-100 mL e escalas analíticas precisas de 0,1 mg 12,15,19,22. Os PBRs de laboratório são tipicamente pequenos, um par de litros no máximo, portanto, cada amostra líquida esgota o volume cultural. Além disso, o método AFDW é manual e leva de 2 a 3 dias. Para experimentos replicados e repetitivos, é preferível um processo automatizado e contínuo.

Para microalgas que usam bicarbonato como fonte de carbono, duas métricas adicionais de crescimento podem ser medidas continuamente. A fotossíntese consome bicarbonato e produz oxigênio. O consumo de bicarbonato aumenta o pH médio²³. Uma sonda pH imersa pode medir essa mudança. A produção de oxigênio fotossintético aumenta a concentração de oxigênio dissolvido (DO) do meio até que o meio esteja saturado. Além da saturação, o oxigênio existe como bolhas. A produção de oxigênio é medida por muitas técnicas diferentes: sondas medem a concentração do DO, dispositivos manométricos avaliam a pressão do espaço na cabeça, a cromatografia gasosa mede a composição do headspace e sensores volumétricos registram saída de gás 24,25,26,27. Quando o oxigênio é usado como um proxy de crescimento, os vasos de cultura devem ser totalmente selados ou permitir apenas o fluxo de gás. Para medições de pH e oxigênio, o carbono deve ser fornecido sob a forma de bicarbonato, não por co₂ sparging. O escoamento de CO₂ diminui o pH^{médio 23} e, como gás, pode perturbar as medições de oxigênio. Uma vantagem do pH e do oxigênio sobre a densidade óptica é que o método não é comprometido se microalgas formarem aglomerados. Embora indiretos, tanto o pH quanto o oxigênio são eficazes na comparação do crescimento entre os tratamentos.

Os PBRs em uso hoje variam em complexidade. Os laboratórios podem usar frascos simples de bancada, protótipos personalizados ou produtos disponíveis comercialmente. Para grupos de pesquisa que buscam atualizar a partir de frascos, o custo de PBRs comerciais ou habilidade técnica e fabricação de peças necessárias para construir muitos protótipos pode ser uma barreira. Este manuscrito tem como objetivo descrever o projeto passo a passo, a construção e a operação de PBRs de laboratório que fazem a ponte dessa lacuna. Estes PBRs têm um regime de luz personalizável e monitoram o crescimento continuamente registrando a produção volumostrica de oxigênio. Este projeto abriga três vasos culturais para replicação triplicada e pode ser construído com habilidade moderada e materiais de fácil acesso. Este PBR é uma adição valiosa a um laboratório que busca expandir sua capacidade de pesquisa microálgica sem investir em produtos muito técnicos ou caros. Ao optar por adquirir ou construir um PBR, os pesquisadores devem considerar a adequação de um projeto às suas condições culturais, posição financeira e questões de pesquisa.

Protocolo

1. Construção do estande da PBR

1. Com uma serra de corte portátil, corte cinco comprimentos de 380 mm e dois comprimentos de 200 mm de aço ranhuado em ângulo. Aperte junto com parafusos e grandes chaves de canto para fazer a base de um suporte (Figura 1A). Cole em tampas de extremidade de segurança.
2. Conecte dois comprimentos verticais não cortados (1220 mm) de aço ranhuado angular à base. Fixar com parafusos e gussets de canto metálico (Figura 1B). Cole em tampas de extremidade de segurança.
3. Corte quatro comprimentos planos de aço ranhutado de 65 mm. Aparafusá-los em ângulos de 90° nos suportes verticais — conecte dois a cada suporte, um de 130 mm acima da base (Figura 1C) e um de 60 mm para baixo da parte superior.
4. Fixar suportes verticais através de sua parte superior com um comprimento horizontal de 140 mm de aço ranhurado plano (crossbeam) aparafusado na parte de trás do quadro (Figura 2A).

2. Construção da câmara de luz

1. Corte um tubo branco de 153 mm de cloreto de polivinil (PVC) de diâmetro para um comprimento de 1070 mm. Corte o tubo ao meio do comprimento com uma serra de fita. Areia todas as bordas.
2. Espaço uniforme e centro quatro canais de dissipação de calor de alumínio verticalmente, juntamente com o interior do tubo. Não conecte canais dentro de 20 mm da borda de corte do tubo. Com parafusos pequenos, proteja os canais no lugar em sua parte superior e inferior (Figura 2B).
3. Coloque metade do tubo no suporte usando os suportes horizontais moldados na etapa 1.3.
4. Coloque o reator para baixo e reúna as metades do tubo gravando-os juntos. Centralizar a dobradiça do piano ao longo de uma linha de corte. Rastreie os orifícios da dobradiça e faça o tubo de acordo. Use uma arma de rebite e rebites de comprimento médio para fixar a dobradiça no tubo.
5. Use um pequeno cabo de bungee (ver Tabela de Materiais) para manter o tubo fechado (Figura 1C).
6. Consulte um eletricista para fio nas luzes LED e instale os seguintes quatro componentes: driver LED, decodificador multiplex digital (DMX), controlador de iluminação DMX e caixa de comutação (ver Tabela de Materiais). Fixar todos os componentes na parte traseira do PBR de acordo com a Figura 2A.

3. Construção das plataformas de garrafas

1. Corte as formas da plataforma (Figura 3A) de plástico duro, por exemplo, polietileno de alta densidade (HDPE) (ver Tabela de Materiais), utilizando a fresagem de controle numérico do computador (CNC). Faça três de cada forma.
   NOTA: Recomenda-se cortar camadas de cima e de baixo.
2. Grave a camada inferior e superior juntas. Marque e faça cinco pequenos furos, 6 mm de diâmetro, através de ambas as formas (Figura 3A). Usando uma broca maior, expanda cuidadosamente a superfície desses orifícios para que as cabeças de parafuso possam ser rebaixadas (Figura 3B).
3. Para cada uma das três plataformas, parafuso duas pequenas chaves de canto para a parte de trás do tubo.
   NOTA: A distância entre a parte superior do aparelho deve ser de 350 mm.
4. Centralizar cada camada inferior em cima de suas chaves. Marque a localização dos furos debaixo do aparelho. Faça dois furos de 6 mm de diâmetro. Usando uma broca maior, expanda cuidadosamente a superfície dos orifícios para que os parafusos possam ser rebaixados.
5. Bolt camadas inferiores para suas chaves (Figura 3B-C).
6. Corte quinze peças de tubos rígidos de 12 mm de comprimento e 6,35 mm de diâmetro externo (OD). Sanduíche cinco pedaços do tubo rígido entre cada camada superior e inferior. Fixar camadas e tubos junto com parafusos estreitos longos de acordo com a Figura 3B-D.
7. Faça um grande furo no tubo de PVC atrás de cada plataforma. Insira cada micro agitador magnético em sua plataforma. Rosqueie o cabo elétrico de cada agitador através desses orifícios recém-cortados (Figura 3C-E). Conecte cada agitador à sua respectiva unidade de controle, bem como a uma tomada de energia.
8. Coloque uma garrafa de 1 L em cada plataforma. Adicione parafusos oculares no tubo traseiro ao nível do pescoço da garrafa. Enrole um pequeno cabo de bungee em torno de cada pescoço de garrafa para adicionar estabilidade (Figura 4A).
   NOTA: Ao longo do protocolo, plataformas de codificação de cores, garrafas, agitadores magnéticos e todos os cabos e sensores associados serão úteis.

4. Construção das portas de amostragem líquida (opcional)

1. Corte três comprimentos de 60 mm de tubo rígido de 6,35 mm OD. Usando uma broca de 5 mm, faça furos em cada rolha de borracha. Empurre os comprimentos rígidos do tubo através da rolha.
2. Corte três comprimentos de 60 mm de tubo rígido de 3,18 mm OD. Conecte-os com um redutor reto ao tubo saliente na parte inferior de cada rolha.
3. Insira uma válvula de torneira de mão única (por exemplo, porta 1 = Luer fêmea, porta 2 = deslizamento masculino Luer) no tubo de saliência em cada superfície de rolha (Figura 4A).
4. Corte três comprimentos de 30 mm de tubos flexíveis de 3,18 mm de OD. Insira encaixes Luer (por exemplo, Luer masculino para mangueira barb e luer fêmea para a mangueira barb) em cada extremidade.
5. Conecte as peças feitas na etapa 4.4 às válvulas de torneira na superfície de cada rolha de borracha (Figura 4A).
   NOTA: Muitas combinações de torneiras e encaixes Luer podem produzir o mesmo resultado. O design deve permitir que o líquido seja retirado ou inserido através de uma seringa.

5. Ligar sensores de gás volutrico

1. Prepare os sensores de gás de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Isso envolve principalmente o enchimento de sensores de gás com líquido de embalagem (Figura 4B).
2. Para fazer as linhas de gás, corte três comprimentos de 1000 mm de tubos flexíveis de 3,18 mm de OD.
3. Faça três furos de 4 mm de diâmetro no tubo de PVC traseiro. Posicione os orifícios ao lado da dobradiça na altura do pescoço da garrafa. Rosqueie linhas de gás através desses orifícios (Figura 4A).
4. Ao final da linha de gás dentro do tubo de PVC, adicione um encaixe Luer (por exemplo, barb de mangueira ao macho Luer) e conecte uma válvula de torneira de mão única (por exemplo, porta 1 = Luer fêmea, porta 2 = Luer masculino).
   NOTA: A válvula só é necessária quando as portas de amostragem líquida também são instaladas.
5. Junte-se à outra extremidade da linha de gás à porta de entrada do sensor de gás usando um redutor reto. Segure esta conexão com uma gravata zip.
6. Conecte todos os sensores de gás ao módulo de entrada digital (DIM) com cabos de tomada e o DIM a um computador próximo.
7. Instale o software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) em um sistema operacional Windows e conecte o dongle da chave de licenciamento. Adicione arquivos de calibração do sensor ao diretório de calibração do software.

6. Programação do regime de luz

1. Usando o interruptor de liga/desliga traseiro, ligue o PBR e conecte o controlador de iluminação DMX a um computador através de um cabo micro-USB.
2. Baixe Ferramentas de atualização da loja (SUT) e o software de controle led (ver Tabela de Materiais). Registre o controlador de iluminação DMX on-line.
3. Abra o software de controle LED e selecione Clique aqui para trabalhar com a interface USB-DMX: SUSHI-RB-RJ.
4. Na guia Configuração na caixa ScanLibrary , selecione a pasta Genérico e o Canal Único. Alterar as configurações do ScanLibrary para o universo DMX 1, o número de acessórios para 4 e o número do índice para 1. No canto superior direito, altere a caixa de entrega para listar. Por fim, clique em Patch (Figura Suplementar 1).
   NOTA: No universo DMX, uma caixa testa o controle de cada tira LED deslizando os botões dimmer ou digitando um valor numérico na caixa de texto.
5. Faça uma curva padrão que relaciona a configuração da luz digital no software de controle de iluminação com a intensidade de luz experimentada no centro do tubo de PVC (Figura 5). Meça a intensidade da luz interna com uma pequena sonda esférica (ver Tabela de Materiais) suspensa no centro do tubo de PVC.
6. Avance para a guia Editor . Para construir um programa de luz personalizado, crie uma nova cena e comece a adicionar Passos. Consulte a Tabela Suplementar 1 para um exemplo 16:8 h programa diurno. Coloque a cena em loop.
   NOTA: Os passos dividem as cenas em blocos de tempo, cada um dos quais pode ser definido para diferentes intensidades de luz. Os passos variam de 1 s a 43 min. Aqui, 30 min passos são mais convenientes. Várias cenas podem ser carregadas em um dispositivo controlador de iluminação DMX.
7. Crie uma cena de ajudante adicional que seja imediatamente reconhecível, por exemplo, dois dos quatro LEDs ligados.
   NOTA: As cenas podem ser ciclodas manualmente usando o botão na lateral do controlador de iluminação DMX. Se o programa de luz desejado começar durante a noite, será impossível distinguir se o programa de luz já começou. A cena do ajudante serve como um indicador de que o controlador de iluminação DMX está funcionando corretamente.
8. Guarde as cenas e avance para a guia Stand Alone . Escreva a memória do controlador de iluminação DMX e desconecte o dispositivo do computador.
9. Conecte o controlador de iluminação DMX à sua fonte de alimentação usando um micro-USB.
10. Antes de iniciar um experimento, teste o programa de luz registrando a intensidade da luz interna para uma duração de 24 horas. Se a temperatura líquida estiver de interesse, registre-a simultaneamente com uma sonda de temperatura submersa (Figura 6).

7. Iniciar um experimento

1. Esterilizar mídia, garrafas, barras de mexida, rolhas de borracha, portas de amostragem, tampas de parafuso de abertura roscadas e tubos.
   NOTA: Todos os componentes usados neste design são autoclaváveis, exceto as válvulas e os encaixes Luer — existem alternativas autoclaváveis de outros fabricantes.
2. Abra o software de aquisição de dados e preencha a página de configuração (Figura Complementar 2). Atribua arquivos de calibração aos seus respectivos sensores.
3. Em Nome de arquivo de diretório selecione a pasta de número de porta DIM correspondente. Clique em Pasta Atual e repita para todas as portas.
4. Clique em OK para passar para a página de registro.
5. Encha as garrafas ao volume desejado com meio de cultivo (Tabelas Suplementares 2,3).
   NOTA: Cada uma dessas garrafas terá um máximo de ~1,1 L com um pequeno espaço para a cabeça (~80 mL, incluindo a linha de gás).
6. Centrifugar a cultura de estoque em três tubos equilibrados de 50 mL por 15 min a 4500 x g para produzir três pelotas. Adicione uma pelota a cada garrafa – lave em pelotas com uma pipeta sorológica e meio fresco.
   NOTA: A densidade cultural do dia 0 também é conhecida como concentração inicial de biomassa (IBC). Para medir o IBC em g_AFDW. ^L-1, um tubo adicional de 50 mL pode ser centrifuado na etapa 7.6. A pelota resultante pode então ser seca e queimada^15,19. A etapa 7.6 provavelmente exigirá modificações com base nos objetivos individuais dos usuários e seus experimentos.
7. Jogue um agitador magnético, 25 x 8 mm, em cada garrafa.
8. Sele cada abertura de garrafa com uma rolha de borracha e tampa de parafuso de abertura roscada (Figura 4A). Se forem instaladas portas de amostragem opcionais, feche as válvulas.
9. Localize a extremidade de cada linha de gás dentro do tubo de PVC (construído na etapa 5.4) e conecte uma agulha à porta Luer masculina da válvula.
10. Conecte cada garrafa ao seu sensor de gás perfurando cada rolha de borracha com a agulha correspondente.
11. Inicie cada sensor de gás individualmente verificando a caixa de marca no lado esquerdo da tela, clicando em Iniciar e inserindo um nome de arquivo. Clique em OK e repita para todos os sensores (Figura Suplementar 3).
    NOTA: Durante o registro, não saia da janela de aquisição de dados. Defina as configurações de energia e sono do computador para nunca e adie as atualizações do computador durante a duração do experimento.
12. Ligue o PBR e certifique-se de que o controlador de iluminação DMX esteja conectado a uma fonte de alimentação. A primeira cena programada começará automaticamente. Consulte a etapa 6.7 para confirmar se o controlador de iluminação DMX está funcionando corretamente.

8. Amostragem de garrafas (opcional)

1. Prepare mais 500 mL do meio fresco antes de iniciar o experimento (Tabela Suplementar 2).
   NOTA: Se um programa de luz de 24h com ciclo diurno de 16:8h foi iniciado às 9h, então os horários de amostragem antes do anoitecer e do amanhecer cairiam às 8h e às 16h (Tabela Suplementar 1). Aqui, amanhecer e crepúsculo referem-se a 30 min passos que transitam luzes de ON para OFF e vice-versa.
2. Feche a válvula na linha de gás.
3. Conecte uma seringa (10 mL) à válvula de porta de amostragem (Figura 4A).
4. Abra a válvula de porta de amostragem e retire 8 mL de cultura.
   NOTA: Recomenda-se entre 5 a 10 mL. Remover líquido gera um vácuo no headspace, tornando os volumes >10 mL difíceis de extrair.
5. Feche a válvula de porta de amostragem e desconecte a seringa.
6. Conecte uma seringa contendo 8 mL de meio fresco (da etapa 8.1) à válvula de porta de amostragem.
7. Abra a válvula da porta de amostragem e injete meio fresco.
   NOTA: Substituir o volume da cultura amostrada por um meio fresco serve para manter um volume e pressão igual do espaço da cabeça e lavar a linha da porta de amostragem.
8. Feche a válvula de porta de amostragem antes de desconectar a seringa.
9. Repetir as etapas 8.2-8.8 a cada tempo de amostragem.

9. Terminando um experimento

1. Verifique todas as caixas de marcação de porta ativas na janela de aquisição de dados e clique em Parar.
2. Para exportar dados, selecione Arquivo e Dados Offline. Selecione todos os arquivos de log relevantes. Exporte os dados para o software de planilha e salve.
3. Para cada garrafa, converta o volume total de oxigênio medido em mL em mols usando a lei do gás ideal. Prever o peso da biomassa cultivada (gAFDW) se 1,05 toupeira de O₂ for gerada para cada mol de biomassa produzida. Tome o peso molar da biomassa como 24,6 g ^mol-1.
4. Faça a curadoria manual dos dados da taxa de fluxo. Use unidades de mL/h e uma média móvel de 3 pontos.

Resultados

Aqui a taxa de fluxo de oxigênio é uma medida da taxa fotossintética da cultura. Taxas mais altas de fotossíntese e, portanto, fixação de carbono, traduzem-se em taxas de crescimento mais altas. Isso significa que o usuário pode comparar as taxas de fluxo de oxigênio entre diferentes tratamentos e dias operacionais como um proxy para o crescimento. Resumidamente, o sensor de gás funciona prendendo e liberando bolhas de gás em uma célula de medição de câmara dupla (Figura 4B). Bolhas de gás da entrada na base do sensor viajam através do líquido de embalagem. Bolhas se acumulam em uma câmara da célula de medição a um volume de ~3,2 mL. Uma vez que este limiar é atingido as pontas da célula de medição. Isso libera o gás e reinicia o sistema. Cada dica é registrada pelo software de aquisição de dados.

Nos dados de exemplo, foram comparadas a taxa de crescimento de três tratamentos com diferentes intensidades de luz diurna e concentrações iniciais de biomassa (IBCs). Esses tratamentos foram escolhidos arbitrariamente para fins demonstrativos. Eram (A) 300 μmol_fótons ^{m-2 s-1} e 0,03 g_AFDW ^L-1, (B) 600_fótons μmol ^{m-2 s-1} e 0,13 g_AFDW ^L-1, e (C) 600 μmol_fótons ^{m-2 s-1} e 0,40 g_AFDW ^L-1. Essas irradiações foram medidas com uma sonda esférica no centro do tubo de PVC antes que as garrafas fossem colocadas nas plataformas. A profundidade e a densidade da cultura afetam a atenuação da luz. Assim, a intensidade real da luz experimentada pelas microalgas pode variar das relatadas. Cada tratamento foi realizado em triplicado — dentro de um PBR contendo três garrafas.

Aqui, um experimento bem sucedido foi caracterizado por padrões diurnos de produção de gás (Figura 7A-C). Durante as horas iluminadas (dia), a produção de gás aumentou constantemente, e ao longo de horas não iluminadas (noite), a produção de gás parou (Figura 7A-C). Dois gases são produzidos por microalgas, oxigênio da fotossíntese e dióxido de carbono da respiração²⁸. A fotossíntese é restrita a horas iluminadas, enquanto a respiração ocorre continuamente, mas é mais ativa na noite²⁸. A fotossíntese se constrói, enquanto a respiração cataboliza a biomassa²⁸. Inicialmente, a composição do gás headspace é idêntica à da atmosfera. A cada lançamento da célula de medição, O₂ desloca o gás atmosférico. Portanto, as leituras dos sensores de gás foram atribuídas à produção de O₂ mesmo que o gás de saída não fosse puro O₂. A pressão mínima de entrada de gás para o sensor de gás é extremamente baixa, de 8 a 9 mbar, tornando a pressão do espaço da cabeça da garrafa apenas ligeiramente acima da atmosférica (1,01 bar no nível do mar). Assim, as leituras dos sensores de gás começam logo após as bolhas de O₂ deixarem o meio.

O CO₂ liberado da respiração não contribui para leituras de sensores de gás por duas razões. Em primeiro lugar, no meio alcalino, o CO₂ reage ao bicarbonato, diminuindo o pH (Figura 8). Em segundo lugar, se o CO₂ escapar, o sensor de gás que embala líquido, Silox, dissolve bolhas de CO₂ antes que eles possam chegar à célula de medição, superando o CO₂ na superfície^{líquida 29}. Isso é suportado pela falta de leituras de sensores de gás durante a noite. As que ocorreram foram registradas logo após a apagar as luzes, indicando que as leituras representavam liberação residual de oxigênio diurno (Figura 7).

Na configuração experimental (usando dados locais de temperatura e pressão), um headspace de 80 mL sob pressão ambiente exigiu 340 mL de O₂ ex resolvido para estabelecer uma pressão parcial O₂ de 99%. Aqui, o volume total de oxigênio produzido ao longo de 4 dias variou de 316 (SEM ± 11) mL no tratamento A a 902 (SEM ± 51) mL no tratamento C (Tabela 1). Portanto, no final do experimento, o espaço para a cabeça de todas as garrafas teria contido principalmente O₂. O aumento da concentração do headspace O₂, e, portanto, diminuição da concentração de N₂, teria afetado a pressão parcial e a saturação desses gases. Com um headspace O_{2 de} 99%, calculou-se um aumento de 5x no DO. Para as culturas 1.1 L, isso se traduziu em um adicional de 23 mL de DO. Por outro lado, estima-se que a mudança para um headspace 1% N₂ teria causado 15 mL de N₂ a exsolve. Isso significa que sob um espaço de cabeça de oxigênio quase puro, mais O₂ dissolvido do que N₂ foi deslocado. Assim, como mais O₂ permanece no meio, esse efeito teria levado a pequenas subestimações na quantidade de oxigênio fotossintético produzido.

O principal desafio desse método surgiu quando as culturas se tornaram densas. Com mais biomassa e, consequentemente, mais respiração, a demanda por O₂ aumentou. O consumo noturno O₂ gerou uma pressão no espaço da cabeça. Isso fez com que o líquido de embalagem de sensores de gás viajasse pela linha de gás. Quando a produção de O₂ foi retomada, o líquido de embalagem teve que ser levado de volta para os sensores de gás. Isso causou um atraso na primeira leitura do sensor de gás. No entanto, na quarta noite, a magnitude dessa sob pressão fez com que o líquido de embalagem alcançasse e pingando em duas das três réplicas do tratamento B, gerando uma mancha de óleo superficial. Devido à redução do nível de líquido de embalagem, os sensores de gás curto-circuito, liberando O₂ não meassurado diretamente para a atmosfera. Isso fez com que a coleta de dados se achatada (Figura 7B).

A sob pressão também pode ser causada por uma contração induzida pela temperatura do volume do espaço da cabeça. No entanto, o efeito aqui foi mínimo. Canais de dissipação de calor e fluxo de ar dissiparam adequadamente o excesso de calor. Dos dois regimes de luz testados, a mudança de temperatura máxima reduziu o volume do headspace em 1% ou menos, equivalente a um deslocamento líquido de embalagem de 800 μL em um headspace de 80 mL. A oscilação máxima da temperatura diurna foi de 1,4 °C para os regimes de 300_fótons ^{m-2 s-1} (Figura 6) e 3,2 °C para os regimes de 600 fótons ^{m-2 s-1}. O aumento médio da temperatura diurna para os regimes ^{m-2 s-1} _de 300 e 600 μmol foi de 0,7 e 1,8 °C, respectivamente. As temperaturas da cultura voltaram à linha de base durante a noite (Figura 6).

Dados de alta resolução podem revelar tendências que, caso contrário, podem passar despercebidas. Considere os tratamentos B e C. Apesar de seus diferentes IBCs, ambos geraram a mesma quantidade de biomassa total (g_AFDW), o que causou uma mudança idêntica no pH médio (Tabela 1). Dado apenas os pontos de dados iniciais e finais, um indivíduo pode, com razão, assumir nenhuma diferença na taxa média de crescimento entre os dois tratamentos (Tabela 1). No entanto, os dados da taxa de fluxo de oxigênio on-line revelaram que cada tratamento tinha taxas de crescimento diárias variadas. Essas variações também foram refletidas em medições de pH duas vezes por dia (Figura 8). No primeiro dia, a taxa de crescimento do tratamento B foi menor que a do tratamento C. No terceiro dia, isso se inverteu com a taxa de crescimento do tratamento B superando a do tratamento C (Figura 7B,C). Os dados da taxa de fluxo de oxigênio indicaram que a maior taxa de crescimento ocorreu no terceiro dia no tratamento B (Figura 7B).

O volume total de oxigênio gerado por cada frasco nos três tratamentos foi utilizado para estimar sua respectiva alteração na biomassa total (g_AFDW). Isso foi conseguido utilizando-se uma equação genérica para síntese de biomassa fotossintética: CO₂ + 0,2 NH₃ + 0,6 H₂O = CH_1.8 O_0,5 N_0,2 + 1,05 O₂. O aumento da pressão parcial O₂ do headspace e o subsequente aumento da saturação do DO devem causar uma leve subestimação do crescimento da biomassa. Isso foi verdade para cinco dos sete exemplos (Tabela 2). Em média, o crescimento estimado da biomassa foi de 10% do crescimento medido da biomassa. Algumas estimativas diferem em apenas 1-3 mg do crescimento medido. Dois exemplos de crescimento superestimado, ou seja, mais oxigênio foi produzido do que o crescimento da biomassa poderia ser responsável. Qualquer O₂ consumido pela respiração durante a noite deve ser refletido na defasagem na produção de O₂ no dia seguinte. Aqui, os experimentos foram encerrados no final da noite. Desta forma, o catabolismo de biomassa durante a noite durante as 8 horas finais de cada experimento não é mesmido. Isso pode causar superestimações do crescimento da biomassa, especialmente em culturas densas. Como tal, recomenda-se que os experimentos sejam encerrados no final das horas iluminadas.

Figura 1: Base de suporte do reator. (A) Dimensões dos componentes básicos em mm. (B) Orientação de gussets de canto metálico que garantem os dois suportes verticais. (C) Um dos quatro comprimentos curtos de aço conecta a parte traseira do tubo de PVC ao suporte do reator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Componentes elétricos. (A) Retrovisor do PBR mostrando feixe cruzado superior e configuração de componentes elétricos. (B) Visão frontal do PBR após a instalação da luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Detalhes da plataforma da garrafa. (A) Dimensões da camada superior e inferior em mm. (B) Cabeças de parafuso de recessão em ambas as camadas. (C) As chaves conectam a camada inferior diretamente à metade traseira do tubo de PVC. (D) Cinco peças curtas de tubos rígidos instalados sobre parafusos estreitos mantêm as camadas superior e inferior separadas. (E) Quando a plataforma da garrafa estiver completa, a superfície deve estar limpa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Linha de gás e porta de amostragem opcional. (A) As linhas de gás conectam cada espaço de cabeça da garrafa aos sensores de gás externos. Se a porta de amostragem for necessária, as linhas de gás devem incluir uma válvula unidirecional imediatamente a jusante da agulha. (B) Sensor de gás volutrico. O nível de embalagem líquida deve tocar no parafuso de rastreamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Curva padrão que relaciona as configurações do software de controle LED à intensidade interna da luz. Círculos brancos e triângulos cinzentos representam cada um um PBR individual. Para cada ajuste de luz, todas as quatro luminárias foram definidas como um valor idêntico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Mudança de temperatura cultural para os 300_fótons μmol ^{m-2 s-1} regimes de luz. Durante o programa diurno 24h e 16:8 h, os LEDs aumentaram a temperatura da cultura diurna. A seta azul indica a diferença entre a temperatura mínima e a máxima. Um erro do programa de luz causou a queda da temperatura antes do anoitecer; isso foi corrigido antes do experimento começar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Produção de oxigênio para três condições experimentais únicas. Cada reator recebeu uma combinação diferente de intensidade de luz e concentração inicial de biomassa (IBC); (A) 300_fótons μmol ^{m-2 s-1} e IBC 0,03 g_AFDW ^L-1, (B) 600_fótons μmol ^{m-2 s-1} e IBC 0,13 g_AFDW ^L-1, (C) 600 μmol_fótons ^{m-2 s-1} e IBC 0,40 g_AFDW ^L-1. Os gráficos superiores exibem a produção cumulativa de oxigênio (mL) e a taxa de fluxo de gás (mL/h). Linhas pretas sólidas, linhas azuis tracejadas e linhas vermelhas pontilhadas são réplicas. O tempo de execução para cada experimento foi de 104 h, que incluiu quatro ciclos completos de 16:8h durante o dia. Sombreamento laranja escuro representa horas noturnas e horas diurnas laranja claro. Note que no tratamento B, a produção de oxigênio plana no dia 4 para duas das três réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: resposta pH. Cada reator recebeu uma combinação diferente de intensidade de luz e IBC; (diamantes verdes) 300_fótons μmol ^{m-2 s-1} e IBC 0,03 g_AFDW ^L-1, (triângulos vermelhos) 600_fótons μmol m^{2 s-1} e IBC 0,13 g_AFDW ^L-1, (círculos roxos) 600 μmol_fótons ^{m-2 s-1} e IBC 0,40 g_AFDW ^L-1 . Sombreamento laranja escuro representa horas noturnas e horas diurnas laranja claro. As barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tratamento	Intensidade leve (fótons μmol m-2 s-1)	IBC (gAFDW L-1)	Biomassa total Δ (gAFDW)	Δ pH	Oxigênio total produzido (mL)
Um	300	0.031	0,289 (± 0,01)	0.15 (± 0,01)	316,2 (±11.4)
B	600	0.130	0,674 (± 0,02)	0,52 (± 0,27)	834.6*
C	600	0.400	0,675 (± 0,02)	0,55 (± 0,03)	902,2 (±50,5)
* Apenas uma das três réplicas foi bem sucedida

Tabela 1: Mudança métrica de crescimento da hora 0 para 104. Os suportes representam o erro padrão da média.

Tratamento	Intensidade leve (fótons μmol m-2 s-1)	IBC (gAFDW L-1)	Crescimento da biomassa medido (gAFDW)	Crescimento da biomassa previsto (gAFDW)	Subestimar (%)
Um	300	0.031	0.289	0.288	0.5
Um	300	0.031	0.311	0.270	13.1
Um	300	0.031	0.268	0.247	7.9
B	600	0.13	0.708	0.705	0.4
C	600	0.4	0.718	0.796	-10.9
C	600	0.4	0.640	0.830	-29.7
C	600	0.4	0.668	0.659	1.3

Tabela 2: Estimativas de crescimento com base no oxigênio total medido. Apenas uma réplica dos_fótons de 300 μmol ^{m-2 s-1} e IBC = 0,13 g_{tratamento AFDW} ^L-1 correu para ser concluído.

Figura suplementar 1: Captura de tela do software de controle LED. Cada uma das quatro luminárias pode ser controlada independentemente deslizando os botões de dimmer ou digitando um valor numérico na caixa de texto. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Captura de tela da janela de configuração do software de aquisição de dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Captura de tela da janela de registro de software de aquisição de dados. Retângulos verdes brilhantes indicam sensores de gás on-line. Os dados são exibidos em tempo real. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela suplementar 1: Exemplo 24h regime de luz. Para um programa diurno de 16:8h, há 48 conjuntos de 30 min cada. Asteriscos indicam tempos sugeridos de amostragem. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar 2: Alta alcalinidade alta composição média pH. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela suplementar 3: Solução de elemento de traço. Adicione a uma concentração final de 1 mL/L ao meio base. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Dentro deste protocolo, o foco nas etapas a seguir aumenta a probabilidade de gerar dados reprodutíveis e de alta qualidade. Ao construir o suporte do reator (passo 1), a base deve ser resistente com suportes verticais bem alinhados. O aço ranhuado tem bordas afiadas, por isso a adição de tampas de segurança é essencial. As superfícies da plataforma da garrafa precisam ser completamente planas, o agitador magnético e as cabeças de parafuso devem sentar-se abaixo da superfície da camada superior (passos 3.2-3.6). De acordo com a instrução do fabricante, o líquido de embalagem do sensor de gás deve ser preenchido ao "parafuso de rastreamento para nível líquido" para medições precisas de oxigênio. Este nível líquido deve ser verificado regularmente, pois a evaporação do líquido de embalagem pode fazer um curto-circuito na célula de medição. Todas as três linhas de gás feitas na etapa 5.2 devem ter o mesmo comprimento; este enures que replica têm volumes de espaço para a cabeça idênticos. Antes de iniciar um experimento, é aconselhável testar o regime de luz programado registrando intensidade de luz durante um período de 24 horas (etapa 6.11). Se o aumento da temperatura líquida for preocupante, este teste também deve incluir uma garrafa selada com uma sonda de temperatura interna (passo 6.11). Ao fazer o registro, não saia da janela do software de aquisição de dados; isso vai acabar com o registro. Se colher amostras de cultura, tenha cuidado para não liberar gás headspace abrindo válvulas na sequência errada (passos 8.2-8.8). Ao revisar dados experimentais, é informado que o software de aquisição de dados gera automaticamente uma média móvel da taxa de fluxo. Isso infla o valor das leituras de uma ou duas taxas de fluxo geradas durante a noite. Faça a curadoria de registros de sensores de gás manualmente para corrigir isso.

O revés mais comum com este método é o potencial de curto-circuito no sensor de gás se o nível de embalagem líquida diminuir. Há duas maneiras de isso ocorrer. Em primeiro lugar, a evaporação pode reduzir lentamente o nível líquido. No entanto, isso é improvável em^{um experimento de} curto prazo (<7 dias). Em segundo lugar, altas taxas de respiração podem puxar oxigênio para a solução e gerar um espaço de cabeça sob pressão. Quando a energia da luz não está disponível, as microalgas usam a respiração aeróbica para fornecer a energia necessária para manutenção e reparo celular²⁸. Assim, em culturas densas durante horas não iluminadas, o consumo de oxigênio e a consequente sub-pressão podem ser substanciais. Isso suga o líquido dos sensores de gás para a linha de gás. A distância que o líquido de embalagem percorre é proporcional à quantidade de respiração noturna. Se o líquido de embalagem entrar nas garrafas, isso gera uma mancha de óleo na superfície líquida.

Se forem esperadas altas taxas de respiração noturna, podem ser feitas modificações no protocolo. A maneira mais simples de evitar a sub-pressão é deixar os faróis da garrafa abertos durante a noite. Isso também tem a vantagem de aliviar os níveis do DO, diminuindo a pressão parcial do headspace de O₂. Acredita-se que altas concentrações de DO sejam prejudiciais ao crescimento, pois o O₂ pode impedir a atividade de Rubisco e pode desencadear estresse oxidativo^30,31. Não é incomum que as suspensões culturais atinjam 4x de supersaturação mesmo quando em contato com a atmosfera^25,32. Para abrir o espaço da cabeça, desconecte a linha de gás da agulha que abrange a rolha de borracha. As horas noturnas podem servir como uma janela para retoque o líquido de embalagem de sensores de gás ou manipular experimentos contínuos com pouco impacto na coleta de dados. Por exemplo, pode-se alterar a densidade da cultura, atualizar nutrientes, adicionar uma emenda ou introduzir um patógeno. As garrafas devem ser reeladas, e a linha do sensor de gás reconectada antes que as luzes se acendam. As medidas de oxigênio coletadas a partir de experimentos com espaços noturnos fechados versus abertos diferem.

Quando as garrafas permanecem seladas, o consumo noturno de oxigênio reduz o número de mols de O₂ no headspace. Isso faz com que o líquido de embalagem suba a linha do sensor de gás para manter a pressão do espaço da cabeça. Quando as luzes se acendem, a produção de oxigênio recomeça. O líquido de embalagem deve ser empurrado de volta para o sensor de gás antes do início das leituras da taxa de fluxo. Esta defasagem é, portanto, proporcional ao grau de respiração noturna. Desta forma, quando o headspace permanece fechado, as leituras de O₂ representam a produção líquida O₂ (produção fotossintética - consumo respiratório). Por outro lado, quando o espaço para a cabeça é aberto à noite, o gás atmosférico substitui o espaço de cabeça O₂ consumido, e nenhum líquido de embalagem entra na linha de gás. O resultado é que o consumo de O₂ respiratório não é contabilizado nos dados de produção de O₂ . Isso pode reduzir a precisão das estimativas de crescimento da biomassa AFDW. No entanto, não deve impactar a utilidade do uso da produção diurna O₂ como métrica para comparar o crescimento entre os tratamentos.

Todos os PBRs laboratoriais são afetados pela mesma limitação; luzes artificiais não podem replicar o espectro solar. Microalgas usam comprimentos de onda de luz entre 400 e 700 nm para fotossíntese. Esta região é referida como radiação fotossintética ativa (PAR)³³. A luz solar e a luz artificial variam em sua contribuição relativa de comprimentos de onda dentro desta faixa. Isso, ao lado de temperaturas favoráveis e uma oferta constante de luz, significa que os dados de crescimento laboratorial muitas vezes não podem ser adequadamente extrapolados para condições externas. Esses PBRs podem, no entanto, abordar uma das limitações do fornecimento de luz de PBR laboratorial. A intensidade da luz solar é altamente variável ao longo do dia, com a cobertura de nuvens gerando flutuações transitórias no PAR incidente. O software de controle de iluminação e o controlador de iluminação DMX podem fornecer intensidades de luz de 0 a 2400 μmol_fótons ^{m-2 s-1} e além. Regimes leves podem ser divididos em incrementos individuais tão curtos quanto 1 s. A intensidade de luz tunable permite que o usuário imite padrões de luz ao ar livre mais de perto do que as configurações padrão de PBR. Aqui, intervalos simulados de 30 min de madrugada e crepúsculo desaparecem ciclos diurnos e noturnos juntos (Tabela Suplementar 1).

Embora a densidade afdw tenha se tornado a medida padrão de crescimento, este método pode exigir volumes de cultura substanciais, um período de processamento de 2 a 3 dias, e gera um ponto de dados por vez. Além disso, se as condições se tornarem desfavoráveis e as células morrerem, a densidade de AFDW não discrimina entre células ativamente fotossintestares e aquelas que estão se decompondo. Quantificar a taxa de produção de oxigênio fotossintético serve como um proxy de crescimento alternativo. Este projeto PBR pode registrar a produção de oxigênio continuamente com pouca intervenção do usuário enquanto conserva o volume da cultura. A resolução dos dados poderia ser melhorada selecionando um sensor de gás com menor volume de célula de medição, por exemplo, 1 mL. Além disso, se as culturas forem bem misturadas, os usuários podem decidir instalar um espectrômetro para leituras contínuas de densidade óptica. Se o controle de temperatura do meio for desejado, um resfriador recirculador pode ser adicionado. Esses PBRs são uma adição valiosa a um laboratório que busca expandir sua capacidade de pesquisa microángua sem investimento financeiro pesado. Eles são particularmente adequados para aqueles que trabalham com alta alcalinidade, espécies de pH altas como Spirulina. Estes PBRs oferecem flexibilidade de regime leve e são válidos para comparações rápidas, replicadas e de crescimento laboratorial.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum channels Imperial: 0.90” x 39.37” Metric: 2.3 cm x 100 cm Quantity: 4	LED World	AC-AR1-1M	Required as a heat sink
Bungee cords, small Quantity: 5	-	-	To secure bottles
Computer - desktop/laptop Quantity: 1	-	-	-
Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station Quantity: 1	HOBO, Hoskin	U30-NRC-VIA-10-S100-000	Records light sensor information
Digital interface module, Rigamo, 4-channel Quantity: 1	Ritter	N/A	This is to transmit gas sensor data to the computer
DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A Quantity: 1	LITECH, LED World	LT-840-6A	Transmit messages which alter the light pattern
DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ Quantity: 1	Arcolis, Nicolaudie America Inc.	SUSHI-RB-RJ DMX	Encodes the lighting program
Gas sensor packing liquid (Silox) Quantity: 1 L	Ritter	https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox
Gas sensor, volumetric Quantity: 3	Ritter	MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en)	Measures oxygen production
Glass bottles, round 1 L with GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-1L	Culture vessels
Hardware - end caps for slotted steel Quantity: 10	Paulin, Home Depot	142-612	To cover sharp edges of slotted steel
Hardware - eye hooks Quantity: 6	-	-	To secure bottles
Hardware - metal corner braces (large) Imperial: 4" x 4" Metric: 10 cm x 10 cm Quantity: 8	-	-	Larger brackets to construct metal stand
Hardware - metal corner braces (small) Imperial: 2 1/2" x 2 1/2" Metric: 6.4 cm x 6.4 cm Quantity: 6	-	-	Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe
Hardware - metal corner gussets Imperial: 3" x 3" Metric: 7.6 cm x 7.6 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-616	Flat brackets to construct metal stand
Hardware - piano hinge Imperial: 36" Metric: 91 cm Quantity: 1	-	-	Connects two halves of PVC pipe
Hardware - rivets Quantity: 40	-	-	To attach piano hinge to PVC tubing
Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 60	-	-	Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers
Hardware - set of bolts, nuts, washers Quantity: 30	-	-	Larger shorter bolts are required to build the metal stand
LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply Quantity: 1	Magnitude Lighting, LED World	CVN96L24DC	Regulates power to the lights
LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip Quantity: 4 m roll	EvenBright, LED World	FA128M57-4M-24V-X	Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube
Light meter, handheld with submersible sperical probe Quantity: 1	LI-COR	LA-250A	Calibrate the reactors light intensity
Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor Quantity: 2	HOBO, Hoskin	S-LIA-M003	Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned
Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) Quantity: 3	2Mag, 2MAG USA	MF 40300	Stirrers sit sandwiched in bottle platforms
Metal plate Imperial: 24" x 8" Metric: 61 cm x 20.3 cm Quantity: 1	-	-	This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor
Pipe, white PVC Imperial: 6" diameter x 42" high Metric: 15.2 cm x 106.7 cm Quantity: 1	-	-	Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles
Plastic (HDPE) sheets Imperial: 4" x 4" x 1/4" Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm Quantity: 6	Inventables	30291-01	For bottle platforms which house magentic stirrers
Rubber stoppers - GL45 size Quantity: 3	Duran, VWR	76289-760	Seals culture vessels
Screw caps - with aperture and GL45 neck Quantity: 3	Corning, Capitol Scientific	1395-45HTSC	Generates seal of culture vessels
Slotted angle steel lengths Imperial: 1-1/2" X 48" x 0.074" Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 6	Paulin, Home Depot	142-202	Makes up the body of the metal stand
Slotted flat steel lenghts Imperial: 1-3/8" x 48" x 0.074" Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm Quantity: 3	Paulin, Home Depot	142-222	Makes up the body of the metal stand
Software - Easy Stand Alone (ESA)		https://www.dmxsoft.com/#apps	AKA LED control software
Software - Rigamo v3.1			AKA data acquisition software
Software - Storage Upgrade Tools (SUT)		https://store.dmxsoft.com//
Stir bar Imperial: 1" x 5/16" Metric: 2.5 cm x 0.8 cm Quantity: 3	Fisherbrand	14-513-59	Stirs culture
Switch box Quantity: 1	-	-	Turns power on/off to reactor
Syringe, 10 mL Quantity: Multiple	-	-	Optional if you wish to extract culture
Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way Quantity: 6	Masterflex, Cole Palmer	RK-12023-33	Close/open culture vessel line
Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors Imperial: to fit 1/16" and 1/8" ID tubing Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing Quantity: Multiple packets	Masterflex, Cole Palmer	RK-40616-04	Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantity: 4 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-02	Line from culture vessel to gas sensor
Tubing, flexible, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 2 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06422-05	Gas sensor standard tubing size
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/16", OD=1/8" Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm Quantiy: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-27	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Tubing, rigid, transparent Imperial: ID=1/8", OD=1/4" Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm Quantity: 1 m	Masterflex, Cole Palmer	RK-06605-30	Spans rubber stopper allowing gas to exit
Zip ties, small Quantity: 1 packet			Secure tube fittings