小鼠脑海马组织机械和酶解离联合

摘要

该神经细胞解离方案适用于起始材料量低的样品，并产生用于下游分析的高活性单细胞悬浮液，并具有可选的固定和染色步骤。

摘要

这种神经解离方案（商业成人脑解离试剂盒随附的方案的改编）优化了组织处理，为详细的下游分析（如流式细胞术或单细胞测序）做准备。神经解离可以通过机械解离（例如使用过滤器，斩波技术或移液器研磨），酶消化或其组合进行。神经元细胞的微妙性质可能使获得高活性，真正的单细胞悬浮液的努力复杂化，而单细胞分析所需的细胞碎片最少。数据表明，这种自动机械解离和酶消化的组合始终如一地产生高度可行（>90%）的单细胞悬浮液，克服了上述困难。虽然其中一些步骤需要手动灵巧，但这些步骤减少了样品处理和潜在的细胞损失。本手稿详细介绍了该过程的每个步骤，以装备其他实验室成功解离少量神经组织，为下游分析做准备。

引言

海马体最早是由博洛尼亚解剖学家Giulio Cesare Aranzio在1500年代描述的¹。在命名这种新发现的结构时，Aranzio的灵感可能来自它与 海马¹属海马的不可思议的相似之处。海马体参与压力反应，但因其在学习和记忆中的作用而广为人知。更具体地说，海马体负责声明性和空间记忆¹的编码和检索。

海马体或海马体本身分为CA1（cornu ammonis），CA2和CA3子字段¹。与神经系统的其他部分相比，海马体具有几个独特的定义特征，包括其可塑性和持续神经发生的潜力²。神经发生是神经干细胞增殖和分化的过程，随后它们被整合到预先存在的神经元网络中。神经发生仅限于齿状回的粒下区域和外心室（和嗅球）的室下区域³。虽然神经发生在胚胎发生中是丰富的，但它是一个终生的过程^3，4。因此，本讨论将集中在海马体中的成人神经发生上。

脑室下和粒下区域是含有室管膜细胞和血管细胞的神经源性生态位，以及神经干细胞的未成熟和成熟谱系⁵。小胶质细胞有助于这些生态位作为免疫细胞来调节神经发生⁶.神经祖细胞是神经干细胞⁷的非干细胞后代。脑室下区存在三种类型的神经祖细胞:桡骨神经胶质细胞样B型细胞，C型转运扩增祖细胞和A型神经母细胞^3，8。在脑室下区缓慢分裂的B型神经祖细胞可以分化成快速分裂的C型细胞⁸。随后，C型细胞分化为A型细胞⁸。这些神经母细胞通过喙状迁移流迁移到嗅球，然后分化成中间神经元或少突胶质细胞⁹。这些嗅球中间神经元是嗅觉短期记忆和联想学习的关键，而少突胶质细胞髓质化胼胝体⁹的轴突。大多数成人神经发生发生在齿状回的粒下区域，其中发现桡骨1型和非桡骨2型神经祖细胞³。大多数神经祖细胞注定要成为齿状颗粒神经元和星形胶质细胞¹⁰。星形胶质细胞通过间隙连接，形成网络以调节可塑性，突触活性和神经元兴奋性⁵。作为齿状回的主要兴奋性神经元，颗粒细胞提供从内嗅皮层到CA3区域¹¹的输入。

神经干细胞群可以使用免疫磁性或免疫荧光分离策略^12，13进行分离。神经组织特别难以解离;这样做的努力通常会导致样品具有较差的细胞活力和/或无法产生用于下游分析的必要单细胞悬浮液。神经解离可以通过机械解离（例如使用过滤器，斩波技术或移液器研磨），酶消化或技术组合^14，15进行。在一项评估神经解离方法的研究中，比较了移液器研磨手动机械解离与移液器研磨和消化与各种酶的组合的可行性和质量¹⁵.质量根据制备的悬浮液¹⁵中细胞团块和DNA或亚细胞碎片的量进行分级。单独进行手动机械解离的胶质肿瘤的悬浮液的细胞活力显着低于用分散酶或DNase，胶原酶和透明质酸酶¹⁵的组合治疗。Volovitz等人承认不同方法之间可行性和质量的差异，并强调解离不足可能会降低下游分析的准确性¹⁵。

在另一项研究中，作者比较了60多种不同的方法和培养的神经元细胞解离组合¹⁴。这些方法包括通过移液器研磨进行手动机械解离的八种不同变体，以三种不同间隔与五种单独酶的孵育比较，以及机械解离与酶消化或两种酶的组合的各种组合¹⁴。没有一种机械方法产生单细胞悬浮液¹⁴。四种单酶处理，十种组合酶处理，四种机械解离与酶消化组合产生单细胞悬浮液¹⁴。用TrypLE进行酶消化，然后用胰蛋白酶-EDTA最有效地解离样品¹⁴。顺便说一句，用TrypLE和/或胰蛋白酶-EDTA处理的样品倾向于形成凝胶状团块¹⁴。虽然这项研究是在培养的细胞上进行的，但它说明了移液器研磨或单独酶消化的缺点。

缺乏手动与自动机械解离的并排比较。然而，一组运行流式细胞术以比较整个小鼠大脑的手动和半自动机械解离与商业木瓜蛋白酶或胰蛋白酶解离试剂盒¹⁶。用解离器处理更一致地产生活细胞¹⁶。解离后，作者还分离出Prominin-1细胞，神经元前体细胞和小胶质细胞¹⁶。对于三个分离细胞群中的两个，当用解离器处理样品时，分离细胞的纯度略高于手动¹⁶。Reiß等人指出，移液技术中的人与人之间的差异阻碍了组织解离中活细胞群产量的可重复性¹⁶。作者得出结论，自动化机械解离使样品处理标准化¹⁶。

本手稿中概述的解离方法是全自动机械解离和酶消化的组合，使用伴随商业成人大脑解离试剂盒¹⁷的解决方案。与标准方案不同，这种优化的方案减少了样品操作，产生了高度可行的单细胞悬浮液，并且用于处理最少量的起始组织。

研究方案

实验是根据UAMS机构动物护理和使用委员会批准的道德标准进行的。购买6个月大的雌性C57Bl6 / J野生型小鼠，并在恒定的12小时光/暗循环下分组饲养（每个笼子4只小鼠）。

1. 试剂的制备

1. 准备可固定的活/死污渍储备溶液。用20μL二甲基亚砜（DMSO）重建荧光染料。
2. 将小瓶包裹在铝箔中，将其标记为"重组"，并将其在-20°C下储存长达六个月。
3. 用肝素制备0.9%盐水溶液。将一小瓶肝素钠（每10毫升10，000 USP单位）的内容物稀释在1升双蒸馏水（ddH₂O）中。
4. 准备足够的每只动物约45毫升，并在4°C下储存长达一周。
5. 制作1%多聚甲醛（PFA）。
   1. 在通风橱中，将热板加热至50°C。 在微波炉中，将玻璃烧杯中100 mL ddH₂O加热至约60°C。 加入磁力搅拌棒并转移到热板上。
   2. 在通风橱中，称出1克PFA并加入ddH₂O的烧杯中，加入0.1125克NaOH晶体并混合直至溶解（5-10分钟）。
   3. 加入0.4克NaPO_4- 单基并混合直至溶解（2-5分钟）。真空过滤溶液并用HCl和NaOH调节pH至7.4。
   4. 在冰上或4°C下冷却30分钟，然后储存。
      注意:1.5 mL的等分试样可以在-20°C下储存一年。避免冻融循环。如果在解冻后，溶液变得浑浊或已经形成沉淀物，则不应使用该溶液。
      注意:有毒，易燃。始终在通风罩下使用PFA，并穿着适当的个人防护装备。
6. 重悬于冻干酶A与1mL缓冲液A。不要涡旋溶液。
   注意:酶A和缓冲液A以及缓冲液A，Y和Z是商业成人脑解离试剂盒¹⁷中的试剂。
7. 将酶P分成50μL的等分试样，并将酶A重悬于10μL等分试样中。根据试剂盒说明，在-20°C下储存长达六个月。避免冻融循环。

2. 实验日

1. 将台式离心机冷却至4°C。
2. 将等分试样的PFA放入冰箱中逐渐解冻。
3. 将重组的活/死污渍置于黑暗中（例如抽屉）以在室温下解冻。
4. 准备牛血清白蛋白（BSA）缓冲液。将0.5克BSA加入100毫升1x Dulbecco的磷酸盐缓冲溶液中，不含钙和镁（D-PBS），pH值为7.2。
5. 加入搅拌棒，在搅拌板上搅拌30分钟。转移到50 mL锥形管中并储存在4°C。
   注意:始终使用新鲜制备的BSA缓冲液。
6. 准备活/死污渍工作稀释液。将1μL复溶的活/死渍储备溶液加入360μL D-PBS中，并在室温下将其储存在黑暗中（例如，抽屉或盒子）。每个样品制备50μL工作稀释液。

3. 灌注

1. 将含肝素的盐水溶液放在冰上。
2. 打开氧气，将小动物麻醉汽化器系统上的流量计指示球设置为1升/分钟。确保有足够的氧气压力和异氟醚。
3. 将汽化器刻度盘调整至3.5%（用于感应和维护）。
4. 用生理盐水/肝素溶液启动灌注泵管路。将速度设置为 6 mL/min。
5. 将鼠标放入诱导室，打开通气器，等待几分钟，直到鼠标无响应。通过没有踏板退出到有毒的捏合来确认足够的麻醉深度。
6. 将鼠标背放在解剖托盘上，鼻子在鼻锥中。通过没有踏板退出到有毒夹紧来执行完全麻醉的二次确认。将所有四只爪子固定到托盘上。
7. 用20%乙醇喷洒动物的腹部。
8. 使用镊子捏住下腹部并抬起皮肤。用剪刀将毛皮和皮肤切开到肋骨的底部。
9. 从胸腔下方向每个肩膀做两个对角线切口。
10. 小心地切除横膈膜（避开肺部和心脏）。切除胸腔以暴露心脏。
11. 小心地切除心脏周围的任何结缔组织。
    注:步骤3.10-3.11至关重要;熟练和灵巧地执行。
12. 用剪刀夹住右心房（心脏左上角的深色心房）。关闭异氟醚流向呼吸器的流量。
13. 用镊子保持心脏稳定。当蝴蝶针的斜面朝上时，刺穿左心室，同时保持针头水平并与动物平行。
14. 将针头固定到位，打开泵，灌注至少 30 mL 盐水/肝素溶液，直到离开心脏的液体不透明，肝脏和肺部颜色苍白。
    注:步骤3.13-3.14至关重要;熟练和灵巧地执行。
15. 关闭泵，取出针头，然后将鼠标转移到解剖区域。

4. 解剖

1. 使用大手术剪刀，斩首头部。
2. 将皮毛从后脑勺切开到眼睛。将皮肤剥开以露出头骨。
3. 将头骨夹在眼睛之间。在颅骨的后部，在10点钟和2点钟位置做两个切口，然后沿着颅骨的中高线到眼睛之间的原始切口进行一次长切口（保持尖端向上以避免损伤大脑）。
4. 使用镊子将头骨的两半剥开到两侧。使用刮刀取出大脑并将其放入装有冷D-PBS的冰上的60毫米玻璃培养皿中（图1）。
5. 使用手术刀或剃须刀分隔每个半球。然后去除嗅球和小脑。
6. 使用镊子去除中脑，直到海马体暴露出来。
7. 用镊子保护大脑。使用第二组镊子，轻轻地将海马体从每个半球中梳理出来，并将两个海马体转移到含有冷D-PBS的标记的1.5 mL管中。
8. 将含有小鼠两个海马体的样品管放在冰上。

5. 为每个样品准备酶混合物 1 和 2

注意:对于大于2 mL的体积，请使用10 mL血清学移液器;对于体积，200μL-2mL，使用1000μL移液器;对于体积，21-199μL，使用200μL移液器;对于体积，2-20μL，使用20μL移液器;对于2μL以下的体积，使用0-2μL移液器。

1. 对于每个样品，在室温下解冻酶P和酶A各一等分试样。
2. 对于酶混合物1，将50μL酶P和1900μL缓冲液Z组合在标记的C管中（材料表）。
3. 对于酶混合物2，将20μL缓冲液Y加入解冻的酶A等分试样中。

6. 成人大脑解离方案¹⁷

注意:处理样品时，除非另有说明，否则应在室温下将试管放置在试管架中，而BSA和D-PBS保持在冰上。

1. 打开解离器。
2. 使用镊子将海马组织碎片转移到C管。
3. 将30μL酶混合物2转移到C管中。拧动盖子直到感觉到张力，然后拧紧直到发出咔哒声。
4. 将C管倒置到解离器的位置;该示例将被分配为 "已选择" 状态（图2）。将加热器固定在C管上。
5. 按文件夹图标，选择" 收藏夹 "文件夹，滚动到并选择 37C_ABDK_02 程序。单击 "确定" 将程序应用于所有选定的C管，然后点击 "开始" （图2）。
6. 每个样品标记一个 50 mL 锥形管。
7. 在每个50 mL锥形管上放置70μm细胞过滤器，并用2mLBSA缓冲液润湿。
8. 程序完成后，从解离器上取下加热器和C管。
9. 向样品中加入4 mLBSA缓冲液，并将混合物施用于50 mL锥形管上的细胞过滤器。
10. 向C管中加入10毫升D-PBS，将其关闭，然后轻轻旋转溶液。将其涂抹在50 mL锥形管上的细胞过滤器上。
11. 丢弃细胞过滤器和C管。在4°C下以300× g 离心悬浮液10分钟。 然后，吸出并丢弃上清液。

7. 清除碎屑

1. 用1550μL冷D-PBS重悬沉淀，并将悬浮液转移到标记的15mL锥形管中。
2. 加入450μL冷碎片去除溶液，上下移液（不要涡旋）。
   注:碎屑去除溶液是商用成人布莱恩解离试剂盒¹⁷中的试剂。
3. 轻轻地将1mL冷D-PBS覆盖在细胞悬浮液的顶部，使尖端靠在锥形管壁上。重复此步骤，直到总覆盖物为 2 mL。
   注意:此步骤至关重要。熟练和灵巧地执行。
4. 在4°C下以3000× g 离心10分钟，全加速和全制动。
   注意:如果阶段未明确分离，请重复步骤 7.2-7.3。最后一次在4°C下以1000× g 离心10分钟。
5. 悬浮液现在应由三个不同的层组成（图3）。吸出最顶层。来回扫动移液器吸头以吸出白色中间层。尽可能多地去除中间层，而不干扰最底层。
   注意:此步骤至关重要。熟练和灵巧地执行。
6. 加入2毫升冷的D-PBS和上下移液器混合。
7. 在4°C下以1000× g 离心10分钟，全加速和全制动。吸出并丢弃上清液。将沉淀重悬于1mLBSA缓冲液中。
   注意:可以将细胞重悬于适当的缓冲液中，然后进行磁标记和分离，以准备此时进行单细胞测序。

8. 细胞计数

1. 根据制造商的可用细胞计数器协议进行细胞计数（ 材料表中注明了一个选项）

9. 活/死污渍

1. 在4°C下以1000× g 离心剩余的900μL（从7.7）在全加速和全制动下离心10分钟。
2. 当样品旋转时，每个样品标记一个流管并将其包裹在箔中以限制光照。
3. 吸出并丢弃上清液。
4. 将沉淀重悬于50μL稀释的活/死污渍（先前制备）中。
   注:此步骤应在低光照设置下执行。关闭头顶房间的灯来实现这一点。
5. 将每个样品转移到相应的标记流管中，并在室温下在黑暗中孵育8-10分钟（例如，抽屉或盒子）。
6. 加入500μLBSA缓冲液，并在4°C下以1000× g 离心10分钟，全加速和全制动。
7. 吸出并丢弃上清液。
   注意:颗粒可能不可见;留下少量缓冲液，以免无意中吸出沉淀。此时，可以将细胞重悬于适当的缓冲液中，阻断并用细胞特异性抗体染色。有关示例协议¹⁸，请参阅补充文件 1。

10. 固定（可选）

1. 将沉淀重悬于200μL的1%PFA（先前制备）中。在4°C下孵育15分钟。
2. 通过加入500μLD-PBS洗涤，并在4°C下以300× g 离心10分钟。
3. 吸出上清液。
   注意:颗粒可能不可见;留下少量缓冲液，以免无意中吸出沉淀。
4. 将沉淀重悬于200μLD-PBS中，并在4°C下储存长达3天。

11. 流式细胞术

1. 在新管上标记过滤器盖。
2. 使用1 mL移液器，将每个样品移液到过滤器盖上。
3. 在4°C下以200× g 离心，仅允许离心机达到200× g ，然后停止运行。
4. 进入流式细胞术核心进行下游分析。

结果

在核心设施中使用流式细胞仪处理样品，并使用用于流动分析的软件包评估结果数据。以前，对补偿对照进行分析 - 活/死污渍和阴性对照。如果使用多种荧光染料，应为每种抗体制备荧光减一（FMO）对照和单染色对照。基于分析的对照计算实验样品光谱重叠的补偿。对于细胞群鉴定，使用分层门控策略。主栅极排除了前向散射（细胞大小）与侧散射（粒度）图^19，

讨论

这种神经解离方案中的几个步骤需要熟练的技术和灵活性 - 灌注，上清液抽吸和髓鞘去除。在整个灌注过程中，内脏器官必须保持完整（除了移除隔膜和夹住心脏）;这包括用蝴蝶针避开心脏的上腔室。虽然所需的含肝素的盐水量各不相同，但从心脏流出的透明液体表明该过程已完成。大脑必须完全正确灌注，此时它将呈现灰白色（图1）。通过灌注，红细胞去除步骤变得无?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting