マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

要約

この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。

要約

この神経解離プロトコル(市販の成人脳解離キットに付随するプロトコルの適応)は、フローサイトメトリーや単一細胞シーケンシングなどの詳細な下流分析の準備として組織処理を最適化します。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、またはそれらの組み合わせを介して行うことができる。神経細胞の繊細な性質は、単一細胞分析に必要な最小限の細胞破片で、生存率の高い真の単一細胞懸濁液を得るための努力を複雑にする可能性があります。このデータは、自動化された機械的解離と酵素消化のこの組み合わせが、前述の困難を克服し、常に生存率の高い(>90%)単一細胞懸濁液を生成することを実証する。いくつかのステップでは手作業による器用さが必要ですが、これらのステップはサンプルの取り扱いと潜在的な細胞損失を軽減します。この原稿では、下流の分析に備えて少量の神経組織を首尾よく解離させるために他の研究室を装備するためのプロセスの各ステップを詳述しています。

概要

海馬は、1500年代にボローニャの解剖学者ジュリオ・チェーザレ・アランツィオによって最初に記述^{されました。}この新しく発見された構造に名前を付ける際に、アランツィオはおそらく 海馬¹属のタツノオトシゴとの奇妙な類似性に触発されました。海馬はストレス反応に関与していますが、学習と記憶におけるその役割で広く知られています。より具体的には、海馬は、宣言的および空間的記憶¹の符号化および検索を担当する。

海馬、または適切な海馬は、CA1(cornu ammonis)、CA2、およびCA3サブフィールド¹に分けられます。神経系の他の部分と比較して、海馬は、その可塑性および進行中の神経新生の可能性を含むいくつかのユニークな定義的特徴^{を有する2}。神経新生は、神経幹細胞の増殖および分化のプロセスであり、続いて既存のニューロンネットワークへの統合が続く。神経新生は、歯状回および側脳室(および嗅球)の脳室下帯の顆粒下帯に限定される³。神経新生は胚発生に豊富ですが、それは生涯にわたるプロセスです^3,4。したがって、この議論は海馬における成体の神経新生に焦点を当てる。

脳室下および顆粒下帯は、上衣細胞および血管細胞、ならびに神経幹細胞⁵の未熟および成熟系統を含む神経原性ニッチである。ミクログリアは、神経新生を調節する免疫細胞としてこれらのニッチに寄与する⁶。神経前駆細胞は、神経幹細胞⁷の非幹細胞後代である。脳室下帯には3種類の神経前駆細胞が存在する:放射状グリア様B型細胞、C型トランジット増幅前駆細胞、およびA型神経芽細胞^3、8。脳室下帯でゆっくりと分裂するB型神経前駆細胞は、急速に分裂するC型細胞⁸に分化することができる。続いて、C型細胞はA型細胞⁸に分化する。これらの神経芽細胞は、吻側移動流を通って嗅球に移動し、その後、介在ニューロンまたは希突起膠細胞に分化する⁹。これらの嗅球介在ニューロンは、嗅覚短期記憶、および連想学習の鍵であり、一方、希突起膠細胞は脳梁⁹の軸索を髄鞘化する。成体神経新生の大部分は、歯状回亜顆粒帯で起こり、そこでは放射状タイプ1および非放射状タイプ2の神経前駆細胞が見出される³。ほとんどの神経前駆細胞は、歯状顆粒ニューロンおよびアストロサイト¹⁰になる運命にある。ギャップ接合部によって接続されたアストロサイトは、可塑性、シナプス活性、およびニューロン興奮性を調節するためにネットワークを形成する⁵。歯状回の主要な興奮性ニューロンとして、顆粒細胞は嗅内皮質からCA3領域¹¹への入力を提供する。

神経幹細胞集団は、免疫磁気または免疫蛍光単離戦略を用いて単離することができる^12、13。神経組織は解離することが特に困難です。そのための努力は、しばしば、細胞生存率の低いサンプルおよび/または下流分析に必要な単一細胞懸濁液の製造に失敗する結果となる。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、または技術の組み合わせを介して行うことができる^14、15。神経解離法を評価する研究では、ピペット粉砕による手動機械的解離の生存率および品質を、ピペット粉砕および様々な酵素による消化の組み合わせと比較した¹⁵。品質は、調製した懸濁液¹⁵中の細胞凝集塊およびDNAまたは細胞内破片の量に基づいて等級付けした。単独で手動機械的解離を行ったグリア腫瘍の懸濁液は、ディスパーゼまたはDNase、コラゲナーゼ、およびヒアルロニダーゼの組み合わせによる処理よりも有意に低い細胞生存率を有していた¹⁵。Volovitzらは、異なる方法間の生存率および品質のばらつきを認め、不十分な解離が下流分析の精度を低下させる可能性があることを強調した¹⁵。

別の研究では、著者らは培養神経細胞の解離の60以上の異なる方法と組み合わせを比較した¹⁴。これらの方法には、ピペット粉砕による手動機械的解離の8つの異なるバリエーション、3つの異なる間隔での5つの個々の酵素とのインキュベーションの比較、および酵素消化による機械的解離の様々な組み合わせ、または2つの酵素の組み合わせ¹⁴が含まれていた。いずれの機械的方法も、単一細胞懸濁液¹⁴を生じた。4つの単一酵素処理、10の組合せ酵素処理、および4つの組合せの機械的解離と酵素消化は、単一細胞懸濁液¹⁴を得た。TrypLEによる酵素消化に続いてトリプシン−EDTAが最も効果的に解離したサンプル¹⁴。なお、TrypLEおよび/またはトリプシン-EDTAで処理した試料は、ゼラチン状凝集塊¹⁴を形成する傾向があった。この研究は培養細胞に対して実施されましたが、ピペットの粉砕または酵素消化のみの欠点を物語っています。

手動解離と自動機械的解離の並列比較は欠けている。しかしながら、1つのグループはフローサイトメトリーを実行して、市販のパパインまたはトリプシン酵素解離キット¹⁶と組み合わせてマウス脳全体の手動および半自動機械的解離を比較した。解離器による処理により、より一貫して生細胞¹⁶を得た。解離後、著者らはまた、プロミニン-1細胞、ニューロン前駆細胞、およびミクログリア¹⁶を単離した。3つの単離された細胞集団のうちの2つについて、単離された細胞の純度は、サンプルを解離剤で処理したとき、手動^の16と比較してわずかに高かった。Reißらは、ピペッティング技術における人的変動が、組織解離における生細胞集団収量の再現性を妨げることを指摘した¹⁶。著者らは、自動化された機械的解離がサンプル処理¹⁶を標準化すると結論付けた。

この原稿に概説されている解離の方法は、市販の成人脳解離キット¹⁷に付随する溶液を使用する、完全に自動化された機械的解離および酵素的消化の組み合わせである。標準的なプロトコルとは異なり、この最適化されたプロトコルは、サンプル操作を減らし、生存率の高い単一細胞懸濁液を生成し、最小限の開始組織を処理することを目的としています。

プロトコル

実験は、UAMSの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準に従って実施された。生後6ヶ月の雌性C57Bl6/J野生型マウスを購入し、一定の12時間の明暗サイクル下で集団飼育(ケージあたり4匹)した。

1. 試薬の調製

1. 修正可能な生/死汚れストック溶液を準備します。蛍光染色液を20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。
2. バイアルをホイルで包み、「再構成済み」とラベルを付け、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
3. ヘパリンを含む0.9%生理食塩水を調製する。1バイアルのヘパリンナトリウム(10mLあたり10,000USP単位)の内容物を1Lの二重蒸留水(_ddH2O)で希釈する。
4. 1匹あたり約45mLに十分な量を用意し、4°Cで最大1週間保存してください。
5. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)を作る。
   1. ヒュームフード内で、ホットプレートを50°Cに加熱する。 電子レンジで、ガラスビーカー中のddH2O100mLを約60°Cに加熱する。 マグネチックスターバーを加え、ホットプレートに移す。
   2. ヒュームフード内で、1gのPFAを計量し、ddH2Oのビーカーに加え、0.1125gのNaOH結晶を加え、溶解するまで混合する(5〜10分)。
   3. 0.4gのNaPO_4- 一塩基を添加し、溶解するまで混合する(2〜5分間)。溶液を真空ろ過し、HClおよびNaOHでpHを7.4に調整する。
   4. 氷の上または4°Cで30分間冷やしてから保管してください。
      注:1.5mLのアリコートは、-20°Cで1年間保存することができます。凍結融解サイクルは避けてください。解凍後に溶液が白濁したり、沈殿物が形成されたりした場合は、溶液を使用しないでください。
      警告: 有毒で可燃性です。適切な個人用保護具を着用した換気フードの下でPFAを常に使用してください。
6. 凍結乾燥酵素Aを1mLのバッファーAで再懸濁する。溶液を渦巻き込まないでください。
   注:酵素Aおよび緩衝液Aならびに緩衝液A、Y、およびZは、市販の成人脳解離キット¹⁷の試薬である。
7. 酵素Pを50 μLのアリコートに分割し、エンザイムAを10 μLのアリコートに再懸濁する。キットの説明書に従って、-20 °C で最大 6 か月間保管してください。凍結融解サイクルは避けてください。

2. 実験日

1. 卓上遠心分離機を4°Cに冷却する。
2. PFAのアリコートを冷蔵庫に入れ、徐々に解凍します。
3. 再構成された生/死んだ汚れを暗所(引き出しなど)に置き、室温で解凍します。
4. ウシ血清アルブミン(BSA)バッファーを調製する。カルシウムとマグネシウムを含まない1x Dulbeccoのリン酸緩衝溶液(D-PBS)100 mLに0.5 gのBSAを加えます(pH 7.2)。
5. 攪拌子を加え、攪拌板上で30分間混合する。50mLの円錐管に移し、4°Cで保存する。
   メモ:常に新しく調製したBSAバッファーを使用してください。
6. 生きた/死んだ汚れ作業希釈液を準備します。再構成された生/死汚れストック溶液1 μLを360 μL D-PBSに加え、室温で暗所(引き出しや箱など)に保管します。サンプルあたり50 μLの作業希釈液を調製する。

3. 灌流

1. ヘパリンを含む生理食塩水を氷の上に置きます。
2. 酸素をオンにし、小動物麻酔気化器システムの流量計インジケータボールを1 L /分に設定します。適切な酸素圧力とイソフルランがあることを確認してください。
3. 気化器ダイヤルを3.5%に調整します(誘導とメンテナンス用)。
4. 灌流ポンプラインを生理食塩水/ヘパリン溶液でプライムします。速度を 6 mL/分に設定します。
5. マウスを誘導チャンバーに入れ、ブリーザーをオンにして、マウスが反応しなくなるまで数分待ちます。有害なピンチへのペダルの引き抜きがないことを通して麻酔の十分な深さを確認してください。
6. マウスを背中に乗せて解剖トレイの上に置き、鼻をノーズコーンに入れます。有害なピンチへのペダル離脱の不在による完全な麻酔の二次確認を行う。4本の足をトレイに固定します。
7. 動物の腹部に20%エタノールをスプレーする。
8. 鉗子を使用して、下腹部をつまみ、皮膚を持ち上げます。はさみを使用して、毛皮や皮膚を胸郭の底まで切り取ります。
9. 胸郭の下から各肩に向かって2つの斜めの切開を行います。
10. 横隔膜を慎重に切除する(肺と心臓を避ける)。胸郭を切除して心臓を露出させます。
11. 心臓の周りの結合組織を慎重に切断します。
    注: ステップ 3.10-3.11 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。
12. はさみを使って右心房(心臓の左上にある暗い葉)をクリップします。ブリーザーへのイソフルランの流れをオフにします。
13. 鉗子で心臓をしっかりと保持します。蝶の針の斜めを上に向けて、針を水平に保ちながら左心室を突き刺し、動物と平行にします。
14. 針を所定の位置に保持し、ポンプをオンにし、心臓を離れる液体が不透明になり、肝臓と肺の色が薄くなるまで、少なくとも30mLの生理食塩水/ヘパリン溶液を灌流します。
    注: ステップ 3.13-3.14 は重要です;熟練度と器用さで演奏する。
15. ポンプの電源を切り、針を外し、マウスを解剖領域に移します。

4. 解剖

1. 大きな外科用はさみを使用して、頭を斬首します。
2. 毛皮を頭の後ろから目まで切ります。頭蓋骨を露出させるために皮膚を剥がします。
3. 頭蓋骨を目の間にクリップで留めます。頭蓋骨の後ろ、10時と2時の位置で2つの切り傷を作り、頭蓋骨の矢状線に沿って目の間の元の切り傷まで1つの長い切り傷(脳を傷つけないように先端を上に保ちます)。
4. 鉗子を使用して、頭蓋骨の2つの半分を側面に剥がします。ヘラを使って脳を摘出し、冷たいD-PBSで満たされた氷の上の60mmガラスのペトリ皿に入れます(図1)。
5. メスまたはカミソリを使用して各半球を分離します。その後、嗅球と小脳を取り除きます。
6. 鉗子を使用して、海馬が露出するまで中脳を除去します。
7. 鉗子で脳を固定します。第2の鉗子セットを用いて、各半球から海馬を優しくからかい、両方の海馬を冷たいD-PBSを含む標識された1.5mLチューブに移す。
8. マウス由来の2匹の海馬を入れたサンプルチューブを氷の上に置く。

5.各サンプルの酵素ミックス1と2を準備する

注: 2 mL を超える容量の場合は、10 mL の血清学的ピペットを使用してください。容量については、200 μL-2 mL、1000 μLピペットを使用する。容量21~199 μLの場合は、200 μLのピペットを使用します。容量の場合は、2-20 μL、20 μLのピペットを使用します。2 μL 未満の容量の場合は、0 ~ 2 μL のピペットを使用してください。

1. 各サンプルについて、酵素Pおよび酵素Aのそれぞれ1つのアリコートを室温で解凍する。
2. 酵素ミックス1の場合、標識Cチューブに50 μLの酵素Pと1900 μLのバッファーZを混ぜ合わせます(材料表)。
3. 酵素ミックス2の場合、解凍した10 μLの酵素Aアリコートに20 μLのバッファーYを加えます。

成人脳解離プロトコル¹⁷

メモ: サンプルを扱う場合、特に断りのない限り、BSA および D-PBS が氷上に残っている間、チューブは室温でチューブラックに入れる必要があります。

1. 解離器のスイッチを入れます。
2. 鉗子を使用して海馬組織片をCチューブに移す。
3. 30 μL の酵素ミックス 2 を C チューブに移します。張力が感じられるまでキャップをひねり、カチッと音がするまで締めます。
4. Cチューブを逆さまにして解離器の位置に置きます。サンプルには [選択済み] ステータスが割り当てられます (図 2)。ヒーターをCチューブの上に固定します。
5. フォルダアイコンを押し、 お気に入り フォルダを選択し、スクロールして 37C_ABDK_02 プログラムを選択します。[ OK] をクリックして、選択したすべてのCチューブにプログラムを適用し、[ スタート ]をタップします(図2)。
6. サンプルごとに 1 本の 50 mL 円錐形チューブにラベルを付けます。
7. 各50 mL円錐管に70 μmのセルストレーナーを置き、2 mLのBSAバッファーで濡らします。
8. プログラムが完了したら、解離器からヒーターとCチューブを取り外します。
9. サンプルに4 mLのBSAバッファーを加え、混合物を50 mL円錐形チューブ上のセルストレーナーに塗布します。
10. 10mLのD-PBSをCチューブに加え、それを閉じ、溶液を穏やかに旋回させる。50mLの円錐管のセルストレーナーに塗布します。
11. セルストレーナーとCチューブを捨てます。懸濁液を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 その後、上澄み液を吸引して廃棄する。

7. がれきの除去

1. ペレットを1550μLの冷たいD-PBSで再懸濁し、懸濁液を標識された15mL円錐管に移す。
2. 450 μLの冷たい破片除去溶液とピペットを上下に加えます(渦を巻かないでください)。
   注:破片除去溶液は、市販の成人ブライアン解離キット¹⁷の試薬である。
3. 細胞懸濁液の上に1mLの冷たいD-PBSを静かに重ね合わせ、先端を円錐管の壁に保つ。オーバーレイの合計が 2 mL になるまで繰り返します。
   メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。
4. 3000 x g で4°Cで10分間遠心分離機をフル加速とフルブレーキで行います。
   メモ: フェーズが明確に分離されていない場合は、手順 7.2 ~ 7.3 を繰り返します。1000 x g で最終時間を4°Cで10分間遠心分離する。
5. サスペンションは3つの異なるレイヤーで構成されるようになります(図3)。最上層を吸引します。ピペットチップを前後に掃引して、白い中間層を吸引します。最下層の層を乱すことなく、中間層をできるだけ多く取り除きます。
   メモ: この手順は非常に重要です。熟練度と器用さで演奏する。
6. 2 mL の冷たい D-PBS とピペットを上下に追加して混合します。
7. 1000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキをかけます。上清を吸引して捨てる。ペレットを1mLのBSA緩衝液に再懸濁する。
   注:細胞を適切なバッファーに再懸濁し、磁気標識して単離し、この時点で単一細胞シーケンシングに備えます。

8. セル数

1. 利用可能なセルカウンタの製造元のプロトコルに従ってセルカウントを実行します(1つのオプションは 材料表に記載されています)

9. 生きた/死んだ汚れ

1. 残りの 900 μL (7.7 から) を 1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。
2. サンプルが回転している間は、サンプルごとに1本のフローチューブにラベルを付け、ホイルで包んで光の露出を制限します。
3. 上清を吸引して捨てる。
4. ペレットを50 μLの希釈生/死染み(以前に調製済み)に再懸濁する。
   メモ: この手順は、暗い場所で実行する必要があります。これを実現するには、頭上の部屋の照明を消してください。
5. 各サンプルを対応する標識フローチューブに移し、室温で暗所で8〜10分間インキュベートする(例えば、引き出しまたは箱)。
6. 500 μL の BSA バッファーを加え、1000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、フル加速とフルブレーキを行います。
7. 上清を吸引して捨てる。
   注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。細胞を適切な緩衝液に再懸濁し、ブロックし、この時点で細胞特異的抗体で染色することができる。サンプル・プロトコル¹⁸ については、補足ファイル 1 を参照してください。

10. 固定(オプション)

1. ペレットを200μLの1%PFA(予め調製済み)に再懸濁する。4°Cで15分間インキュベートする。
2. 500 μLのD-PBSを加え、300 x g で遠心分離機で4°Cで10分間洗浄します。
3. 上清を吸引する。
   注:ペレットが見えない場合があります。ペレットを意図せずに吸引しないように、少量のバッファーを残します。
4. ペレットを200 μLのD-PBSに再懸濁し、4°Cで最大3日間保存する。

11. フローサイトメトリー

1. 新しいチューブのフィルターキャップにラベルを付けます。
2. 1mLピペットを用いて、各サンプルをフィルターキャップ上にピペットする。
3. 4 °C で 200 x g で短時間遠心分離し、運転を停止する前に遠心分離機が 200 x g に達するまでだけ許可します。
4. 下流分析のためにフローサイトメトリーコアに進みます。

結果

サンプルをコア施設でフローサイトメーターで処理し、得られたデータをフロー分析用のソフトウェアパッケージで評価しました。以前は、補正コントロール(ライブ/デッドシミとネガティブコントロール)が分析されていました。複数の蛍光色素を使用する場合は、蛍光マイナス1(FMO)コントロールとシングル染色コントロールを抗体ごとに調製する必要があります。実験サンプルについての?...

ディスカッション

この神経解離プロトコルのいくつかのステップは、熟練した技術と器用さ - 灌流、上清吸引、およびミエリン除去を必要とする。灌流プロセスを通して、内臓は無傷のままでいなければなりません(横隔膜を取り除き、心臓をクリッピングすることを除いて)。これには、蝶の針で心臓の上部室を避けることが含まれます。必要なヘパリンを含む生理食塩水の量はさまざまですが、心臓から流?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting