マウス脳海馬組織の機械的解離と酵素的解離の複合

要約

この神経細胞解離プロトコルは、出発物質の量が少ないサンプルを対象としており、オプションの固定および染色ステップで、下流分析用の生存率の高い単一細胞懸濁液を生成します。

要約

この神経解離プロトコル(市販の成人脳解離キットに付随するプロトコルの適応)は、フローサイトメトリーや単一細胞シーケンシングなどの詳細な下流分析の準備として組織処理を最適化します。神経解離は、機械的解離(フィルター、チョッピング技術、またはピペット粉砕の使用など)、酵素消化、またはそれらの組み合わせを介して行うことができる。神経細胞の繊細な性質は、単一細胞分析に必要な最小限の細胞破片で、生存率の高い真の単一細胞懸濁液を得るための努力を複雑にする可能性があります。このデータは、自動化された機械的解離と酵素消化のこの組み合わせが、前述の困難を克服し、常に生存率の高い(>90%)単一細胞懸濁液を生成することを実証する。いくつかのステップでは手作業による器用さが必要ですが、これらのステップはサンプルの取り扱いと潜在的な細胞損失を軽減します。この原稿では、下流の分析に備えて少量の神経組織を首尾よく解離させるために他の研究室を装備するためのプロセスの各ステップを詳述しています。

概要

海馬は、1500年代にボローニャの解剖学者ジュリオ・チェーザレ・アランツィオによって最初に記述^{されました。}この新しく発見された構造に名前を付ける際に、アランツィオはおそらく 海馬¹属のタツノオトシゴとの奇妙な類似性に触発されました。海馬はストレス反応に関与していますが、学習と記憶におけるその役割で広く知られています。より具体的には、海馬は、宣言的および空間的記憶¹の符号化および検索を担当する。

海馬、または適切な海馬は、CA1(cornu ammonis)、CA2、およびCA3サブフィールド¹に分けられます。神経系の他の部分と比較して、海馬は、その可塑性および進行中の神経新生の可能性を含むいくつかのユニークな定義的特徴^{を有する2}。神経新生は、神経幹細胞の増殖および分化のプロセスであり、続いて既存のニューロンネットワークへの統合が続く。神経新生は、歯状回および側脳室(および嗅球)の脳室下帯の顆粒下帯に限定される³。神経新生は胚発生に豊富ですが、それは生涯にわたるプロセスです^3,4

プロトコル

実験は、UAMSの施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された倫理基準に従って実施された。生後6ヶ月の雌性C57Bl6/J野生型マウスを購入し、一定の12時間の明暗サイクル下で集団飼育(ケージあたり4匹)した。

1. 試薬の調製

1. 修正可能な生/死汚れストック溶液を準備します。蛍光染色液を20μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で再構成する。
2. バイアルをホイルで包み、「再構成済み」とラベルを付け、-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
3. ヘパリンを含む0.9%生理食塩水を調製する。1バイアルのヘパリンナトリウム(10mLあたり10,000USP単位)の内容物を1Lの二重蒸留水(_ddH2O)で希釈する。
4. 1匹あたり約45mLに十分な量を用意し、4°Cで最大1週間保存してください。
5. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)を作る。
   1. ヒュームフード内で、ホットプレートを50°Cに加熱する。 電子レンジで、ガラスビーカー中のddH2O100mLを約60°Cに加熱する。 マグネチックスターバーを加え、ホットプレートに移す。
   2. ヒュームフード内で、1gのPFAを計量し、ddH2Oのビーカーに加え、0.1125gのNaOH結晶を加え、溶解するまで混合する(5〜10分)。
   3. 0.4....

結果

サンプルをコア施設でフローサイトメーターで処理し、得られたデータをフロー分析用のソフトウェアパッケージで評価しました。以前は、補正コントロール(ライブ/デッドシミとネガティブコントロール)が分析されていました。複数の蛍光色素を使用する場合は、蛍光マイナス1(FMO)コントロールとシングル染色コントロールを抗体ごとに調製する必要があります。実験サンプルについての?.......

ディスカッション

この神経解離プロトコルのいくつかのステップは、熟練した技術と器用さ - 灌流、上清吸引、およびミエリン除去を必要とする。灌流プロセスを通して、内臓は無傷のままでいなければなりません(横隔膜を取り除き、心臓をクリッピングすることを除いて)。これには、蝶の針で心臓の上部室を避けることが含まれます。必要なヘパリンを含む生理食塩水の量はさまざまですが、心臓から流?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting