Kombinierte mechanische und enzymatische Dissoziation von Hippocampusgewebe des Gehirns der Maus

Zusammenfassung

Dieses neuronale Zelldissoziationsprotokoll ist für Proben mit einer geringen Menge an Ausgangsmaterial vorgesehen und liefert eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse mit optionalen Fixations- und Färbeschritten.

Zusammenfassung

Dieses neuronale Dissoziationsprotokoll (eine Anpassung des Protokolls, das ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene begleitet) optimiert die Gewebeverarbeitung in Vorbereitung auf detaillierte nachgelagerte Analysen wie Durchflusszytometrie oder Einzelzellsequenzierung. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination davon durchgeführt werden. Die heikle Natur neuronaler Zellen kann die Bemühungen erschweren, die hochgradig lebensfähige, echte Einzelzellsuspension mit minimalen Zelltrümmern zu erhalten, die für die Einzelzellanalyse erforderlich ist. Die Daten zeigen, dass diese Kombination aus automatisierter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Aufschluss durchweg zu einer hochgradig lebensfähigen (>90%) Einzelzellsuspension führt, die die oben genannten Schwierigkeiten überwindet. Während einige der Schritte manuelle Geschicklichkeit erfordern, verringern diese Schritte die Probenhandhabung und den potenziellen Zellverlust. Dieses Manuskript beschreibt jeden Schritt des Prozesses, um andere Labors in die Lage zu versetzen, kleine Mengen neuronalen Gewebes in Vorbereitung auf die nachgelagerte Analyse erfolgreich zu dissoziieren.

Einleitung

Der Hippocampus wurde erstmals von einem bolognesischen Anatomen, Giulio Cesare Aranzio, in den 1500er Jahren beschrieben¹. Bei der Benennung dieser neu entdeckten Struktur wurde Aranzio wahrscheinlich von seiner unheimlichen Ähnlichkeit mit dem Seepferdchen der Gattung Hippocampus¹ inspiriert. Der Hippocampus ist an Stressreaktionen beteiligt, ist aber weithin für seine Rolle beim Lernen und Gedächtnis bekannt. Genauer gesagt ist der Hippocampus für die Kodierung und den Abruf des deklarativen und räumlichen Gedächtnisses^{verantwortlich 1}.

Der Hippocampus oder Hippocampus selbst ist in die^Unterfelder CA1 (Cornu Ammonis), CA2 und CA3 1 unterteilt. Im Vergleich zum Rest des Nervensystems weist der Hippocampus mehrere einzigartige definierende Merkmale auf, darunter seine Plastizität und sein Potenzial für die laufende Neurogenese². Neurogenese ist der Prozess der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen, gefolgt von ihrer Integration in das bereits bestehende neuronale Netzwerk. Die Neurogenese ist auf die subgranulare Zone des Gyrus dentatus und die subventrikuläre Zone der lateralen Ventrikel (und der Riechkolben) ^beschränkt3. Während die Neurogenese in der Embryogenese reichlich vorhanden ist, ist es ein lebenslanger Prozess ^3,4. Daher wird sich diese Diskussion auf die adulte Neurogenese im Hippocampus konzentrieren.

Die subventrikulären und subgranularen Zonen sind neurogene Nischen, die ependymale und vaskuläre Zellen sowie unreife und reife Linien neuronaler Stammzellen enthalten⁵. Mikroglia tragen als Immunzellen zu diesen Nischen bei, um die Neurogenese zu regulieren⁶. Neurale Vorläuferzellen sind Nichtstammzell-Nachkommen von neuralen Stammzellen⁷. Drei Arten von neuronalen Vorläufern sind in der subventrikulären Zone vorhanden: radiale gliaartige Typ-B-Zellen, Typ-C-transitverstärkende Vorläufer und Typ-A-Neuroblasten ^3,8. Die sich langsam teilenden neuralen Vorläuferzellen vom Typ B in der subventrikulären Zone können sich in sich schnell teilende Typ-C-Zellen⁸ differenzieren. Anschließend differenzieren sich Typ-C-Zellen in Typ-A-Zellen⁸. Diese Neuroblasten wandern durch den rostralen Migrationsstrom zum Riechkolben, bevor sie sich in Interneuronen oder Oligodendrozyten⁹ differenzieren. Diese Riechkolben-Interneurone sind der Schlüssel zum olfaktorischen Kurzzeitgedächtnis und zum assoziativen Lernen, während die Oligodendrozyten Axone des Corpus callosum⁹ myelinieren. Der Großteil der adulten Neurogenese findet in der subgranularen Zone des Gyrus dentatus statt, wo radiale neurale Vorläufer vom Typ 1 und nichtradialen Typ 2^{gefunden werden 3}. Die meisten neuralen Vorläuferzellen sind dazu bestimmt, zu dentalen Granulatneuronen und Astrozyten¹⁰ zu werden. Durch Gap Junctions verbunden, bilden Astrozyten Netzwerke, um Plastizität, synaptische Aktivität und neuronale Erregbarkeit^zu modulieren 5. Als primäres exzitatorisches Neuron des Gyrus dentatus liefern Körnerzellen Input vom entorhinalen Kortex in die CA3-Region¹¹.

Neuronale Stammzellpopulationen können mit Hilfe von immunmagnetischen oder immunfluoreszierenden Isolationsstrategien^{isoliert werden 12,13}. Neuralgewebe ist besonders schwer zu dissoziieren; Bemühungen, dies zu tun, führen oft zu Proben mit schlechter Zelllebensfähigkeit und / oder nicht zur Herstellung der notwendigen Einzelzellsuspension für die nachgelagerte Analyse. Die neuronale Dissoziation kann durch mechanische Dissoziation (z. B. unter Verwendung von Filtern, Hacktechniken oder Pipettenverreibung), enzymatischer Verdauung oder einer Kombination von Techniken^{durchgeführt werden 14,15}. In einer Studie zur Bewertung neuronaler Dissoziationsmethoden wurden die Lebensfähigkeit und Qualität der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung im Vergleich zu Kombinationen von Pipettenverreibung und Verdauung mit verschiedenen Enzymen^{verglichen 15}. Die Qualität wurde basierend auf der Menge an Zellklumpen und DNA oder subzellulären Ablagerungen in der vorbereiteten Suspension¹⁵ bewertet. Suspensionen von Gliatumoren, die allein einer manuellen mechanischen Dissoziation unterzogen wurden, hatten eine signifikant geringere Zelllebensfähigkeit als Behandlungen mit Dispase oder einer Kombination aus DNase, Kollagenase und Hyaluronidase¹⁵. Volovitz et al. erkannten die Unterschiede in der Lebensfähigkeit und Qualität zwischen den verschiedenen Methoden an und betonten, dass eine unzureichende Dissoziation die Genauigkeit der nachgelagerten Analyse verringern^{kann 15}.

In einer separaten Studie verglichen die Autoren über 60 verschiedene Methoden und Kombinationen der Dissoziation von kultivierten neuronalen Zellen¹⁴. Diese Methoden umfassten acht verschiedene Variationen der manuellen mechanischen Dissoziation durch Pipettenverreibung, einen Vergleich der Inkubation mit fünf einzelnen Enzymen in drei verschiedenen Intervallen und verschiedene Kombinationen der mechanischen Dissoziation mit enzymatischer Verdauung oder die Kombination von zwei Enzymen¹⁴. Keine der mechanischen Methoden ergab eine Einzelzellsuspension¹⁴. Vier der Einzelenzymbehandlungen, zehn der enzymatischen Kombinationsbehandlungen und vier der Kombinationen von mechanischer Dissoziation mit enzymatischer Verdauung ergaben eine Einzelzellsuspension¹⁴. Enzymatischer Aufschluss mit TrypLE, gefolgt von Trypsin-EDTA, dissoziierte Proben am effektivsten¹⁴. Proben, die mit TrypLE und/oder Trypsin-EDTA behandelt wurden, neigten übrigens dazu, gallertartige Klumpen^{zu bilden 14}. Während diese Studie an kultivierten Zellen durchgeführt wurde, spricht sie für die Mängel der Pipettenverreibung oder der enzymatischen Verdauung allein.

Parallele Vergleiche von manueller und automatisierter mechanischer Dissoziation fehlen. Eine Gruppe führte jedoch Durchflusszytometrie durch, um die manuelle und halbautomatische mechanische Dissoziation ganzer Mausgehirne in Verbindung mit kommerziellen Papain- oder Trypsin-Enzymdissoziationskits^{zu vergleichen 16}. Die Verarbeitung mit dem Dissoziator ergab konsistenter lebensfähige Zellen¹⁶. Nach der Dissoziation isolierten die Autoren auch Prominin-1-Zellen, neuronale Vorläuferzellen und Mikroglia¹⁶. Für zwei der drei isolierten Zellpopulationen war die Reinheit der isolierten Zellen etwas höher, wenn Proben mit dem Dissoziator verarbeitet wurden, verglichen mit^{manuell 16}. Reiß et al. stellten fest, dass die Variabilität von Mensch zu Mensch in der Pipettiertechnik die Reproduzierbarkeit der lebensfähigen Zellpopulationsausbeute bei der Gewebedissoziation behindert¹⁶. Die Autoren folgerten, dass die automatisierte mechanische Dissoziation die Probenverarbeitung^{standardisiert 16}.

Die in diesem Manuskript beschriebene Methode der Dissoziation ist eine Kombination aus vollautomatischer mechanischer Dissoziation und enzymatischer Verdauung unter Verwendung von Lösungen, die ein kommerzielles Dissoziationskit für Erwachsene¹⁷ begleiten. Im Gegensatz zu Standardprotokollen reduziert dieses optimierte Protokoll die Probenmanipulation, ergibt eine hochgradig lebensfähige Einzelzellsuspension und ist für die Verarbeitung minimaler Mengen an Ausgangsgewebe vorgesehen.

Protokoll

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UAMS genehmigt wurden. 6 Monate alte weibliche C57Bl6/J-Wildtyp-Mäuse wurden gekauft und in Gruppen (4 Mäuse pro Käfig) unter einem konstanten Hell/Dunkel-Zyklus von 12 h untergebracht.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Bereiten Sie eine reparierbare Lebend-/Totflecken-Lagerlösung vor. Rekonstituieren Sie die fluoreszierende Färbung mit 20 μL Dimethylsulfoxid (DMSO).
2. Wickeln Sie die Durchstechflasche in Folie ein, kennzeichnen Sie sie als "Rekonstituiert" und lagern Sie sie bis zu sechs Monate bei -20 °C.
3. Bereiten Sie eine 0,9% ige Salzlösung mit Heparin vor. Verdünnen Sie den Inhalt einer Durchstechflasche Heparinnatrium (10.000 USP-Einheiten pro 10 ml) in 1 l doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O).
4. Bereiten Sie genug für ca. 45 ml pro Tier vor und lagern Sie es bei 4 ° C für bis zu einer Woche.
5. Machen Sie 1% Paraformaldehyd (PFA).
   1. In einem Abzug eine Kochplatte auf 50 °C erhitzen. In einer Mikrowelle 100 ml ddH₂O in einem Glasbecherglas auf ca. 60 °C erhitzen. Fügen Sie eine magnetische Rührstange hinzu und geben Sie sie auf die Heizplatte.
   2. Im Abzug 1 g PFA abwägen und in das Becherglas von ddH₂O geben. 0,1125 g NaOH-Kristalle hinzufügen und mischen, bis sie sich aufgelöst haben (5-10 min).
   3. 0,4 g NaPO_4- monobasic zugeben und bis zur Auflösung (2-5 min) mischen. Vakuumfiltern Sie die Lösung und stellen Sie den pH-Wert mit HCl und NaOH auf 7,4 ein.
   4. Vor der Lagerung 30 min auf Eis oder bei 4°C abkühlen lassen.
      HINWEIS: Aliquots von 1,5 ml können ein Jahr lang bei -20 °C gelagert werden. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen. Wenn die Lösung nach dem Auftauen trüb wird oder sich ein Niederschlag gebildet hat, sollte die Lösung nicht verwendet werden.
      VORSICHT: Giftig, brennbar. Arbeiten Sie immer mit PFA unter einer belüfteten Kapuze und tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung.
6. Resuspendiert das lyophilisierte Enzym A mit 1 ml Puffer A. Wirbeln Sie die Lösung nicht ein.
   HINWEIS: Enzym A und Puffer A sowie die Puffer A, Y und Z sind Reagenzien im kommerziellen Adult Brain Dissociation Kit¹⁷.
7. Teilen Sie Enzym P in Aliquote von 50 μL und resuspendieren Sie Enzym A in 10 μL Aliquote. Gemäß den Anweisungen des Kits bis zu sechs Monate bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen.

2. Tag des Experiments

1. Die Tischzentrifuge wird auf 4 °C abgekühlt.
2. Legen Sie Aliquot(s) von PFA in den Kühlschrank, um es allmählich aufzutauen.
3. Legen Sie den rekonstituierten lebenden/toten Fleck ins Dunkel (z. B. eine Schublade), um ihn bei Raumtemperatur aufzutauen.
4. Bereiten Sie den Puffer für Rinderserumalbumin (BSA) vor. 0,5 g BSA zu 100 ml 1x Dulbeccos phosphatgepufferter Lösung ohne Kalzium und Magnesium (D-PBS), pH 7,2, zugeben.
5. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und mischen Sie ihn 30 min auf einer Rührplatte. Auf 50 ml konische Rohre umfüllen und bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer frisch zubereiteten BSA-Puffer.
6. Bereiten Sie die Verdünnung der Lebend-/Totfleckenarbeit vor. 1 μL der rekonstituierten Lebend-/Totflecken-Stammlösung in 360 μL D-PBS geben und bei Raumtemperatur im Dunkeln lagern (z. B. eine Schublade oder Box). Bereiten Sie 50 μL der Arbeitsverdünnung pro Probe vor.

3. Perfusion

1. Die Salzlösung mit Heparin auf Eis legen.
2. Schalten Sie den Sauerstoff ein und stellen Sie die Durchflussmesseranzeige am Kleintier-Anästhesie-Verdampfersystem auf 1 L / min ein. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstoffdruck und das Isofluran ausreichend vorhanden sind.
3. Stellen Sie das Vaporizer-Zifferblatt auf 3,5% ein (für Induktion und Wartung).
4. Grundieren Sie die Perfusionspumpenleitungen mit der Kochsalzlösung/Heparin-Lösung. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 6 ml/min ein.
5. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer, schalten Sie die Entlüftung ein und warten Sie einige Minuten, bis die Maus nicht mehr reagiert. Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Pedalentzugs bis hin zu schädlicher Prise.
6. Legen Sie die Maus auf den Rücken auf das Dissektionstablett mit der Nase im Nasenkonus. Führen Sie eine sekundäre Bestätigung der Vollnarkose durch das Fehlen eines Pedalentzugs zu schädlicher Prise durch. Heften Sie alle vier Pfoten an das Tablett an.
7. Besprühen Sie den Bauch des Tieres mit 20% Ethanol.
8. Kneifen Sie mit einer Pinzette den Unterbauch ein und heben Sie die Haut an. Verwenden Sie eine Schere, um Fell und Haut bis zum Boden des Brustkorbs zu durchschneiden.
9. Machen Sie zwei diagonale Schnitte von unterhalb des Brustkorbs zu jeder Schulter.
10. Sezieren Sie vorsichtig das Zwerchfell (vermeiden Sie die Lunge und das Herz). Sezieren Sie den Brustkorb, um das Herz freizulegen.
11. Durchtrennen Sie vorsichtig das Bindegewebe um das Herz.
    HINWEIS: Die Schritte 3.10-3.11 sind kritisch. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch.
12. Verwenden Sie die Schere, um den rechten Vorhof (dunkler Lappen oben links im Herzen) zu beschneiden. Schalten Sie den Fluss von Isofluran zum Entlüfter aus.
13. Halten Sie das Herz mit einer Pinzette stabil. Durchbohren Sie mit der Fase der Schmetterlingsnadel nach oben den linken Ventrikel, während Sie die Nadel auf gleicher und parallel zum Tier halten.
14. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle, schalten Sie die Pumpe ein und durchbluten Sie mindestens 30 ml der Kochsalzlösung / Heparinlösung, bis die Flüssigkeit, die das Herz verlässt, undurchsichtig ist und Leber und Lunge blass sind.
    HINWEIS: Die Schritte 3.13-3.14 sind kritisch. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch.
15. Schalten Sie die Pumpe aus, entfernen Sie die Nadel und bringen Sie die Maus in den Dissektionsbereich.

4. Sezieren

1. Enthaupten Sie den Kopf mit einer großen chirurgischen Schere.
2. Schneiden Sie das Fell vom Hinterkopf bis zu den Augen. Schälen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen.
3. Befestigen Sie den Schädel zwischen den Augen. Machen Sie zwei Schnitte an der Rückseite des Schädels, an der 10- und 2-Uhr-Position, dann machen Sie einen langen Schnitt (halten Sie die Spitzen hoch, um das Gehirn nicht zu schädigen) entlang der mittleren Linie des Schädels bis zum ursprünglichen Schnitt zwischen den Augen.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um die beiden Schädelhälften an den Seiten abzuschälen. Verwenden Sie einen Spatel, um das Gehirn zu entfernen, und legen Sie es in eine 60 mm große Petrischale aus Glas auf Eis, das mit kaltem D-PBS gefüllt ist (Abbildung 1).
5. Verwenden Sie ein Skalpell oder Rasiermesser, um jede Hemisphäre zu trennen. Entfernen Sie dann die Riechkolben und das Kleinhirn.
6. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Mittelhirn zu entfernen, bis der Hippocampus freigelegt ist.
7. Sichern Sie das Gehirn mit einer Pinzette. Mit einer zweiten Pinzette den Hippocampus vorsichtig aus jeder Hemisphäre herauskitzeln und beide Hippocampi auf eine markierte 1,5-ml-Röhre mit kaltem D-PBS übertragen.
8. Legen Sie das Probenröhrchen mit den beiden Hippocampi der Maus auf Eis.

5. Bereiten Sie Enzymmischung 1 und 2 für jede Probe vor

HINWEIS: Für Volumina größer als 2 ml verwenden Sie eine serologische Pipette von 10 ml. Für Volumina von 200 μL-2 ml verwenden Sie eine 1000 μL-Pipette; Für Volumina von 21-199 μL verwenden Sie eine 200 μL Pipette; Für Volumina von 2-20 μL verwenden Sie eine 20 μL Pipette; Für Volumina unter 2 μL verwenden Sie eine Pipette von 0-2 μL.

1. Für jede Probe tauen Sie je ein Aliquot von Enzym P und Enzym A bei Raumtemperatur auf.
2. Für Enzymmischung 1 kombinieren Sie 50 μL Enzym P und 1900 μL Puffer Z in einem markierten C-Rohr (Tabelle der Materialien).
3. Für Enzymmischung 2 fügen Sie 20 μL Puffer Y zu dem aufgetauten 10 μL Aliquot von Enzym A hinzu.

6. Dissoziationsprotokoll des Gehirns bei Erwachsenen¹⁷

HINWEIS: Bei der Arbeit mit Proben sollten die Röhrchen bei Raumtemperatur in ein Röhrchenrack gelegt werden, während BSA und D-PBS auf Eis bleiben, sofern nicht anders angegeben.

1. Schalten Sie den Dissoziator ein.
2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hippocampi-Gewebestücke in die C-Röhre zu übertragen.
3. Übertragen Sie 30 μL Enzymmischung 2 in die C-Röhre. Drehen Sie die Kappe, bis die Spannung spürbar ist, und ziehen Sie sie dann fest, bis sie klickt.
4. Stellen Sie die C-Röhre kopfüber in eine Position des Dissoziators; Dem Beispiel wird der Status Ausgewählt zugewiesen (Abbildung 2). Befestigen Sie die Heizung über dem C-Rohr.
5. Drücken Sie das Ordnersymbol, wählen Sie Favoritenordner, scrollen Sie zum 37C_ABDK_02 Programm und wählen Sie es aus. Klicken Sie auf OK, um das Programm auf alle ausgewählten C-Röhren anzuwenden, und tippen Sie dann auf Start (Abbildung 2).
6. Beschriften Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen pro Probe.
7. Legen Sie ein 70 μm Zellsieb auf jedes 50 ml konische Rohr und befeuchten Sie es mit 2 ml BSA-Puffer.
8. Entfernen Sie nach Abschluss des Programms die Heizung und den C-Schlauch aus dem Dissoziator.
9. Geben Sie 4 ml BSA-Puffer in die Probe und tragen Sie die Mischung auf das Zellsieb auf dem 50 ml konischen Röhrchen auf.
10. Fügen Sie 10 ml D-PBS zum C-Rohr hinzu, schließen Sie es und schwenken Sie die Lösung vorsichtig. Tragen Sie es auf das Zellsieb auf dem 50 ml konischen Schlauch auf.
11. Entsorgen Sie das Zellsieb und die C-Röhre. Zentrifen Sie die Suspension bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Dann aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.

7. Entfernung von Ablagerungen

1. Resuspendiert das Pellet mit 1550 μL kaltem D-PBS und überträgt die Suspension auf ein beschriftetes 15 mL konisches Röhrchen.
2. Fügen Sie 450 μL kalte Schmutzentfernungslösung hinzu und pipettieren Sie sie auf und ab (nicht vorwirbeln).
   HINWEIS: Debris Removal Solution ist ein Reagenz im kommerziellen Adult Brian Dissociation Kit¹⁷.
3. Überlagern Sie vorsichtig 1 ml kaltes D-PBS auf die Zellsuspension und halten Sie die Spitze an der Wand des konischen Rohrs. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Gesamtüberlagerung 2 ml beträgt.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch.
4. Zentrifuge bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse.
   HINWEIS: Wenn die Phasen nicht klar voneinander getrennt sind, wiederholen Sie die Schritte 7.2-7.3. Zentrifugieren Sie ein letztes Mal bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Die Aufhängung sollte nun aus drei verschiedenen Schichten bestehen (Abbildung 3). Saugen Sie die oberste Schicht ab. Streichen Sie die Pipettenspitze hin und her, um die weiße Mittelschicht abzusaugen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der mittleren Schicht, ohne die unterste Schicht zu stören.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Führen Sie mit Können und Geschicklichkeit durch.
6. Fügen Sie 2 ml kaltes D-PBS hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um zu mischen.
7. Zentrifuge bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn. Resuspendiert das Pellet in 1 ml BSA-Puffer.
   HINWEIS: Zellen können im entsprechenden Puffer resuspendiert und dann magnetisch markiert und isoliert werden, um sich auf die Einzelzellsequenzierung vorzubereiten.

8. Anzahl der Zellen

1. Führen Sie die Zellzählung gemäß dem Protokoll des Herstellers des verfügbaren Zellzählers durch (eine Option ist in der Materialtabelle angegeben)

9. Lebender/toter Fleck

1. Die restlichen 900 μL (ab 7,7) bei 1000 x g zentrifugieren für 10 min bei 4 °C mit voller Beschleunigung und voller Bremse.
2. Während sich die Probe dreht, beschriften Sie ein Durchflussröhrchen pro Probe und wickeln Sie es in Folie, um die Lichteinwirkung zu begrenzen.
3. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.
4. Resuspendiert das Pellet in 50 μL verdünnter lebender/toter Flecken (zuvor zubereitet).
   HINWEIS: Dieser Schritt sollte bei schlechten Lichtverhältnissen ausgeführt werden. Schalten Sie die Oberlichter aus, um dies zu erreichen.
5. Geben Sie jede Probe in das entsprechende markierte Durchflussröhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 8-10 min im Dunkeln (z. B. eine Schublade oder eine Box).
6. Zugabe von 500 μL BSA-Puffer und Zentrifuge bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C bei voller Beschleunigung und voller Bremse.
7. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.
   HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar; Lassen Sie eine kleine Menge Puffer zurück, um das Pellet nicht unbeabsichtigt abzusaugen. Zellen können im entsprechenden Puffer resuspendiert, blockiert und an dieser Stelle mit zellspezifischen Antikörpern angefärbt werden. Siehe Ergänzende Datei 1 für Beispielprotokoll¹⁸.

10. Fixierung (optional)

1. Resuspendiert das Pellet in 200 μL von 1% PFA (zuvor zubereitet). 15 min bei 4 °C inkubieren.
2. Waschen durch Zugabe von 500 μL D-PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
3. Aspirieren Sie den Überstand.
   HINWEIS: Das Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar; Lassen Sie eine kleine Menge Puffer zurück, um das Pellet nicht unbeabsichtigt abzusaugen.
4. Resuspendiert das Pellet in 200 μL D-PBS und lagert es bei 4 °C für bis zu 3 Tage.

11. Durchflusszytometrie

1. Beschriften Sie die Filterkappen auf den neuen Röhrchen.
2. Mit einer 1-ml-Pipette pipettieren Sie jede Probe auf die Filterkappe.
3. Zentrifugieren Sie kurz bei 200 x g bei 4 °C, so dass die Zentrifuge nur 200 x g erreichen kann, bevor der Lauf gestoppt wird.
4. Fahren Sie mit dem Durchflusszytometriekern für die nachgelagerte Analyse fort.

Ergebnisse

Die Proben wurden mit einem Durchflusszytometer in einer Kernanlage verarbeitet und die resultierenden Daten wurden mit einem Softwarepaket für die Durchflussanalyse ausgewertet. Zuvor wurden Kompensationskontrollen analysiert - der lebende / tote Fleck und die Negativkontrolle. Wenn mehrere Fluorochrome verwendet werden, sollten für jeden Antikörper Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) und Einzelfleckenkontrollen vorbereitet werden. Die Kompensation der spektralen Überlappung für die experimentellen Proben wurde...

Diskussion

Mehrere Schritte in diesem neuronalen Dissoziationsprotokoll erfordern eine kompetente Technik und Geschicklichkeit - Perfusion, Überstandsaspiration und Myelinentfernung. Während des gesamten Perfusionsprozesses müssen die inneren Organe intakt bleiben (abgesehen vom Entfernen des Zwerchfells und dem Abschneiden des Herzens); Dazu gehört, die oberen Kammern des Herzens mit der Schmetterlingsnadel zu vermeiden. Während die Menge an Kochsalzlösung, die mit Heparin benötigt wird, variiert, zeigt transparente Flüssi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting