Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול דיסוציאציה של תאים עצביים זה מיועד לדגימות עם כמות נמוכה של חומר התחלתי ומניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר לניתוח במורד הזרם, עם שלבי קיבוע וצביעה אופציונליים.

Abstract

פרוטוקול דיסוציאציה עצבית זה (התאמה של הפרוטוקול המלווה בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר) מייעל את עיבוד הרקמות כהכנה לניתוח מפורט במורד הזרם כגון ציטומטריה של זרימה או ריצוף של תא בודד. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי או שילוב שלהם. האופי העדין של תאי העצב יכול לסבך את המאמצים להשיג את ההשעיה החד-תאית האמיתית, בעלת הכדאיות הגבוהה ביותר, עם פסולת תאית מינימלית הנדרשת לניתוח של תאים בודדים. הנתונים מראים כי שילוב זה של דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי מניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר (>90%), תוך התגברות על הקשיים הנ"ל. בעוד שכמה מהשלבים דורשים מיומנות ידנית, שלבים אלה מפחיתים את הטיפול בדגימות ואת אובדן התא הפוטנציאלי. כתב יד זה מפרט כל שלב בתהליך כדי לצייד מעבדות אחרות כדי לנתק בהצלחה כמויות קטנות של רקמות עצביות כהכנה לניתוח במורד הזרם.

Introduction

ההיפוקמפוס תואר לראשונה על ידי אנטומיסט בולונזי, ג'וליו צ'זארה ארנציו, בשנות ה-1500 שלהמאה ה-15. במתן שם למבנה החדש הזה, ארנציו ככל הנראה קיבל השראה מהדמיון המובהק שלו לסוסון הים של הסוג היפוקמפוס1. ההיפוקמפוס מעורב בתגובות עקה אך ידוע בתפקידו בלמידה ובזיכרון. ליתר דיוק, ההיפוקמפוס אחראי על קידוד ואחזור של זיכרון הצהרתי ומרחבי1.

ההיפוקמפוס, או ההיפוקמפוס עצמו, מחולק לתת-שדות CA1 (cornu ammonis), CA2 ו-CA31. בהשוואה לשאר מערכת העצבים, להיפוקמפוס יש מספר מאפיינים מגדירים ייחודיים, כולל הפלסטיות שלו והפוטנציאל לנוירוגנזה מתמשכת2. נוירוגנזה היא תהליך ההתפשטות וההתמיינות של תאי גזע עצביים, ולאחר מכן השתלבותם ברשת העצבית הקיימת. נוירוגנזה מוגבלת לאזור התת-גרנולרי של הג'ירוס המשונן ולאזור התת-חדרי של החדרים הצדדיים (ונורות חוש הריח)3. בעוד שנוירוגנזה נפוצה באמבריוגנזה, זהו תהליך לכל החיים 3,4. ככזה, דיון זה יתמקד בנוירוגנזה של מבוגרים בהיפוקמפוס.

האזורים התת-חדריים והתת-גרנולאריים הם נישות נוירוגניות המכילות תאים אפנדימליים וסקולריים, כמו גם שושלות לא בוגרות ובשלות של תאי גזע עצביים5. מיקרוגליה תורמת לנישות אלה כתאי מערכת החיסון לווסת את הנוירוגנזה6. תאי אב עצביים הם צאצאים של תאי גזע עצבייםשאינם תאי מערכתם של תאי גזע עצביים 7. שלושה סוגים של אבות עצביים נמצאים באזור התת-חדרי: תאים דמויי גליה רדיאליים מסוג B, אבות מגבירי מעבר מסוג C ונוירובלסטים מסוג A 3,8. תאי האב העצביים מסוג B המתחלקים באיטיות באזור התת-חדרי יכולים להתמיין לתאים מסוג C המתחלקים במהירות8. לאחר מכן, תאים מסוג C מתמיינים לתאים מסוג A8. נוירובלסטים אלה נודדים דרך הזרם הנודד הרוסטרלי אל נורת חוש הריח לפני שהם מתמיינים לאינטרנאורונים או לאוליגודנדרוציטים9. פקעות חוש הריח האלה הן המפתח לזיכרון לטווח קצר של חוש הריח, וללמידה אסוציאטיבית, בעוד שהאוליגודנדרוציטים מיאלינטים אקסונים של קורפוס קלוסום9. רוב הנוירוגנזה הבוגרת מתרחשת באזור התת-גרנולרי של הפיתול המשונן, שם נמצאים אבות עצביים רדיאליים מסוג 1 ו-nonradial Type 23. רוב תאי האב העצביים מיועדים להפוך לנוירונים גרגיריים משוננים ואסטרוציטים10. מחוברים על ידי צמתים מרווחים, אסטרוציטים יוצרים רשתות כדי לווסת את הפלסטיות, הפעילות הסינפטית וההתרגשות העצבית5. כנוירון המעורר העיקרי של הפיתול המשונן, תאי גרגירים מספקים קלט מקליפת המוח האנטורינלית לאזור CA311.

ניתן לבודד אוכלוסיות תאי גזע עצביים באמצעות אסטרטגיות בידוד אימונומגנטיות או אימונופלואורסצנטיות12,13. רקמה עצבית קשה במיוחד לניתוק; מאמצים לעשות זאת גורמים לעתים קרובות לדגימות עם כדאיות תאית ירודה ו/או לא מצליחים לייצר את ההשעיה החד-תאית הדרושה לניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עצבית יכולה להתבצע באמצעות דיסוציאציה מכנית (כגון שימוש במסננים, טכניקות חיתוך או טריטורציה של פיפטה), עיכול אנזימטי, או שילוב של טכניקות14,15. במחקר שהעריך שיטות דיסוציאציה עצבית, הכדאיות והאיכות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה פיפטה לעומת שילובים של טריטורציה פיפטה ועיכול עם אנזימים שונים הושוו15. האיכות דורגה על סמך כמות גושי התאים והדנ"א או הפסולת התת-תאית בתרחיף המוכן15. השעיות של גידולי גליה שהיו נתונים לדיסוציאציה מכנית ידנית בלבד היו בעלות יכולת נמוכה משמעותית של התאים בהשוואה לטיפולים עם דיספוזה או שילוב של DNase, collagenase ו-hyaluronidase15. Volovitz et al. הכירו בשונות הכדאיות והאיכות בין השיטות השונות והדגישו כי דיסוציאציה לא מספקת עלולה להפחית את הדיוק של ניתוח במורד הזרם15.

במחקר נפרד, המחברים השוו יותר מ-60 שיטות ושילובים שונים של דיסוציאציה של תאי עצב בתרבית14. שיטות אלה כללו שמונה וריאציות שונות של דיסוציאציה מכנית ידנית על ידי טריטורציה של פיפטה, השוואה של דגירה עם חמישה אנזימים בודדים בשלושה מרווחי זמן שונים, ושילובים שונים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי או שילוב של שני אנזימים14. אף אחת מהשיטות המכניות לא הניבה השעיה חד-תאית14. ארבעה מהטיפולים באנזים יחיד, עשרה מהטיפולים האנזימטיים המשולבים וארבעה מהשילובים של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי הניבו תרחיף חד-תאי14. עיכול אנזימטי עם TripLE ואחריו Tripsin-EDTA ביעילות היעילה ביותר ניתוק דגימות14. אגב, דגימות שטופלו ב-TrypLE ו/או ב-Trypsin-EDTA נטו ליצור גושים ג'לטיניים14. בעוד שמחקר זה בוצע על תאים בתרבית, הוא מדבר על החסרונות של טריטורציה פיפטה או עיכול אנזימטי בלבד.

חסרות השוואות זו לצד זו של דיסוציאציה מכנית ידנית לעומת אוטומציה. עם זאת, קבוצה אחת הפעילה ציטומטריית זרימה כדי להשוות דיסוציאציה מכנית ידנית ואוטומטית למחצה של מוחות עכברים שלמים בשילוב עם ערכות דיסוציאציה אנזימטיות מסחריות של פפאין או טריפסין16. עיבוד עם הדיסוציאטור הניב באופן עקבי יותר תאים בני קיימא16. בעקבות הדיסוציאציה, החוקרים בודדו גם תאי פרומינין-1, תאים מקדימים עצביים ומיקרוגליה16. עבור שתיים מתוך שלוש אוכלוסיות התאים המבודדים, טוהר התאים המבודדים היה מעט גבוה יותר כאשר הדגימות עובדו עם הדיסוציאטור, בהשוואהל-16 באופן ידני. Reiß et al. ציינו כי השתנות מאדם לאדם בטכניקת הצינורות מעכבת את יכולת השכפול של תפוקת אוכלוסיית התאים בת-קיימא בדיסוציאציה של רקמות16. החוקרים הגיעו למסקנה כי דיסוציאציה מכנית אוטומטית מתקננת עיבוד דגימות16.

שיטת הדיסוציאציה המתוארת בכתב יד זה היא שילוב של דיסוציאציה מכנית אוטומטית לחלוטין ועיכול אנזימטי, תוך שימוש בתמיסות המלוות בערכת דיסוציאציה מסחרית של המוח הבוגר17. בניגוד לפרוטוקולים סטנדרטיים, פרוטוקול מותאם זה מפחית מניפולציה של דגימות, מניב תרחיף חד-תאי בר-קיימא ביותר ומיועד לעיבוד כמויות מינימליות של רקמת התחלה.

Protocol

הניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת UAMS. נקבה בת 6 חודשים C57Bl6/J של עכברים מסוג בר נרכשו ושוכנו בקבוצות (4 עכברים לכלוב) תחת מחזור קבוע של 12 שעות של אור/חושך.

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכינו תמיסת מלאי כתמים חיים/מתים הניתנת לתיקון. שחזרו את הכתם הפלואורסצנטי עם 20 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  2. עטפו את הבקבוקון בנייר כסף, תייגו אותו כ-"Reconstituted", ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים.
  3. מכינים תמיסת מלח של 0.9% עם הפרין. דיללו את תכולתו של בקבוקון אחד של נתרן הפרין (10,000 יחידות USP לכל 10 מ"ל) ב-1 ליטר של מים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  4. הכן מספיק עבור כ 45 מ"ל לכל חיה ולאחסן ב 4 ° C למשך עד שבוע.
  5. הפוך 1% paraformaldehyde (PFA).
    1. במכסה אדים, מחממים צלחת חמה ל-50 מעלות צלזיוס. במיקרוגל, מחממים 100 מ"ל של ddH2O בכוס זכוכית לכ-60 מעלות צלזיוס. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי והעבירו לפלטה החמה.
    2. במכסה האדים, שוקלים 1 גרם של PFA ומוסיפים לכוס של ddH2O. מוסיפים 0.1125 גרם של גבישי NaOH ומערבבים עד להמסה (5-10 דקות).
    3. מוסיפים 0.4 גרם של NaPO4- מונובאסי ומערבבים עד להמסה (2-5 דקות). ואקום מסנן את התמיסה והתאים את ה-pH ל-7.4 עם HCl ו-NaOH.
    4. מצננים על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני האחסון.
      הערה: ניתן לאחסן Aliquots של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -20 °C (75 °F) למשך שנה אחת. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה. אם, לאחר ההפשרה, התמיסה הופכת לעכורה או שנוצר משקע, אין להשתמש בתמיסה.
      אזהרה: רעיל, דליק. תמיד לעבוד עם PFA מתחת למכסה מנוע מאוורר כשהוא לובש ציוד מגן אישי מתאים.
  6. אנזים ליופילי A עם 1 מ"ל של חיץ A. אל תסובבו את הפתרון.
    הערה: אנזים A ו-Buffer A, כמו גם Buffers A, Y ו-Z, הם ריאגנטים בערכת הדיסוציאציה המסחרית של המוח למבוגרים17.
  7. מחלקים את אנזים P לאליקוטים של 50 μL ומחזירים את אנזים A ל-10 μL aliquots. לפי הוראות הערכה, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה.

2. יום הניסוי

  1. מצנן את הצנטריפוגה השולחנית ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. יש להניח את ה-aliquot(ים) של PFA במקרר להפשרה הדרגתית.
  3. הניחו את הכתם החי/מת המשוחזר בחושך (למשל, מגירה) כדי להפשיר בטמפרטורת החדר.
  4. מכינים את מאגר אלבומין בסרום בקר (BSA). הוסיפו 0.5 גרם של BSA ל-100 מ"ל של תמיסה 1x של דולבקו עם מאגר פוספט ללא סידן ומגנזיום (D-PBS), pH 7.2.
  5. מוסיפים מוט ערבוב ומערבבים על צלחת ערבוב למשך 30 דקות. מעבירים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: השתמש תמיד במאגר BSA שהוכן טרי.
  6. הכינו דילול עבודה של כתם חי/מת. הוסיפו 1 μL של תמיסת מלאי הכתמים החיים/מתים המשוחזרת ל-360 μL D-PBS ואחסנו אותה בחושך (למשל, מגירה או קופסה) בטמפרטורת החדר. הכן 50 μL של דילול העבודה לכל מדגם.

3. פרפוזיה

  1. מניחים את תמיסת המלח עם הפרין על הקרח.
  2. הפעל חמצן, הגדר את כדור מחוון מד הזרימה במערכת אידוי הרדמה של בעלי חיים קטנים ל-1 ליטר לדקה. ודא שיש לחץ חמצן ואיזופלורן מספיקים.
  3. התאם את חוגת מכשיר האידוי ל-3.5% (לצורך אינדוקציה ותחזוקה).
  4. הקדמו את קווי משאבת הזלוף בעזרת תמיסת המלח/הפרין. הגדר את המהירות ל- 6 מ"ל לדקה.
  5. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה, הפעילו את מכשיר הנשימה והמתינו מספר דקות עד שהעכבר לא מגיב. לאשר עומק מספיק של הרדמה באמצעות היעדר נסיגה דוושה לצביטה מזיקה.
  6. הניחו את העכבר על גבו על מגש הנתיחה עם אפו בקונוס האף. בצע אישור משני של הרדמה מלאה באמצעות היעדר נסיגה מדוושה לצביטה מזיקה. הצמידו את כל ארבע כפות הרגליים למגש.
  7. מרססים את בטנה של החיה ב-20% אתנול.
  8. באמצעות מלקחיים, לצבוט את הבטן התחתונה ולהרים את העור. השתמש במספריים כדי לחתוך דרך פרווה ועור לתחתית בית החזה.
  9. בצע שני חתכים אלכסוניים מתחת לכל צלעות לכיוון כל כתף.
  10. בזהירות לנתח את הסרעפת (הימנעות הריאות והלב). נתחו את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
  11. נתקו בזהירות כל רקמת חיבור סביב הלב.
    הערה: שלבים 3.10-3.11 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות.
  12. השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני (אונה כהה בפינה השמאלית העליונה של הלב). כבה את זרימת האיזופלורן לנשימה.
  13. החזיקו את הלב יציב עם מלקחיים. כאשר שיפוע מחט הפרפר פונה כלפי מעלה, חודרים את החדר השמאלי תוך שמירה על מפלס המחט ומקביל לחיה.
  14. החזיקו את המחט במקומה, הפעילו את המשאבה והניחו לפחות 30 מ"ל של תמיסת המלח/הפרין עד שהנוזל היוצא מהלב אטום וצבע הכבד והריאות מחווירים בצבעם.
    הערה: שלבים 3.13-3.14 הם קריטיים; לבצע במיומנות ובמיומנות.
  15. כבה את המשאבה, הסר את המחט והעביר את העכבר לאזור הנתיחה.

4. דיסקציה

  1. באמצעות מספריים כירורגיים גדולים, ערפו את הראש.
  2. חותכים את הפרווה מהחלק האחורי של הראש עד לעיניים. מקלפים את העור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.
  3. גזרו את הגולגולת בין העיניים. בצע שני חתכים בחלק האחורי של הגולגולת, בתנוחות השעה 10 ו-2, ולאחר מכן בצע חתך אחד ארוך (שמור על קצוות למעלה כדי למנוע פגיעה במוח) לאורך הקו האמצעי של הגולגולת עד לחתך המקורי בין העיניים.
  4. השתמשו במלקחיים כדי לקלף את שני חצאי הגולגולת לצדדים. השתמשו במרית כדי להסיר את המוח ולהכניס אותו לתוך צלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ על קרח מלא ב-D-PBS קר (איור 1).
  5. השתמש באזמל או סכין גילוח כדי להפריד כל חצי כדור. לאחר מכן להסיר את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן.
  6. השתמש במלקחיים כדי להסיר את המוח האמצעי עד שההיפוקמפוס נחשף.
  7. אבטח את המוח באמצעות מלקחיים. באמצעות קבוצה שנייה של מלקחיים, מקניטים בעדינות את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור, ומעבירים את שני ההיפוקמפי לצינור 1.5 מ"ל המסומן 1.5 מ"ל המכיל D-PBS קר.
  8. הניחו את צינור הדגימה המכיל את שני ההיפוקמפי מהעכבר על הקרח.

5. הכינו תערובת אנזימים 1 ו-2 לכל דגימה

הערה: עבור נפחים הגדולים מ-2 מ"ל, השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מ"ל; עבור נפחים, 200 μL-2 מ"ל, להשתמש פיפטה 1000 μL; עבור נפחים, 21-199 μL, להשתמש פיפטה 200 μL; עבור נפחים, 2-20 μL, להשתמש פיפטה 20 μL; עבור נפחים מתחת ל-2 μL, השתמש בפיפטה של 0-2 μL.

  1. עבור כל דגימה, הפשירו אליקוט אחד לכל אחד מאנזים P ואנזים A בטמפרטורת החדר.
  2. עבור תערובת אנזימים 1, שלבו 50 μL של אנזים P ו-1900 μL של Buffer Z בצינור C המסומן (טבלת חומרים).
  3. עבור תערובת אנזימים 2, הוסיפו 20 μL של Buffer Y ל-10 μL המופשרים של אנזים A.

6. פרוטוקול דיסוציאציה מוחית למבוגרים17

הערה: בעת עבודה עם דגימות, יש למקם צינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר בעוד BSA ו- D-PBS נשארים על קרח אלא אם כן צוין אחרת.

  1. הפעל את הדיסוציאטור.
  2. השתמש במלקחיים כדי להעביר את חלקי הרקמה של ההיפוקמפי לצינור C.
  3. מעבירים 30 μL של תערובת אנזימים 2 לתוך צינור C. סובבו את המכסה עד שהמתח מורגש, ואז התהדקו עד שהוא לוחץ.
  4. מקם את צינור C הפוך למצב של הדיסוציאטור; לדוגמה יוקצה המצב 'נבחר' (איור 2). אבטחו את התנור מעל צינור C.
  5. הקש על סמל התיקיה, בחר תיקיית מועדפים , גלול אל ובחר את התוכנית 37C_ABDK_02 . לחץ על אישור כדי להחיל את התוכנית על כל צינורות C שנבחרו, ולאחר מכן הקש על התחל (איור 2).
  6. סמן צינור חרוטי אחד של 50 מ"ל לכל דגימה.
  7. הניחו מסננת של 70 מיקרומטר על כל צינור חרוטי של 50 מ"ל ורטובה עם 2 מ"ל של חיץ BSA.
  8. עם סיום התוכנית, הסר את התנור ואת צינור C מן dissociator.
  9. הוסף 4 מ"ל של חיץ BSA לדגימה והחיל את התערובת על מסננת התא על הצינור החרוטי 50 מ"ל.
  10. מוסיפים 10 מ"ל של D-PBS לצינור C, סוגרים אותו ומסובבים את התמיסה בעדינות. יש למרוח אותו על מסננת התאים על הצינור החרוטי 50 מ"ל.
  11. יש להשליך את מסננת התא ואת צינור C. צנטריפוגה את המתלים ב 300 x g למשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנאטנט.

7. פינוי פסולת

  1. בצעו החייאה של הכדור עם 1550 μL של D-PBS קר והעבירו את המתלים לצינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל.
  2. הוסיפו 450 μL של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה (אין מערבולת).
    הערה: פתרון להסרת פסולת הוא מגיב בערכת הדיסוציאציה של בריאן למבוגרים המסחרית17.
  3. שכבו בעדינות 1 מ"ל של D-PBS קר על גבי מתלה התא, והשאירו את הקצה על דופן הצינור החרוטי. חזור על הפעולה עד שהשכבה הכוללת תהיה 2 מ"ל.
    הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.
  4. צנטריפוגה ב 3000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה ובלם מלא.
    הערה: אם השלבים אינם מופרדים בבירור, חזור על שלבים 7.2-7.3. צנטריפוגה בפעם האחרונה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. המתלים צריכים כעת להיות מורכבים משלוש שכבות נפרדות (איור 3). שאפו לשכבה העליונה ביותר. יש לטאטא את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף לשכבת האמצע הלבנה. הסר כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר.
    הערה: שלב זה הוא קריטי; לבצע במיומנות ובמיומנות.
  6. הוסיפו 2 מ"ל של D-PBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
  7. צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C עם האצה מלאה בלם מלא. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant. החזירו את הכדור ב-1 מ"ל של חיץ BSA.
    הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים ולאחר מכן לתייג ולבודד אותם באופן מגנטי כהכנה לריצוף של תא יחיד בשלב זה.

8. ספירת תאים

  1. בצע ספירת תאים בהתאם לפרוטוקול היצרן של מונה התאים הזמין (אפשרות אחת מצוינת בטבלת החומרים)

9. כתם חי/מת

  1. צנטריפוגה 900 μL הנותרים (מ 7.7) ב 1000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C עם תאוצה מלאה בלם מלא.
  2. בזמן שהדגימה מסתובבת, סמן צינור זרימה אחד לכל דגימה ועטף אותו בנייר כסף כדי להגביל את החשיפה לאור.
  3. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.
  4. בצעו החייאה של הכדור ב-50 μL של כתם חי/מת מדולל (שהוכן בעבר).
    הערה: שלב זה אמור להתבצע בתאורה חלשה. כבה את אורות החדר העיליים כדי להשיג זאת.
  5. מעבירים כל דגימה לצינור הזרימה המסומן המתאים ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 8-10 דקות בחושך (למשל, מגירה או קופסה).
  6. הוסף 500 μL של בופר BSA וצנטריפוגה ב 1000 x g למשך 10 דקות ב 4 °C עם האצה מלאה ובלם מלא.
  7. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.
    הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור. ניתן לבצע שימוש חוזר בתאים במאגר המתאים, להיחסם ולהכתים אותם בנוגדנים ספציפיים לתאים בשלב זה. ראה קובץ משלים 1 לפרוטוקול לדוגמה18.

10. קיבוע (אופציונלי)

  1. בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של 1% PFA (שהוכן בעבר). אינקובציה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. לשטוף על ידי הוספת 500 μL של D-PBS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
  3. לשאוף את הסופרנאטנט.
    הערה: ייתכן שהכדור לא יהיה גלוי; להשאיר כמות קטנה של חיץ מאחור כדי לא לשאוף בלי כוונה את הכדור.
  4. בצעו החייאה של הכדור ב-200 μL של D-PBS ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים.

11. ציטומטריית זרימה

  1. סמן את מכסי המסנן בצינורות החדשים.
  2. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, פיפטה כל דגימה על מכסה המסנן.
  3. צנטריפוגה לזמן קצר ב 200 x g ב 4 ° C, רק מאפשר צנטריפוגה להגיע 200 x g לפני עצירת הריצה.
  4. המשך לזרימה של ליבת ציטומטריה לניתוח במורד הזרם.

תוצאות

הדגימות עובדו באמצעות ציטומטר זרימה במתקן ליבה, והנתונים שהתקבלו הוערכו באמצעות חבילת תוכנה לניתוח זרימה. בעבר נותחו בקרות פיצויים - הכתם החי/מת והשליטה השלילית. אם נעשה שימוש במספר פלואורוכרומים, יש להכין בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) ובקרות של כתם יחיד עבור כל נוגדן. הפיצוי על החפיפ?...

Discussion

מספר שלבים בפרוטוקול דיסוציאציה עצבית זו דורשים טכניקה מיומנת ומיומנות – פרפוזיה, שאיפה סופרנאטית והסרת מיאלין. לאורך כל תהליך הזלוף, האיברים הפנימיים חייבים להישאר שלמים (מלבד הסרת הסרעפת וגזירת הלב); זה כולל הימנעות מהחדרים העליונים של הלב עם מחט הפרפר. בעוד שכמות המלח עם הפרין הדרושה מ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לאיימי רוג'רס על מתן הדרכה מעשית ותמיכה מתמשכת במוצרים. אנו מודים לד"ר אמנדה בורק על פתרון הבעיות וההבהרה המתמשכים של הדיונים. אנו מודים למרדית יוהיים ולקבוצת התקשורת המדעית של UAMS על העריכה והעיצוב הדקדוקיים של כתב יד זה. מחקר זה נתמך על ידי NIH R25GM083247 ו- NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher Scientific02-682-003Basix, assorted color
15 mL Falcon TubesBecton Dickinson Labware Europe352009Polystyrene
25 mL Serological PipetsFisher Scientific14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeFalcon352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle SystemCorning431097
70 μm cell strainerFisher Scientific08-771-2
Adult Brain Dissociation KitMiltenyi Biotec 130-107-677Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969Miltenyi Biotec130-116-246
Anti-Myelin Basic ProteinSigma-AldrichM3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2BMiltenyi Biotec130-117-394
BD LSRFortessaBD
BSASigma-AldrichA7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592Miltenyi Biotec130-113-810
CD31 AntibodyMiltenyi Biotec130-111-541
Ceramic Hot Plate StirrerFisher Scientific11-100-100SH
Dimethyl SulfoxideFisher ScientificBP231-100
EthanolPharmco by Greenfield Global111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Fine Scissors - SharpFine Science Tools14060-09Perfusion
FlowJoBD(v10.7.0)
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi Biotec130-096-427
Gibco DPBS (1X)ThermoFisher Scientific14190144
Glass BeakerFisher Scientific02-555-25A
Heparin sodiumFresenius Kabi504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisherL34965
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-51
Noyes Spring ScissorsFine Science Tools15012-12Dissection
ParaformaldehydeSigma-Aldrich441244-3KGPrilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10Rainin30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10Rainin30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8Rainin30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)Rainin30386597
RBXMO FITC XADSFisher ScientificA16167
Round Ice Bucket with LidFisher Scientific07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer CapFalcon100-0087
S1 Pipet FillersThermoFisher Scientific9541
Spatula & ProbeFine Science Tools10090-13Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"TermunoSV-23BLKButterfly needle
Test Tube RackFisher Scientific14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR CentrifugeThermoFisherdiscontinuedOr other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic PumpFisher Scientific13-876-2Low-flow model
VetFlo Starter Kit for MiceKent ScientificVetFlo-MSEKITAnesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia SystemKent ScientificVetFlo-1210S0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability AnalyzerBeckman Coulter Life Sciences731196Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample VialsBeckman Coulter Life Sciences383721Cell Counting

References

  1. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. . The Hippocampus Book. , (2007).
  2. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
  3. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
  5. Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
  6. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
  7. Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
  8. Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
  9. Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
  10. Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
  11. Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).
  12. Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
  13. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
  14. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
  15. Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020)
  16. Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021)
  17. Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
  18. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
  19. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
  20. Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
  21. Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021)
  22. . Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021)
  23. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  24. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
  25. Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
  26. Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
  27. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
  28. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
  29. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  30. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
  31. O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
  32. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved