Fare Beyni Hipokampal Dokusunun Kombine Mekanik ve Enzimatik Ayrışması

Özet

Bu nöral hücre ayrışma protokolü, düşük miktarda başlangıç malzemesine sahip numuneler için tasarlanmıştır ve isteğe bağlı sabitleme ve boyama adımlarıyla aşağı akış analizi için oldukça uygun bir tek hücreli süspansiyon sağlar.

Özet

Bu nöral ayrışma protokolü (ticari bir yetişkin beyin ayrışma kitine eşlik eden protokolün bir uyarlaması), akış sitometrisi veya tek hücreli dizileme gibi ayrıntılı aşağı akış analizine hazırlık olarak doku işlemeyi optimize eder. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya bunların bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir. Nöronal hücrelerin hassas doğası, tek hücreli analiz için gerekli olan minimum hücresel enkaz ile son derece canlı, gerçek tek hücreli süspansiyonu elde etme çabalarını zorlaştırabilir. Veriler, otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bu kombinasyonunun, yukarıda belirtilen zorlukların üstesinden gelerek, sürekli olarak oldukça uygulanabilir (>% 90) tek hücreli bir süspansiyon sağladığını göstermektedir. Adımlardan birkaçı manuel el becerisi gerektirse de, bu adımlar numune kullanımını ve potansiyel hücre kaybını azaltır. Bu makale, aşağı akış analizine hazırlık olarak küçük miktarlarda sinir dokusunu başarılı bir şekilde ayrıştırmak için diğer laboratuvarları donatmak için sürecin her adımını detaylandırmaktadır.

Giriş

Hipokampus ilk olarak 1500'lü^yıllarda bir Bolognese anatomisti olan Giulio Cesare Aranzio tarafından tanımlanmıştır. Bu yeni keşfedilen yapıyı adlandırırken, Aranzio muhtemelen Hipokampus¹ cinsinin denizatına olan esrarengiz benzerliğinden ilham aldı. Hipokampus stres tepkilerinde rol oynar, ancak öğrenme ve hafızadaki rolü ile yaygın olarak bilinir. Daha spesifik olarak, hipokampus, bildirimsel ve uzamsal belleğin kodlanmasından ve alınmasından sorumludur¹.

Hipokampus veya uygun hipokampus, CA1 (cornu ammonis), CA2 ve CA3 alt alanları^1'e ayrılmıştır. Sinir sisteminin geri kalanıyla karşılaştırıldığında, hipokampus, plastisitesi ve devam eden nörogenez^potansiyeli de dahil olmak üzere birçok benzersiz tanımlayıcı özelliğe sahiptir 2. Nörogenez, nöral kök hücrelerin çoğalması ve farklılaşması sürecidir, bunu takiben önceden var olan nöronal ağa entegrasyonları izler. Nörogenez, dentat girusun subgranüler bölgesi ve lateral ventriküllerin (ve koku alma ampullerinin) subventriküler bölgesi ile ^{sınırlıdır3}. Nörogenez embriyogenezde bol miktarda bulunurken, yaşam boyu süren bir süreçtir ^3,4. Bu nedenle, bu tartışma hipokampustaki yetişkin nörogenezine odaklanacaktır.

Subventriküler ve subgranüler bölgeler, ependimal ve vasküler hücrelerin yanı sıra nöral kök hücrelerin olgunlaşmamış ve olgun soylarını içeren nörojenik nişlerdir⁵. Mikroglia, nörogenezi düzenlemek için bağışıklık hücreleri olarak bu nişlere katkıda bulunur⁶. Nöral progenitör hücreler, nöral kök hücrelerin kök hücre dışı soylarıdır⁷. Subventriküler bölgede üç tip nöral progenitör bulunur: radyal glia benzeri tip B hücreleri, C tipi transitif yükseltici progenitörler ve tip A nöroblastları ^3,8. Subventriküler bölgedeki yavaş bölünen tip B nöral progenitör hücreler, hızla bölünen tip C hücrelerine farklılaşabilir⁸. Daha sonra, C tipi hücreler A tipi hücrelere⁸ olarak farklılaşır. Bu nöroblastlar, internöronlara veya oligodendrositlere farklılaşmadan önce rostral göç akışından koku alma ampulüne göç eder⁹. Bu koku alma ampulü internöronları, koku alma kısa süreli hafızanın ve ilişkisel öğrenmenin anahtarıdır, oysa oligodendrositler korpus kallozum^9'un miyelinli aksonlarını oluşturur. Erişkin nörogenezin çoğunluğu, radyal tip 1 ve radyal olmayan tip 2 nöral progenitörlerin bulunduğu dentat girusun subgranüler bölgesinde meydana gelir³. Çoğu nöral progenitör hücre, dentat granül nöronları ve astrositler haline gelmeye mahkumdur¹⁰. Boşluk kavşaklarıyla birbirine bağlanan astrositler, plastisiteyi, sinaptik aktiviteyi ve nöronal uyarılabilirliği modüle etmek için ağlar oluşturur⁵. Dentat girusun birincil uyarıcı nöronu olarak, granül hücreler entorinal korteksten CA3 bölgesi^11'e girdi sağlar.

Nöral kök hücre popülasyonları immünomanyetik veya immünofloresan izolasyon stratejileri kullanılarak izole edilebilir^12,13. Nöral dokunun ayrışması özellikle zordur; Bunu yapma çabaları genellikle zayıf hücre canlılığına sahip numunelerle sonuçlanır ve / veya aşağı akış analizi için gerekli tek hücreli süspansiyonu üretemez. Nöral ayrışma, mekanik ayrışma (filtreler, doğrama teknikleri veya pipet tritürasyonu gibi), enzimatik sindirim veya tekniklerin bir kombinasyonu yoluyla gerçekleştirilebilir^14,15. Nöral ayrışma yöntemlerini değerlendiren bir çalışmada, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın canlılığı ve kalitesi ile pipet tritürasyonu ve sindiriminin çeşitli enzimlerle kombinasyonları karşılaştırılmıştır¹⁵. Kalite, hazırlanan süspansiyondaki hücre kümelerinin ve DNA veya hücre altı kalıntıların miktarına göre derecelendirildi¹⁵. Tek başına manuel mekanik ayrışmaya maruz kalan glial tümörlerin süspansiyonları, dispazlı tedavilerden veya DNaz, kollajenaz ve hyaluronidaz^15'in bir kombinasyonundan önemli ölçüde daha düşük hücre canlılığına sahipti. Volovitz ve ark., farklı yöntemler arasındaki canlılık ve kalitedeki çeşitliliği kabul etmiş ve yetersiz ayrışmanın aşağı akış analizinin doğruluğunu azaltabileceğini vurgulamıştır¹⁵.

Ayrı bir çalışmada, yazarlar kültürlü nöronal hücrelerin ayrışmasının 60'tan fazla farklı yöntemini ve kombinasyonunu karşılaştırdılar¹⁴. Bu yöntemler, pipet tritürasyonu ile manuel mekanik ayrışmanın sekiz farklı varyasyonunu, üç farklı aralıkta beş ayrı enzimle inkübasyonun karşılaştırılmasını ve enzimatik sindirim veya iki enzimin kombinasyonu ile çeşitli mekanik ayrışma kombinasyonlarını içeriyordu¹⁴. Mekanik yöntemlerin hiçbiri tek hücreli bir süspansiyon¹⁴ vermedi. Tek enzim tedavilerinden dördü, enzimatik tedavilerin on kombinasyonu ve enzimatik sindirim ile mekanik ayrışma kombinasyonlarının dördü tek hücreli bir süspansiyon¹⁴ verdi. TrypLE ile enzimatik sindirim ve ardından Tripsin-EDTA en etkili şekilde ayrışmış örnekler¹⁴. Bu arada, TrypLE ve / veya Trypsin-EDTA ile muamele edilen örnekler jelatinimsi kümeler oluşturma eğilimindeydi¹⁴. Bu çalışma kültürlenmiş hücreler üzerinde yapılırken, pipet tritürasyonu veya enzimatik sindirimin tek başına eksikliklerine değinmektedir.

Manuel ve otomatik mekanik ayrışmanın yan yana karşılaştırmaları eksiktir. Bununla birlikte, bir grup, ticari papain veya tripsin enzimatik ayrışma kitleri¹⁶ ile birlikte tüm fare beyinlerinin manuel ve yarı otomatik mekanik ayrışmasını karşılaştırmak için akış sitometrisini çalıştırdı. Ayrışıcı ile işleme daha tutarlı bir şekilde canlı hücreler verdi¹⁶. Ayrışmayı takiben, yazarlar ayrıca Prominin-1 hücrelerini, nöronal öncü hücreleri ve mikroglia^16'yı izole ettiler. Üç izole hücre popülasyonundan ikisi için, izole hücrelerin saflığı, örnekler ayrışıcı ile işlendiğinde, manuel olarak^16'ya kıyasla biraz daha yüksekti. Reiß ve ark., pipetleme tekniğinde kişiden kişiye değişkenliğin, doku ayrışmasında canlı hücre popülasyonu veriminin tekrarlanabilirliğini engellediğini belirtmiştir¹⁶. Yazarlar, otomatik mekanik ayrışmanın numune işlemeyi standartlaştırdığı sonucuna varmışlardır¹⁶.

Bu makalede özetlenen ayrışma yöntemi, ticari bir yetişkin beyin ayrışma kiti^17'ye eşlik eden çözeltiler kullanılarak, tam otomatik mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimin bir kombinasyonudur. Standart protokollerden farklı olarak, bu optimize edilmiş protokol numune manipülasyonunu azaltır, son derece uygulanabilir tek hücreli bir süspansiyon sağlar ve minimum miktarda başlangıç dokusunun işlenmesi için tasarlanmıştır.

Protokol

Deneyler, UAMS'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 6 aylık dişi C57Bl6 / J vahşi tip fareler satın alındı ve sabit bir 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü altında grup barındırıldı (kafes başına 4 fare).

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Sabitlenebilir canlı/ölü leke suyu çözeltisi hazırlayın. Floresan boyasını 20 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ile yeniden oluşturun.
2. Şişeyi folyoya sarın, "Yeniden Yapılandırılmış" olarak etiketleyin ve altı aya kadar -20 ° C'de saklayın.
3. Heparin ile% 0.9'luk bir salin çözeltisi hazırlayın. Bir şişe heparin sodyumun içeriğini (10 mL başına 10.000 USP birimi) 1 L çift damıtılmış suda (ddH₂O) seyreltin.
4. Hayvan başına yaklaşık 45 mL için yeterince hazırlayın ve bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
5. % 1 paraformaldehit (PFA) yapın.
   1. Bir duman davlumbazında, bir sıcak plakayı 50 ° C'ye ısıtın. Bir mikrodalgada, bir cam kabın içinde 100 mL ddH₂O'yu yaklaşık 60 ° C'ye ısıtın. Manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve sıcak plakaya aktarın.
   2. Davlumbazda, 1 g PFA tartın ve ddH₂O'nun kabına ekleyin 0.1125 g NaOH kristalleri ekleyin ve çözülene kadar karıştırın (5-10 dakika).
   3. 0.4 g NaPO 4- monobazik ekleyin ve eriyene kadar karıştırın (_2-5 dk). Çözeltiyi vakumla filtreleyin ve HCl ve NaOH ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
   4. Depolamadan önce buzda veya 4°C'de 30 dakika soğutun.
      NOT: 1,5 mL'lik alipotlar bir yıl boyunca -20 °C'de saklanabilir. Donma-çözülme döngülerinden kaçının. Çözüldükten sonra, çözelti bulanıklaşırsa veya bir çökelti oluşursa, çözelti kullanılmamalıdır.
      DİKKAT: Toksik, yanıcı. PFA ile her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giyen havalandırmalı bir başlık altında çalışın.
6. Liyofilize Enzim A'yı 1 mL Tampon A ile yeniden askıya alın. Çözümü vortekse etmeyin.
   NOT: Enzim A ve Tampon A'nın yanı sıra A, Y ve Z tamponları, ticari Yetişkin Beyin Ayrışma Kiti^17'deki reaktiflerdir.
7. Enzim P'yi 50 μL'lik alikotlara bölün ve Enzim A'yı 10 μL alikotlara geri koyun. Kit talimatlarına göre, altı aya kadar -20 ° C'de saklayın. Donma-çözülme döngülerinden kaçının.

2. Deney günü

1. Masa üstü santrifüjü 4 °C'ye soğutun.
2. Kademeli olarak çözülmesi için PFA'nın aliquot'larını buzdolabına yerleştirin.
3. Yeniden oluşturulmuş canlı/ölü lekeyi oda sıcaklığında çözülmesi için karanlıkta (örneğin bir çekmece) yerleştirin.
4. Sığır serum albümini (BSA) tamponunu hazırlayın. Kalsiyum ve magnezyum (D-PBS), pH 7.2 içermeyen 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisinin 100 mL'sine 0.5 g BSA ekleyin.
5. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 30 dakika boyunca bir karıştırma tabağında karıştırın. 50 mL konik tüplere aktarın ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Her zaman taze hazırlanmış BSA tamponu kullanın.
6. Canlı / ölü leke çalışma seyreltmesi hazırlayın. Yeniden yapılandırılmış canlı/ölü leke suyu çözeltisinden 1 μL'yi 360 μL D-PBS'ye ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta (örneğin bir çekmece veya kutu) saklayın. Numune başına 50 μL çalışma seyreltmesi hazırlayın.

3. Perfüzyon

1. Tuzlu su çözeltisini heparin ile buz üzerine yerleştirin.
2. Oksijeni açın, küçük hayvan anestezi buharlaştırıcı sistemindeki debimetre gösterge topunu 1 L / dak'ya ayarlayın. Yeterli oksijen basıncı ve izofluran olduğundan emin olun.
3. Buharlaştırıcı kadranını %3,5'e ayarlayın (indüksiyon ve bakım için).
4. Perfüzyon pompa hatlarını salin/heparin çözeltisi ile astarlayın. Hızı 6 mL/dk olarak ayarlayın.
5. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin, havalandırmayı açın ve fare yanıt vermeyene kadar birkaç dakika bekleyin. Zararlı çimdiklemeye pedal çekilmesi olmadan yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
6. Fareyi sırt üstü diseksiyon tepsisine yerleştirin, burnu burun konisinde. Zararlı bir sıkışmaya pedal çekilmesinin olmaması yoluyla tam anestezinin ikincil bir onayını gerçekleştirin. Dört pençeyi de tepsiye sabitleyin.
7. Hayvanın karnına% 20 etanol püskürtün.
8. Forseps kullanarak, alt karnı sıkıştırın ve cildi kaldırın. Kürk ve cildi göğüs kafesinin dibine kesmek için makas kullanın.
9. Göğüs kafesinin altından her omuza doğru iki çapraz kesi yapın.
10. Diyaframı dikkatlice rezeke edin (akciğerlerden ve kalpten kaçının). Kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesini rezeke edin.
11. Kalbin etrafındaki herhangi bir bağ dokusunu dikkatlice kesin.
    NOT: 3.10-3.11 arasındaki adımlar kritiktir; yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirmek.
12. Sağ atriyumu kırpmak için makası kullanın (kalbin sol üst köşesindeki koyu renkli lob). İzofluran akışını havalandırmaya kapatın.
13. Forseps ile kalbi sabit tutun. Kelebek iğnesinin eğimi yukarı bakacak şekilde, iğne seviyesini ve hayvana paralel tutarken sol ventrikülü delin.
14. İğneyi yerinde tutun, pompayı açın ve kalpten çıkan sıvı opak olana ve karaciğer ve akciğerler soluk olana kadar en az 30 mL salin / heparin çözeltisini perfüze edin.
    NOT: 3.13-3.14 arasındaki adımlar kritiktir; yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirmek.
15. Pompayı kapatın, iğneyi çıkarın ve fareyi diseksiyon alanına aktarın.

4. Diseksiyon

1. Büyük cerrahi makas kullanarak, başın başını kesin.
2. Kürkü başın arkasından gözlere kadar kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi tekrar soyun.
3. Kafatasını gözlerin arasına kesin. Kafatasının arkasında, saat 10 ve 2 pozisyonlarında iki kesim yapın, ardından kafatasının orta sagital çizgisi boyunca gözler arasındaki orijinal kesime kadar uzun bir kesim yapın (beyne zarar vermemek için uçları yukarı doğru tutun).
4. Kafatasının iki yarısını yanlara doğru soymak için forseps kullanın. Beyni çıkarmak için bir spatula kullanın ve soğuk D-PBS ile dolu buz üzerinde 60 mm'lik bir cam Petri kabına yerleştirin (Şekil 1).
5. Her yarım küreyi ayırmak için bir neşter veya tıraş bıçağı kullanın. Sonra koku ampullerini ve beyinciği çıkarın.
6. Hipokampus açığa çıkana kadar orta beyni çıkarmak için forseps kullanın.
7. Beyni forseps ile sabitleyin. İkinci bir forseps seti kullanarak, hipokampüsü her yarım küreden nazikçe kızdırın ve her iki hipokampusu da soğuk D-PBS içeren etiketli 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
8. Fareden iki hipokampiyi içeren örnek tüpü buzun üzerine yerleştirin.

5. Her numune için Enzim Karışımı 1 ve 2'yi hazırlayın

NOT: 2 mL'den büyük hacimler için 10 mL'lik serolojik pipet kullanın; hacimler için 200 μL-2 mL, 1000 μL pipet kullanın; hacimler için, 21-199 μL, 200 μL'lik bir pipet kullanın; hacimler için, 2-20 μL, 20 μL'lik bir pipet kullanın; 2 μL'nin altındaki hacimler için 0-2 μL'lik bir pipet kullanın.

1. Her numune için, Enzim P ve Enzim A'nın her biri bir aliquot'u oda sıcaklığında çözün.
2. Enzim karışımı 1 için, 50 μL Enzim P ve 1900 μL Tampon Z'yi etiketli bir C Tüpünde (Malzeme Tablosu) birleştirin.
3. Enzim karışımı 2 için, Enzim A'nın çözülmüş 10 μL alikotuna 20 μL Tampon Y ekleyin.

6. Yetişkin beyin ayrışma protokolü¹⁷

NOT: Numunelerle çalışırken, tüpler oda sıcaklığında bir tüp rafına yerleştirilmeli, BSA ve D-PBS ise aksi belirtilmedikçe buz üzerinde kalmalıdır.

1. Ayrıştırıcıyı açın.
2. Hipokampi doku parçalarını C Tüpüne aktarmak için forseps kullanın.
3. 30 μL Enzim karışımı 2'yi C Tüpüne aktarın. Gerginlik hissedilene kadar kapağı bükün, ardından tıklayana kadar sıkın.
4. C Tüpünü baş aşağı ayrıştırıcının bir konumuna yerleştirin; örneğe Seçilen durumu atanacaktır (Şekil 2). Isıtıcıyı C Tüpünün üzerine sabitleyin.
5. Klasör simgesine basın, Sık Kullanılanlar klasörünü seçin, 37C_ABDK_02 programına gidin ve seçin. Programı seçilen tüm C tüplerine uygulamak için Tamam'a tıklayın, ardından Başlat'a dokunun (Şekil 2).
6. Numune başına bir adet 50 mL konik tüp etiketleyin.
7. Her 50 mL konik tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 2 mL BSA tamponu ile ıslatın.
8. Programın tamamlanmasının ardından, ısıtıcıyı ve C tüpünü ayrıştırıcıdan çıkarın.
9. Numuneye 4 mL BSA tamponu ekleyin ve karışımı 50 mL konik tüp üzerindeki hücre süzgecine uygulayın.
10. C Tüpüne 10 mL D-PBS ekleyin, kapatın ve çözeltiyi yavaşça döndürün. 50 mL konik tüp üzerindeki hücre süzgecine uygulayın.
11. Hücre süzgecini ve C Tüpünü atın. Süspansiyonu 300 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı aspire edin ve atın.

7. Enkaz kaldırma

1. Peleti 1550 μL soğuk D-PBS ile yeniden askıya alın ve süspansiyonu etiketli 15 mL konik bir tüpe aktarın.
2. 450 μL soğuk Enkaz Giderme Çözeltisi ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin (vorteks yapmayın).
   NOT: Enkaz Kaldırma Çözümü, ticari Adult Brian Dissociation Kit^17'deki bir reaktiftir.
3. Hücre süspansiyonunun üzerine yavaşça 1 mL soğuk D-PBS yerleştirin ve ucu konik tüpün duvarına karşı tutun. Toplam kaplama 2 mL olana kadar tekrarlayın.
   NOT: Bu adım kritiktir; yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirmek.
4. Tam hızlanma ve tam fren ile 4 °C'de 10 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüj.
   NOT: Aşamalar açıkça ayrılmamışsa, 7.2-7.3 arasındaki adımları yineleyin. 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de son kez santrifüj yapın.
5. Süspansiyon şimdi üç ayrı katmandan oluşmalıdır (Şekil 3). En üst tabakayı aspire edin. Beyaz orta tabakayı aspire etmek için pipet ucunu ileri geri süpürün. En alt katmanı rahatsız etmeden orta katmanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
   NOT: Bu adım kritiktir; yeterlilik ve el becerisi ile gerçekleştirmek.
6. Karıştırmak için 2 mL soğuk D-PBS ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin.
7. Tam hızlanma ve tam fren ile 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj. Süper natantı aspire edin ve atın. Peleti 1 mL BSA tamponunda yeniden askıya alın.
   NOT: Hücreler uygun tamponda yeniden askıya alınabilir, daha sonra manyetik olarak etiketlenebilir ve bu noktada tek hücreli dizilemeye hazırlık olarak izole edilebilir.

8. Hücre sayısı

1. Üreticinin kullanılabilir hücre sayacı protokolüne göre hücre sayımı gerçekleştirin ( Malzeme Tablosunda bir seçenek belirtilmiştir)

9. Canlı / ölü leke

1. Kalan 900 μL'yi (7,7'den itibaren) 1000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca tam hızlanma ve tam fren ile santrifüj edin.
2. Numune dönerken, numune başına bir akış tüpü etiketleyin ve ışığa maruz kalmayı sınırlamak için folyoya sarın.
3. Süper natantı aspire edin ve atın.
4. Peleti 50 μL seyreltilmiş canlı/ölü leke (önceden hazırlanmış) içinde yeniden askıya alın.
   NOT: Bu adım düşük ışıklı bir ortamda gerçekleştirilmelidir. Bunu başarmak için baş üstü oda ışıklarını kapatın.
5. Her numuneyi ilgili etiketli akış tüpüne aktarın ve karanlıkta 8-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin (örneğin, bir çekmece veya kutu).
6. 500 μL BSA tamponu ekleyin ve tam hızlanma ve tam fren ile 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın.
7. Süper natantı aspire edin ve atın.
   NOT: Pelet görünmeyebilir; Peletin istemeden aspire edilmemesi için geride az miktarda tampon bırakın. Hücreler bu noktada uygun tamponda yeniden askıya alınabilir, bloke edilebilir ve hücreye özgü antikorlarla boyanabilir. Örnek protokol 18 için Ek Dosya 1'e bakın.

10. Fiksasyon (isteğe bağlı)

1. Peleti 200 μL% 1 PFA'da (önceden hazırlanmış) yeniden askıya alın. 4 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
2. 500 μL D-PBS ekleyerek yıkayın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
3. Süper natantı aspire edin.
   NOT: Pelet görünmeyebilir; Peletin istemeden aspire edilmemesi için geride az miktarda tampon bırakın.
4. Peleti 200 μL D-PBS içinde yeniden askıya alın ve 3 güne kadar 4 ° C'de saklayın.

11. Akış sitometrisi

1. Yeni tüplerdeki filtre kapaklarını etiketleyin.
2. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, her numuneyi filtre kapağına pipetleyin.
3. 4 ° C'de 200 x g'de kısa bir süre santrifüj, sadece santrifüjün çalışmayı durdurmadan önce 200 x g'ye ulaşmasına izin verir.
4. Aşağı akış analizi için akış sitometri çekirdeğine geçin.

Sonuçlar

Numuneler çekirdek bir tesiste bir akış sitometresi ile işlendi ve elde edilen veriler akış analizi için bir yazılım paketi ile değerlendirildi. Daha önce, kompanzasyon kontrolleri analiz edildi - canlı / ölü leke ve negatif kontrol. Birden fazla florokrom kullanılıyorsa, her antikor için floresan eksi bir (FMO) kontrolleri ve tek lekeli kontroller hazırlanmalıdır. Deneysel örnekler için spektral örtüşme tazminatı, analiz edilen kontrollere dayanarak hesaplanmıştır. Hücre popülasyonu tanım...

Tartışmalar

Bu nöral ayrışma protokolündeki birkaç adım, yeterli teknik ve el becerisi gerektirir – perfüzyon, süpernatant aspirasyon ve miyelin çıkarılması. Perfüzyon süreci boyunca, iç organlar sağlam kalmalıdır (diyaframı çıkarmak ve kalbi kırpmak dışında); bu, kelebek iğnesi ile kalbin üst odalarından kaçınmayı içerir. İhtiyaç duyulan heparin ile salin miktarı değişirken, kalpten akan şeffaf sıvı işlemin tamamlandığını gösterir. Beyin tamamen ve uygun şekilde perfüze edilmelidir,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting