Dissociation mécanique et enzymatique combinée du tissu hippocampique du cerveau de la souris

Résumé

Ce protocole de dissociation des cellules neurales est destiné aux échantillons avec une faible quantité de matière première et donne une suspension unicellulaire hautement viable pour l’analyse en aval, avec des étapes de fixation et de coloration facultatives.

Résumé

Ce protocole de dissociation neuronale (une adaptation du protocole accompagnant un kit commercial de dissociation du cerveau adulte) optimise le traitement des tissus en préparation d’une analyse détaillée en aval telle que la cytométrie en flux ou le séquençage unicellulaire. La dissociation neuronale peut être réalisée par dissociation mécanique (comme l’utilisation de filtres, de techniques de hachage ou de trituration par pipette), la digestion enzymatique ou une combinaison de ceux-ci. La nature délicate des cellules neuronales peut compliquer les efforts pour obtenir la véritable suspension unicellulaire hautement viable avec un minimum de débris cellulaires nécessaires à l’analyse unicellulaire. Les données démontrent que cette combinaison de dissociation mécanique automatisée et de digestion enzymatique donne systématiquement une suspension unicellulaire hautement viable (>90%), surmontant les difficultés susmentionnées. Bien que quelques-unes des étapes nécessitent une dextérité manuelle, ces étapes réduisent la manipulation des échantillons et la perte potentielle de cellules. Ce manuscrit détaille chaque étape du processus pour équiper d’autres laboratoires afin de dissocier avec succès de petites quantités de tissu neural en préparation d’une analyse en aval.

Introduction

L’hippocampe a été décrit pour la première fois par un anatomiste bolognais, Giulio Cesare Aranzio, dans les années 1500¹. En nommant cette nouvelle structure, Aranzio s’est probablement inspiré de sa ressemblance étrange avec l’hippocampe du genre Hippocampe¹. L’hippocampe est impliqué dans les réponses au stress, mais est largement connu pour son rôle dans l’apprentissage et la mémoire. Plus précisément, l’hippocampe est responsable de l’encodage et de la récupération de la mémoire déclarative et spatiale¹.

L’hippocampe, ou hippocampe proprement dit, est divisé en sous-champs CA1 (cornu ammonis), CA2 et CA3¹. Comparé au reste du système nerveux, l’hippocampe présente plusieurs caractéristiques déterminantes uniques, notamment sa plasticité et son potentiel de neurogenèse en cours². La neurogenèse est le processus de prolifération et de différenciation des cellules souches neurales, suivi de leur intégration dans le réseau neuronal préexistant. La neurogenèse est limitée à la zone sous-granulaire du gyrus denté et à la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux (et des bulbes olfactifs)³. Bien que la neurogenèse soit abondante dans l’embryogenèse, il s’agit d’un processus qui dure toute la vie ^3,4. En tant que tel, cette discussion se concentrera sur la neurogenèse adulte dans l’hippocampe.

Les zones sous-ventriculaires et sous-granulaires sont des niches neurogènes contenant des cellules épendymaires et vasculaires, ainsi que des lignées immatures et matures de cellules souches neurales⁵. Les microglies contribuent à ces niches en tant que cellules immunitaires pour réguler la neurogenèse⁶. Les cellules progénitrices neurales sont des descendants de cellules souches neurales⁷. Trois types de progéniteurs neuronaux sont présents dans la zone sous-ventriculaire : les cellules radiales de type B de type glie, les progéniteurs amplificateurs de transit de type C et les neuroblastes de type A ^3,8. Les cellules progénitrices neurales de type B qui se divisent lentement dans la zone sous-ventriculaire peuvent se différencier en cellules de type C⁸ qui se divisent rapidement. Par la suite, les cellules de type C se différencient en cellules de type A⁸. Ces neuroblastes migrent à travers le flux migratoire rostral vers le bulbe olfactif avant de se différencier en interneurones ou oligodendrocytes⁹. Ces interneurones du bulbe olfactif sont la clé de la mémoire olfactive à court terme et de l’apprentissage associatif, tandis que les oligodendrocytes myélisent les axones du corps calleux⁹. La majorité de la neurogenèse adulte se produit dans la zone sous-granulaire du gyrus denté, où se trouvent les progéniteurs neuronaux radiaux de type 1 et non radicaux de type 2³. La plupart des cellules progénitrices neurales sont destinées à devenir des neurones granulaires dentés et des astrocytes¹⁰. Reliés par des jonctions lacunaires, les astrocytes forment des réseaux pour moduler la plasticité, l’activité synaptique et l’excitabilité neuronale⁵. En tant que neurone excitateur primaire du gyrus denté, les cellules granulaires fournissent une entrée du cortex entorhinal à la région CA3¹¹.

Les populations de cellules souches neurales peuvent être isolées à l’aide de stratégies d’isolement immunomagnétiques ou immunofluorescentes^12,13. Le tissu neural est particulièrement difficile à dissocier; les efforts déployés pour ce faire aboutissent souvent à des échantillons dont la viabilité cellulaire est médiocre et/ou ne parviennent pas à produire la suspension unicellulaire nécessaire pour l’analyse en aval. La dissociation neuronale peut être réalisée par dissociation mécanique (comme l’utilisation de filtres, de techniques de hachage ou de trituration par pipette), la digestion enzymatique ou une combinaison de techniques^14,15. Dans une étude évaluant les méthodes de dissociation neuronale, la viabilité et la qualité de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette par rapport aux combinaisons de trituration pipette et de digestion avec diverses enzymes ont été comparées¹⁵. La qualité a été classée en fonction de la quantité d’amas cellulaires et d’ADN ou de débris subcellulaires dans la suspension préparée¹⁵. Les suspensions de tumeurs gliales soumises à une dissociation mécanique manuelle seule avaient une viabilité cellulaire significativement plus faible que les traitements par dispase ou une combinaison de DNase, de collagénase et de hyaluronidase¹⁵. Volovitz et coll. ont reconnu la variation de la viabilité et de la qualité entre les différentes méthodes et ont souligné qu’une dissociation inadéquate peut réduire la précision de l’analyse en aval¹⁵.

Dans une étude distincte, les auteurs ont comparé plus de 60 méthodes et combinaisons différentes de dissociation de cellules neuronales cultivées¹⁴. Ces méthodes comprenaient huit variantes différentes de la dissociation mécanique manuelle par trituration pipette, une comparaison de l’incubation avec cinq enzymes individuelles à trois intervalles différents et diverses combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ou combinaison de deux enzymes¹⁴. Aucune des méthodes mécaniques n’a donné une suspension monocellulaire¹⁴. Quatre des traitements enzymatiques simples, dix des traitements enzymatiques combinés et quatre des combinaisons de dissociation mécanique avec digestion enzymatique ont donné une suspension unicellulaire¹⁴. La digestion enzymatique avec TrypLE suivie de Trypsine-EDTA a le plus efficacement dissocié les échantillons¹⁴. Incidemment, les échantillons traités avec du TrypLE et/ou de la Trypsine-EDTA avaient tendance à former des amas gélatineux¹⁴. Bien que cette étude ait été réalisée sur des cellules cultivées, elle parle des lacunes de la trituration pipette ou de la digestion enzymatique seule.

Les comparaisons côte à côte de la dissociation mécanique manuelle et automatisée font défaut. Cependant, un groupe a effectué une cytométrie en flux pour comparer la dissociation mécanique manuelle et semi-automatisée de cerveaux entiers de souris en conjonction avec des kits commerciaux de dissociation enzymatique de papaïne ou de trypsine¹⁶. Le traitement avec le dissociateur a donné des cellules viables de manière plus cohérente¹⁶. Après la dissociation, les auteurs ont également isolé des cellules Prominin-1, des cellules précurseurs neuronales et des microglies¹⁶. Pour deux des trois populations de cellules isolées, la pureté des cellules isolées était légèrement plus élevée lorsque les échantillons étaient traités avec le dissociateur, par rapport à¹⁶ manuellement. Reiß et al. ont noté que la variabilité d’une personne à l’autre dans la technique de pipetage entrave la reproductibilité du rendement viable de la population cellulaire dans la dissociation tissulaire¹⁶. Les auteurs ont conclu que la dissociation mécanique automatisée normalise le traitement des échantillons¹⁶.

La méthode de dissociation décrite dans ce manuscrit est une combinaison de dissociation mécanique entièrement automatisée et de digestion enzymatique, en utilisant des solutions accompagnant un kit commercial de dissociation cérébrale adulte¹⁷. Contrairement aux protocoles standard, ce protocole optimisé réduit la manipulation des échantillons, produit une suspension unicellulaire hautement viable et est destiné au traitement de quantités minimales de tissu de départ.

Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UAMS. Des souris femelles de type sauvage C57Bl6/J âgées de 6 mois ont été achetées et logées en groupe (4 souris par cage) sous un cycle clair/sombre constant de 12 h.

1. Préparation des réactifs

1. Préparez une solution réparable de taches vivantes/mortes. Reconstituer la coloration fluorescente avec 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
2. Enveloppez le flacon dans du papier d’aluminium, étiquetez-le comme « reconstitué » et conservez-le à -20 °C pendant six mois au maximum.
3. Préparez une solution saline à 0,9% avec de l’héparine. Diluer le contenu d’un flacon d’héparine sodique (10 000 unités USP pour 10 mL) dans 1 L d’eau double distillée (ddH₂O).
4. Préparer suffisamment pour environ 45 mL par animal et conserver à 4 °C jusqu’à une semaine.
5. Produire 1% de paraformaldéhyde (PFA).
   1. Dans une hotte, chauffer une plaque chauffante à 50 °C. Au micro-ondes, chauffer 100 mL de ddH₂O dans un bécher en verre à environ 60 °C. Ajouter une barre d’agitation magnétique et transférer sur la plaque chauffante.
   2. Dans la hotte, peser 1 g de PFA et ajouter au bécher de ddH₂O. Ajouter 0,1125 g de cristaux de NaOH et mélanger jusqu’à dissolution (5-10 min).
   3. Ajouter 0,4 g de NaPO_4- monobasique et mélanger jusqu’à dissolution (2-5 min). Filtrez la solution sous vide et ajustez le pH à 7,4 avec HCl et NaOH.
   4. Laisser refroidir sur de la glace ou à 4°C pendant 30 min avant de conserver.
      REMARQUE: Les aliquotes de 1,5 mL peuvent être conservées à -20 °C pendant un an. Évitez les cycles de gel-dégel. Si, après décongélation, la solution devient trouble ou si un précipité s’est formé, la solution ne doit pas être utilisée.
      ATTENTION : Toxique, inflammable. Travaillez toujours avec pfa sous une hotte ventilée en portant un équipement de protection individuelle approprié.
6. Remettre en suspension l’enzyme A lyophilisée avec 1 mL de tampon A. Ne pas vortex la solution.
   REMARQUE: L’enzyme A et le tampon A ainsi que les tampons A, Y et Z sont des réactifs dans le kit commercial de dissociation cérébrale adulte¹⁷.
7. Diviser l’enzyme P en aliquotes de 50 μL et remettre en suspension l’enzyme A en aliquotes de 10 μL. Selon les instructions du kit, conserver à -20 °C jusqu’à six mois. Évitez les cycles de gel-dégel.

2. Journée d’expérimentation

1. Refroidir la centrifugeuse de table à 4 °C.
2. Placez la ou les aliquotes de PFA dans le réfrigérateur pour une décongélation progressive.
3. Placez la tache vivante ou morte reconstituée dans l’obscurité (p. ex., un tiroir) pour la décongeler à température ambiante.
4. Préparez le tampon d’albumine sérique bovine (BSA). Ajouter 0,5 g de BSA à 100 mL de 1x solution tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium ni magnésium (D-PBS), pH 7,2.
5. Ajouter une barre de remuage et mélanger sur une plaque à remuer pendant 30 min. Transférer dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à 4 °C.
   REMARQUE: Utilisez toujours un tampon BSA fraîchement préparé.
6. Préparer la dilution de travail des taches vivantes/mortes. Ajouter 1 μL de la solution reconstituée de taches vivantes/mortes à 360 μL de D-PBS et les conserver dans l’obscurité (p. ex. un tiroir ou une boîte) à température ambiante. Préparer 50 μL de la dilution de travail par échantillon.

3. Perfusion

1. Placer la solution saline avec de l’héparine sur de la glace.
2. Allumez l’oxygène, réglez la boule d’indicateur du débitmètre sur le système de vaporisateur d’anesthésie pour petits animaux à 1 L / min. Assurez-vous qu’il y a une pression d’oxygène et de l’isoflurane adéquates.
3. Réglez le cadran du vaporisateur à 3,5 % (pour l’induction et l’entretien).
4. Amorcer les conduites de la pompe de perfusion avec la solution saline/héparine. Réglez la vitesse sur 6 mL/min.
5. Placez la souris dans la chambre d’induction, allumez le respirateur et attendez plusieurs minutes jusqu’à ce que la souris ne réponde plus. Confirmer une profondeur d’anesthésie suffisante grâce à l’absence de retrait de la pédale au pincement nocif.
6. Placez la souris sur le dos sur le plateau de dissection avec son nez dans le cône de nez. Effectuer une confirmation secondaire de l’anesthésie complète par l’absence de retrait de la pédale au pincement nocif. Épinglez les quatre pattes au plateau.
7. Vaporisez l’abdomen de l’animal avec 20% d’éthanol.
8. À l’aide d’une pince, pincez le bas-ventre et soulevez la peau. Utilisez des ciseaux pour couper à travers la fourrure et la peau jusqu’au bas de la cage thoracique.
9. Faites deux incisions diagonales sous la cage thoracique vers chaque épaule.
10. Réséquez soigneusement le diaphragme (en évitant les poumons et le cœur). Réséquez la cage thoracique pour exposer le cœur.
11. Coupez soigneusement tout tissu conjonctif autour du cœur.
    REMARQUE : Les étapes 3.10 à 3.11 sont essentielles ; performer avec compétence et dextérité.
12. Utilisez les ciseaux pour couper l’oreillette droite (lobe sombre en haut à gauche du cœur). Éteignez le flux d’isoflurane vers le respirateur.
13. Maintenez le cœur stable avec des pinces. Avec le biseau de l’aiguille papillon tourné vers le haut, percez le ventricule gauche tout en gardant l’aiguille à niveau et parallèle à l’animal.
14. Maintenez l’aiguille en place, allumez la pompe et perfuser au moins 30 mL de la solution saline / héparine jusqu’à ce que le liquide quittant le cœur soit opaque et que le foie et les poumons soient de couleur pâle.
    REMARQUE : Les étapes 3.13 à 3.14 sont essentielles; performer avec compétence et dextérité.
15. Éteignez la pompe, retirez l’aiguille et transférez la souris dans la zone de dissection.

4. Dissection

1. À l’aide de gros ciseaux chirurgicaux, décapitez la tête.
2. Coupez la fourrure de l’arrière de la tête jusqu’aux yeux. Pelez la peau pour exposer le crâne.
3. Coupez le crâne entre les yeux. Faites deux coupes à l’arrière du crâne, aux positions de 10 et 2 heures, puis faites une longue coupe (gardez les pointes vers le haut pour éviter d’endommager le cerveau) le long de la ligne mi-saclastique du crâne jusqu’à la coupe originale entre les yeux.
4. Utilisez des pinces pour décoller les deux moitiés du crâne sur les côtés. Utilisez une spatule pour retirer le cerveau et placez-le dans une boîte de Petri en verre de 60 mm sur de la glace remplie de D-PBS froid (Figure 1).
5. Utilisez un scalpel ou un rasoir pour séparer chaque hémisphère. Retirez ensuite les bulbes olfactifs et le cervelet.
6. Utilisez une pince pour retirer le mésencéphale jusqu’à ce que l’hippocampe soit exposé.
7. Sécurisez le cerveau avec une pince. À l’aide d’une deuxième pince, taquinez doucement l’hippocampe hors de chaque hémisphère et transférez les deux hippocampes dans un tube étiqueté de 1,5 mL contenant du D-PBS froid.
8. Placez le tube d’échantillonnage contenant les deux hippocampes de la souris sur de la glace.

5. Préparer le mélange d’enzymes 1 et 2 pour chaque échantillon

REMARQUE : Pour les volumes supérieurs à 2 mL, utiliser une pipette sérologique de 10 mL; pour les volumes, 200 μL-2 mL, utiliser une pipette de 1000 μL; pour les volumes, 21-199 μL, utilisez une pipette de 200 μL; pour les volumes, 2-20 μL, utilisez une pipette de 20 μL; pour les volumes inférieurs à 2 μL, utilisez une pipette de 0 à 2 μL.

1. Pour chaque échantillon, décongeler une aliquote de l’enzyme P et de l’enzyme A à température ambiante.
2. Pour le mélange d’enzymes 1, combiner 50 μL d’enzyme P et 1900 μL de tampon Z dans un tube C étiqueté (Tableau des matériaux).
3. Pour le mélange d’enzymes 2, ajouter 20 μL de tampon Y à l’aliquote décongelée de 10 μL de l’enzyme A.

6. Protocole de dissociation cérébrale adulte¹⁷

REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec des échantillons, les tubes doivent être placés dans un rack à tubes à température ambiante pendant que BSA et D-PBS restent sur la glace, sauf indication contraire.

1. Allumez le dissociateur.
2. Utilisez des pinces pour transférer les morceaux de tissu de l’hippocampe dans le tube C.
3. Transférer 30 μL du mélange enzymatique 2 dans le tube C. Tournez le capuchon jusqu’à ce que la tension se fasse sentir, puis serrez jusqu’à ce qu’il clique.
4. Placez le tube C à l’envers dans une position du dissociateur; l’échantillon se verra attribuer l’état Sélectionné (Figure 2). Fixez l’appareil de chauffage sur le tube C.
5. Appuyez sur l’icône du dossier, sélectionnez le dossier Favoris, faites défiler jusqu’au programme 37C_ABDK_02 et sélectionnez-le. Cliquez sur OK pour appliquer le programme à tous les tubes C sélectionnés, puis appuyez sur Démarrer (Figure 2).
6. Étiquetez un tube conique de 50 mL par échantillon.
7. Placez une passoire cellulaire de 70 μm sur chaque tube conique de 50 mL et mouillez avec 2 mL de tampon BSA.
8. À la fin du programme, retirez le chauffage et le tube C du dissociateur.
9. Ajouter 4 mL de tampon BSA à l’échantillon et appliquer le mélange sur la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 mL.
10. Ajouter 10 mL de D-PBS au tube C, le fermer et faire tourbillonner doucement la solution. Appliquez-le sur la passoire cellulaire sur le tube conique de 50 mL.
11. Jetez la passoire cellulaire et le tube C. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Ensuite, aspirez et jetez le surnageant.

7. Enlèvement des débris

1. Remettre en suspension la pastille avec 1550 μL de D-PBS froid et transférer la suspension dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
2. Ajouter 450 μL de solution froide d’élimination des débris et pipeter de haut en bas (ne pas vortex).
   REMARQUE: La solution d’élimination des débris est un réactif dans le kit de dissociation Brian¹⁷ pour adultes commercial.
3. Superposez doucement 1 mL de D-PBS froid sur le dessus de la suspension cellulaire, en gardant la pointe contre la paroi du tube conique. Répétez l’opération jusqu’à ce que la superposition totale soit de 2 mL.
   REMARQUE: Cette étape est critique; performer avec compétence et dextérité.
4. Centrifuger à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C avec accélération complète et freinage complet.
   REMARQUE: Si les phases ne sont pas clairement séparées, répétez les étapes 7.2 à 7.3. Centrifuger une dernière fois à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. La suspension doit maintenant être composée de trois couches distinctes (figure 3). Aspirer la couche supérieure. Balayez la pointe de la pipette d’avant en arrière pour aspirer la couche intermédiaire blanche. Retirez autant que possible la couche intermédiaire sans perturber la couche inférieure.
   REMARQUE: Cette étape est critique; performer avec compétence et dextérité.
6. Ajouter 2 mL de D-PBS froid et pipeter de haut en bas pour mélanger.
7. Centrifuger à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C avec accélération complète et freinage complet. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de tampon BSA.
   REMARQUE: Les cellules peuvent être remises en suspension dans le tampon approprié, puis marquées magnétiquement et isolées en préparation du séquençage unicellulaire à ce stade.

8. Nombre de cellules

1. Effectuer le comptage des cellules conformément au protocole du fabricant du compteur de cellules disponibles (une option est indiquée dans le tableau des matériaux)

9. Tache vivante/morte

1. Centrifuger les 900 μL restants (à partir de 7,7) à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C à pleine accélération et freinage complet.
2. Pendant que l’échantillon tourne, étiquetez un tube d’écoulement par échantillon et enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour limiter l’exposition à la lumière.
3. Aspirer et jeter le surnageant.
4. Remettre la pastille dans 50 μL de teinture vivante/morte diluée (préalablement préparée).
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans un réglage de faible luminosité. Éteignez les lumières de la pièce pour y parvenir.
5. Transférer chaque échantillon dans le tube d’écoulement étiqueté correspondant et incuber à température ambiante pendant 8 à 10 minutes dans l’obscurité (par exemple, un tiroir ou une boîte).
6. Ajouter 500 μL de tampon BSA et centrifuger à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C à pleine accélération et freinage complet.
7. Aspirer et jeter le surnageant.
   REMARQUE: La pastille peut ne pas être visible; laisser une petite quantité de tampon derrière afin de ne pas aspirer involontairement la pastille. Les cellules peuvent être remises en suspension dans le tampon approprié, bloquées et colorées avec des anticorps spécifiques à la cellule à ce stade. Voir le fichier supplémentaire 1 pour l’exemple de protocole¹⁸.

10. Fixation (facultatif)

1. Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de PFA à 1 % (préalablement préparée). Incuber pendant 15 min à 4 °C.
2. Laver en ajoutant 500 μL de D-PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
3. Aspirer le surnageant.
   REMARQUE: La pastille peut ne pas être visible; laisser une petite quantité de tampon derrière afin de ne pas aspirer involontairement la pastille.
4. Remettre la pastille dans 200 μL de D-PBS et la conserver à 4 °C jusqu’à 3 jours.

11. Cytométrie en flux

1. Étiquetez les capuchons filtrants sur les nouveaux tubes.
2. À l’aide d’une pipette de 1 mL, pipettez chaque échantillon sur le capuchon du filtre.
3. Centrifuger brièvement à 200 x g à 4 °C, en ne permettant à la centrifugeuse d’atteindre que 200 x g avant d’arrêter la course.
4. Passez au noyau de cytométrie en flux pour l’analyse en aval.

Résultats

Les échantillons ont été traités avec un cytomètre en flux dans une installation centrale, et les données résultantes ont été évaluées à l’aide d’un progiciel d’analyse en flux. Auparavant, les contrôles de compensation étaient analysés - la tache vivante / morte et le contrôle négatif. Si plusieurs fluorochromes sont utilisés, des témoins de fluorescence moins un (FMO) et des témoins à coloration unique doivent être préparés pour chaque anticorps. La compensation du chevauchement spectral p...

Discussion

Plusieurs étapes de ce protocole de dissociation neurale nécessitent une technique compétente et une dextérité - perfusion, aspiration de surnageant et élimination de la myéline. Tout au long du processus de perfusion, les organes internes doivent rester intacts (en plus de retirer le diaphragme et de couper le cœur); cela inclut d’éviter les cavités supérieures du cœur avec l’aiguille papillon. Bien que la quantité de solution saline avec héparine nécessaire varie, le liquide transparent qui s’écou...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting