Dissociação Mecânica e Enzimática Combinada do Tecido Hipocampal cerebral do rato

Resumo

Este protocolo de dissociação de células neurais destina-se a amostras com uma baixa quantidade de material inicial e produz uma suspensão de célula única altamente viável para análise a jusante, com medidas de fixação e coloração opcionais.

Resumo

Este protocolo de dissociação neural (uma adaptação do protocolo que acompanha um kit comercial de dissociação cerebral adulta) otimiza o processamento de tecidos em preparação para análises detalhadas a jusante, como citometria de fluxo ou sequenciamento unicelular. A dissociação neural pode ser conduzida através de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação dela. A natureza delicada das células neuronais pode complicar os esforços para obter a suspensão de célula única altamente viável e verdadeira com detritos celulares mínimos necessários para análise unicelular. Os dados demonstram que essa combinação de dissociação mecânica automatizada e digestão enzimática consistentemente produz uma suspensão unicelular altamente viável (>90%), superando as dificuldades acima mencionadas. Embora algumas das etapas exijam destreza manual, essas etapas diminuem o manuseio da amostra e a perda potencial de células. Este manuscrito detalha cada etapa do processo para equipar outros laboratórios para dissociar com sucesso pequenas quantidades de tecido neural em preparação para análise a jusante.

Introdução

O hipocampo foi descrito pela primeira vez por um anatomista bolonhesa, Giulio Cesare Aranzio, em 1500^. Ao nomear esta nova estrutura, Aranzio foi provavelmente inspirado por sua estranha semelhança com o cavalo-marinho do gênero Hipocampo¹. O hipocampo está envolvido em respostas ao estresse, mas é amplamente conhecido por seu papel no aprendizado e na memória. Mais especificamente, o hipocampo é responsável pela codificação e recuperação da memória declarativa e espacial¹.

O hipocampo, ou hipocampo propriamente dito, é dividido nos subcampos CA1 (cornu ammonis), CA2 e CA3¹. Comparado com o resto do sistema nervoso, o hipocampo tem várias características únicas de definição, incluindo sua plasticidade e potencial para neurogênese^{contínua 2}. Neurogênese é o processo de proliferação e diferenciação de células-tronco neurais, seguida por sua integração na rede neuronal pré-existente. A neurogênese é restrita à zona subgranular do giro dentado e da zona subventricular dos ventrículos laterais (e das lâmpadas olfativas)³. Embora a neurogênese seja abundante em embriogênese, é um processo ao longo da vida ^3,4. Como tal, essa discussão se concentrará na neurogênese adulta no hipocampo.

As zonas subventricular e subgranular são nichos neurogênicos contendo células ependísicas e vasculares, bem como linhagens imaturas e maduras de células-tronco neurais⁵. A microglia contribui para esses nichos como células imunes para regular a neurogênese⁶. Progenitoras neurais são progenias não-progenias de células-tronco de células-tronco neurais⁷. Três tipos de progenitores neurais estão presentes na zona subventricular: células tipo B radial, progenitores progenitores do tipo C e neuroblastos tipo A ^3,8. As células progenitoras neurais do tipo B na zona subventricular podem se diferenciar em células tipo C que dividem lentamente⁸. Posteriormente, as células tipo C se diferenciam em células tipo A⁸. Esses neuroblastos migram através do fluxo migratório rostral para a lâmpada olfativa antes de se diferenciarem em interneurons ou oligodendrocytes⁹. Estes interneurônios de bulbo olfativos são fundamentais para a memória olfativa de curto prazo, e aprendizado associativo, enquanto os oligodendrocitos myelinatos axônios do corpus calosum⁹. A maioria da neurogênese adulta ocorre na zona subgranular do giro dentado, onde progenitores neurais radiais tipo 1 e não racial 2 são encontrados³. A maioria das células progenitoras neurais estão destinadas a se tornar neurônios dentes e astrócitos¹⁰. Conectados por junções de lacunas, os astrócitos formam redes para modular plasticidade, atividade sináptica e excitabilidade neuronal⁵. Como o neurônio excitatório primário do giro dentado, as células de grânulo fornecem entrada do córtex entorhinal para a região^{CA3 11}.

As populações de células-tronco neurais podem ser isoladas usando estratégias de isolamento imunomagnético ou imunofluorescente^12,13. O tecido neural é particularmente difícil de dissociar; esforços para fazê-lo muitas vezes resultam em amostras com má viabilidade celular e/ou não produzem a suspensão de célula única necessária para análise a jusante. A dissociação neural pode ser conduzida por meio de dissociação mecânica (como o uso de filtros, técnicas de corte ou trituração de pipetas), digestão enzimática ou uma combinação de técnicas^14,15. Em estudo que avaliou os métodos de dissociação neural, foram comparadas¹⁵ a viabilidade e a qualidade da dissociação mecânica manual por trituração de pipetas versus combinações de trituração de pipetas e digestão com várias enzimas. A qualidade foi classificada com base na quantidade de aglomerados celulares e DNA ou detritos subcelulares na suspensão preparada¹⁵. As suspensões de tumores gliais submetidos apenas à dissociação mecânica manual apresentaram viabilidade celular significativamente menor do que os tratamentos com dispase ou uma combinação de DNase, colagenase e hialuronidase¹⁵. Volovitz et al. reconheceram a variação da viabilidade e da qualidade entre os diferentes métodos e enfatizaram que a dissociação inadequada pode reduzir a precisão da análise a jusante¹⁵.

Em um estudo separado, os autores compararam mais de 60 métodos diferentes e combinações de dissociação de células neuronais cultivadas¹⁴. Estes métodos incluíram oito variações diferentes de dissociação mecânica manual por trituração de pipetas, comparação da incubação com cinco enzimas individuais em três intervalos diferentes, e várias combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática ou a combinação de duas enzimas¹⁴. Nenhum dos métodos mecânicos resultou em uma suspensão de célula única¹⁴. Quatro dos tratamentos enzimáticos únicos, dez dos tratamentos enzimáticos combinados, e quatro das combinações de dissociação mecânica com digestão enzimática produziram uma suspensão unicelular¹⁴. Digestão enzimática com TrypLE seguido por Trypsin-EDTA mais efetivamente dissociado amostras¹⁴. Aliás, amostras tratadas com TrypLE e/ou Trypsin-EDTA tendem a formar aglomerados gelatinosos¹⁴. Embora este estudo tenha sido realizado em células cultivadas, ele fala apenas das deficiências da trituração de pipetas ou da digestão enzimática.

Faltam comparações lado a lado de dissociação mecânica manual versus automatizada. No entanto, um grupo executou citometria de fluxo para comparar a dissociação mecânica manual e semi-automatizada de cérebros inteiros de camundongos em conjunto com os kits comerciais de dissociação enzimática papain ou trypsin¹⁶. O processamento com o dissociador produziu de forma mais consistente células viáveis¹⁶. Após a dissociação, os autores também isolaram células prominina-1, células precursoras neuronais e microglia¹⁶. Para duas das três populações celulares isoladas, a pureza das células isoladas foi ligeiramente maior quando as amostras foram processadas com o dissociador, em comparação com^{manualmente 16}. Reiß et al. observaram que a variabilidade de pessoa para pessoa na técnica de pipetagem dificulta a reprodutibilidade do rendimento da população celular viável na dissociação tecidual¹⁶. Os autores concluíram que a dissociação mecânica automatizada padroniza o processamento da amostra¹⁶.

O método de dissociação descrito neste manuscrito é uma combinação de dissociação mecânica totalmente automatizada e digestão enzimática, utilizando soluções que acompanham um kit comercial de dissociação cerebral adulta¹⁷. Ao contrário dos protocolos padrão, este protocolo otimizado reduz a manipulação da amostra, produz uma suspensão de célula única altamente viável, e destina-se a processar quantidades mínimas de tecido inicial.

Protocolo

Os experimentos foram realizados de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UAMS. Camundongos fêmeas C57Bl6/J de 6 meses de idade foram comprados e agrupados (4 ratos por gaiola) sob um ciclo constante de 12 horas de luz/escuridão.

1. Preparação de reagentes

1. Prepare a solução de estoque de manchas vivas/mortas fixas. Reconstitua a mancha fluorescente com 20 μL de sulfóxido de dimetila (DMSO).
2. Enrole o frasco em papel alumínio, rotule-o como "Reconstituído", e armazene-o a -20 °C por até seis meses.
3. Prepare uma solução salina de 0,9% com heparina. Diluir o conteúdo de um frasco de sódio heparina (10.000 unidades usp por 10 mL) em 1 L de água dupla destilada (ddH₂O).
4. Prepare o suficiente para aproximadamente 45 mL por animal e armazene a 4 °C por até uma semana.
5. Faça 1% de paraformaldeído (PFA).
   1. Em um capô de fumaça, aqueça uma placa quente a 50 °C. Em um micro-ondas, aqueça 100 mL de ddH₂O em um copo de vidro a aproximadamente 60 °C. Adicione uma barra de agitação magnética e transfira para a placa quente.
   2. No capô da fumaça, pese 1 g de PFA e adicione ao béquer de ddH₂O. Adicione 0,1125 g de cristais NaOH e misture até dissolver (5-10 min).
   3. Adicione 0,4 g de NaPO_4- monobásico e misture até dissolver (2-5 min). Filtrar a solução e ajustar o pH para 7.4 com HCl e NaOH.
   4. Esfrie no gelo ou a 4°C por 30 minutos antes de armazenar.
      NOTA: As alíquotas de 1,5 mL podem ser armazenadas a -20 °C durante um ano. Evite ciclos de congelamento. Se, após o descongelamento, a solução ficar nublada ou um precipitado tiver se formado, a solução não deve ser utilizada.
      ATENÇÃO: Tóxico, inflamável. Sempre trabalhe com PFA sob um capô ventilado usando equipamento de proteção individual adequado.
6. Enzima liofilizada resuspend com 1 mL de Tampão A. Não vórtice a solução.
   NOTA: Enzima A e Buffer A, bem como buffers A, Y e Z são reagentes no kit comercial de dissociação do cérebro adulto¹⁷.
7. Divida a enzima P em alíquotas de 50 μL e resuspend Enzima A em alíquotas de 10 μL. Por instruções de kit, armazene a -20 °C por até seis meses. Evite ciclos de congelamento.

2. Dia de experimento

1. Esfrie a centrífuga de mesa a 4 °C.
2. Coloque aliquot(s) de PFA na geladeira para descongelamento gradual.
3. Coloque a mancha viva/morta reconstituída no escuro (por exemplo, uma gaveta) para descongelar à temperatura ambiente.
4. Prepare o tampão de soro bovino (BSA). Adicione 0,5 g de BSA a 100 mL da solução tamponada de fosfato de 1x Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS), pH 7.2.
5. Adicione uma barra de mexida e misture em uma placa de mexida por 30 minutos. Transfira para tubos cônicos de 50 mL e armazene a 4 °C.
   NOTA: Use sempre o buffer BSA recém-preparado.
6. Prepare a diluição de trabalho de mancha viva/morta. Adicione 1 μL da solução de estoque de manchas vivas/mortas reconstituídas a 360 μL D-PBS e armazene-a no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa) à temperatura ambiente. Prepare 50 μL da diluição de trabalho por amostra.

3. Perfusão

1. Coloque a solução salina com heparina no gelo.
2. Ligue o oxigênio, coloque a bola indicadora do medidor de fluxo no sistema vaporizador de anestesia animal de pequeno porte para 1 L/min. Certifique-se de que há pressão adequada de oxigênio e isoflurane.
3. Ajuste o mostrador vaporizador para 3,5% (para indução e manutenção).
4. Prime as linhas de bomba de perfusão com a solução salina/heparina. Defina a velocidade para 6 mL/min.
5. Coloque o mouse na câmara de indução, ligue o respirador e espere vários minutos até que o mouse não responda. Confirme a profundidade suficiente da anestesia através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva.
6. Coloque o mouse de costas na bandeja de dissecção com o nariz no cone do nariz. Realize uma confirmação secundária de anestesia total através da ausência de retirada do pedal para beliscar nociva. Coloque as quatro patas na bandeja.
7. Pulverize o abdômen do animal com 20% de etanol.
8. Usando fórceps, belisque o abdômen inferior e levante a pele. Use uma tesoura para cortar a pele e a pele até o fundo da caixa torácica.
9. Faça duas incisões diagonais abaixo da caixa torácica em direção a cada ombro.
10. Ressesseça cuidadosamente o diafragma (evitando os pulmões e o coração). Ressecante a caixa torácica para expor o coração.
11. Corte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo ao redor do coração.
    NOTA: As etapas 3.10-3.11 são críticas; realizar com proficiência e destreza.
12. Use a tesoura para prender o átrio direito (lobo escuro no canto superior esquerdo do coração). Desligue o fluxo de isoflurane para o respiro.
13. Mantenha o coração firme com fórceps. Com o bisel da agulha borboleta virado para cima, fure o ventrículo esquerdo mantendo o nível da agulha e paralelo ao animal.
14. Segure a agulha no lugar, ligue a bomba e perfunda pelo menos 30 mL da solução salina/heparina até que o fluido que sai do coração fique opaco e o fígado e pulmões pálidos em cores.
    NOTA: As etapas 3.13-3.14 são críticas; realizar com proficiência e destreza.
15. Desligue a bomba, remova a agulha e transfira o mouse para a área de dissecção.

4. Dissecção

1. Usando uma tesoura cirúrgica grande, decapite a cabeça.
2. Corte a pele da parte de trás da cabeça até os olhos. Descasque a pele para trás para expor o crânio.
3. Corte o crânio entre os olhos. Faça dois cortes na parte de trás do crânio, nas posições das 10 e 2 horas, em seguida, faça um corte longo (mantenha as pontas para evitar danificar o cérebro) ao longo da linha midsagittal do crânio até o corte original entre os olhos.
4. Use fórceps para descascar as duas metades do crânio para os lados. Use uma espátula para remover o cérebro e coloque-o em uma placa de petri de vidro de 60 mm no gelo cheio de D-PBS frio (Figura 1).
5. Use um bisturi ou navalha para separar cada hemisfério. Em seguida, remova as lâmpadas olfativas e o cerebelo.
6. Use fórceps para remover o cérebro médio até que o hipocampo seja exposto.
7. Proteja o cérebro com fórceps. Usando um segundo conjunto de fórceps, provoque suavemente o hipocampo de cada hemisfério, e transfira ambos o hipocampi para um tubo de 1,5 mL rotulado contendo D-PBS frio.
8. Coloque o tubo de amostra contendo os dois hipocampi do rato no gelo.

5. Prepare a enzima Mix 1 e 2 para cada amostra

NOTA: Para volumes superiores a 2 mL, utilize uma pipeta sorológica de 10 mL; para volumes, 200 μL-2 mL, use uma pipeta de 1000 μL; para volumes, 21-199 μL, use uma pipeta de 200 μL; para volumes, 2-20 μL, use uma pipeta de 20 μL; para volumes abaixo de 2 μL, use uma pipeta de 0-2 μL.

1. Para cada amostra, descongele uma alíquota cada de Enzima P e Enzima A à temperatura ambiente.
2. Para enzime mix 1, combine 50 μL de Enzima P e 1900 μL de Buffer Z em um tubo C rotulado (Tabela de Materiais).
3. Para enzima mix 2, adicione 20 μL de Buffer Y ao aliquot de 10 μL descongelado da Enzima A.

6. Protocolo de dissociação cerebral adulto¹⁷

NOTA: Ao trabalhar com amostras, os tubos devem ser colocados em um rack de tubo em temperatura ambiente, enquanto BSA e D-PBS permanecem no gelo, a menos que observados de outra forma.

1. Ligue o dissociador.
2. Use fórceps para transferir os pedaços de tecido hipocampi para o tubo C.
3. Transfira 30 μL de enzima mistura 2 para o tubo C. Torça a tampa até sentir a tensão, em seguida, aperte até que clique.
4. Coloque o tubo C de cabeça para baixo em uma posição do dissociador; a amostra será atribuída ao status Selecionado (Figura 2). Fixar o aquecedor sobre o tubo C.
5. Pressione o ícone da pasta, selecione A pasta Favoritos , role e selecione o programa 37C_ABDK_02 . Clique em OK para aplicar o programa a todos os tubos C selecionados e toque em Iniciar (Figura 2).
6. Rotule um tubo cônico de 50 mL por amostra.
7. Coloque um coador de células de 70 μm em cada tubo cônico de 50 mL e molhado com 2 mL de tampão BSA.
8. Após a conclusão do programa, remova o aquecedor e o tubo C do dissociador.
9. Adicione 4 mL de tampão BSA à amostra e aplique a mistura ao coador celular no tubo cônico de 50 mL.
10. Adicione 10 mL de D-PBS ao tubo C, feche-o e gire a solução suavemente. Aplique-o no coador de células no tubo cônico de 50 mL.
11. Descarte o coador de células e o tubo C. Centrifugar a suspensão a 300 x g por 10 min a 4 °C. Então, aspire e descarte o supernatante.

7. Remoção de detritos

1. Resuspenda a pelota com 1550 μL de D-PBS frio e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL rotulado.
2. Adicione 450 μL de solução de remoção de detritos frios e pipeta para cima e para baixo (não vórtice).
   NOTA: A Solução de Remoção de Detritos é um reagente no kit comercial de dissociação de Brian¹⁷.
3. Sobreponha suavemente 1 mL de D-PBS frio em cima da suspensão da célula, mantendo a ponta contra a parede do tubo cônico. Repita até que a sobreposição total seja de 2 mL.
   NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza.
4. Centrifugar a 3000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio total.
   NOTA: Se as fases não estiverem claramente separadas, repita as etapas 7.2-7.3. Centrifugar um tempo final em 1000 x g para 10 min a 4 °C.
5. A suspensão deve agora consistir em três camadas distintas (Figura 3). Aspire a camada mais alta. Varrer a ponta pipeta para frente e para trás para aspirar a camada média branca. Remova o máximo possível da camada média sem perturbar a camada mais baixa.
   NOTA: Este passo é crítico; realizar com proficiência e destreza.
6. Adicione 2 mL de D-PBS frio e pipeta para cima e para baixo para misturar.
7. Centrifugar a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo. Aspire e descarte o supernaspe. Resuspense a pelota em 1 mL de buffer BSA.
   NOTA: As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado e, em seguida, rotuladas magneticamente e isoladas em preparação para sequenciamento de células únicas neste momento.

8. Contagem celular

1. Execute a contagem de células de acordo com o protocolo do fabricante do contador de células disponível (uma opção é notada na Tabela de Materiais)

9. Mancha viva/morta

1. Centrifugar os 900 μL restantes (de 7,7) a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.
2. Enquanto a amostra estiver girando, rotule um tubo de fluxo por amostra e enrole-o em papel alumínio para limitar a exposição à luz.
3. Aspire e descarte o supernaspe.
4. Resuspend a pelota em 50 μL de mancha viva/morta diluída (previamente preparada).
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma configuração de baixa luz. Desligue as luzes da sala aérea para conseguir isso.
5. Transfira cada amostra para o tubo de fluxo rotulado correspondente e incubar à temperatura ambiente por 8-10 min no escuro (por exemplo, uma gaveta ou caixa).
6. Adicione 500 μL de tampão BSA e centrífuga a 1000 x g por 10 min a 4 °C com aceleração total e freio completo.
7. Aspire e descarte o supernaspe.
   NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota. As células podem ser resuspendidas no buffer apropriado, bloqueadas e manchadas com anticorpos específicos das células neste momento. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para o protocolo de amostra¹⁸.

10. Fixação (opcional)

1. Resuspense a pelota em 200 μL de 1% pfa (previamente preparado). Incubar por 15 min a 4 °C.
2. Lave adicionando 500 μL de D-PBS e centrífuga a 300 x g por 10 min a 4 °C.
3. Aspire o supernatante.
   NOTA: A pelota pode não ser visível; Deixe uma pequena quantidade de tampão para trás para não aspirar involuntariamente a pelota.
4. Resuspense a pelota em 200 μL de D-PBS e armazene a 4 °C por até 3 dias.

11. Citometria de fluxo

1. Rotule as tampas do filtro nos novos tubos.
2. Usando uma pipeta de 1 mL, pipeta cada amostra na tampa do filtro.
3. Centrifugar brevemente a 200 x g a 4 °C, permitindo apenas que a centrífuga atinja 200 x g antes de parar a corrida.
4. Prossiga para o núcleo de citometria de fluxo para análise a jusante.

Resultados

As amostras foram processadas com um citômetro de fluxo em uma instalação central, e os dados resultantes foram avaliados com um pacote de software para análise de fluxo. Anteriormente, foram analisados os controles de compensação- a mancha viva/morta e o controle negativo. Se forem utilizados vários fluorochromes, os controles de fluorescência menos um (FMO) e os controles de uma única mancha devem ser preparados para cada anticorpo. A compensação pela sobreposição espectral para as amostras experimentais f...

Discussão

Várias etapas neste protocolo de dissociação neural requerem técnica proficiente e destreza-perfusão, aspiração supernante e remoção de mielina. Durante todo o processo de perfusão, os órgãos internos devem permanecer intactos (além de remover o diafragma e cortar o coração); isso inclui evitar as câmaras superiores do coração com a agulha borboleta. Enquanto a quantidade de soro fisiológico com heparina necessária varia, o fluido transparente que flui do coração indica que o processo está completo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting