Комбинированная механическая и ферментативная диссоциация ткани гиппокампа мозга мыши

Резюме

Этот протокол диссоциации нервных клеток предназначен для образцов с небольшим количеством исходного материала и дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию для последующего анализа с дополнительными этапами фиксации и окрашивания.

Аннотация

Этот протокол нейронной диссоциации (адаптация протокола, сопровождающего коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека) оптимизирует обработку тканей при подготовке к подробному последующему анализу, такому как проточная цитометрия или секвенирование одиночных клеток. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или их комбинации. Деликатная природа нейрональных клеток может усложнить усилия по получению очень жизнеспособной, истинной одноклеточной суспензии с минимальным клеточным мусором, которая требуется для анализа одной клетки. Данные показывают, что эта комбинация автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения последовательно дает очень жизнеспособную (>90%) одноклеточную суспензию, преодолевая вышеупомянутые трудности. Хотя некоторые из шагов требуют ручной ловкости, эти шаги уменьшают обработку образцов и потенциальную потерю клеток. В этой рукописи подробно описывается каждый этап процесса, чтобы оснастить другие лаборатории для успешной диссоциации небольших количеств нервной ткани при подготовке к последующему анализу.

Введение

Гиппокамп был впервые описан болонским анатомом Джулио Чезаре Аранцио в 1500-х годах¹. Называя эту новообретенную структуру, Аранцио, вероятно, был вдохновлен ее странным сходством с морским коньком рода Hippocampus¹. Гиппокамп участвует в стрессовых реакциях, но широко известен своей ролью в обучении и памяти. Более конкретно, гиппокамп отвечает за кодирование и извлечение декларативной и пространственной памяти¹.

Гиппокамп, или собственно гиппокамп, делится на подполя CA1 (cornu ammonis), CA2 и CA3¹. По сравнению с остальной нервной системой, гиппокамп имеет несколько уникальных определяющих характеристик, включая его пластичность и потенциал для продолжающегося нейрогенеза². Нейрогенез – это процесс пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток с последующей их интеграцией в уже существующую нейронную сеть. Нейрогенез ограничен субгранулярной зоной зубчатой извилины и субвентрикулярной зоной боковых желудочков (и обонятельных луковиц)³. В то время как нейрогенез в изобилии присутствует в эмбриогенезе, это пожизненный процесс ^3,4. Таким образом, эта дискуссия будет сосредоточена на взрослом нейрогенезе в гиппокампе.

Субвентрикулярная и субгранулярная зоны представляют собой нейрогенные ниши, содержащие эпендимальные и сосудистые клетки, а также незрелые и зрелые линии нервных стволовых клеток⁵. Микроглия вносит свой вклад в эти ниши в качестве иммунных клеток для регулирования нейрогенеза⁶. Нейронные клетки-предшественники являются нестемочными клетками-потомками нервных стволовых клеток⁷. В субвентрикулярной зоне присутствуют три типа нейронных предшественников: радиальные глиоподобные клетки типа В, транзитоусиливающие предшественники типа С и нейробласты типа А ^3,8. Медленно делящиеся нейронные клетки-предшественники типа В в субвентрикулярной зоне могут дифференцироваться в быстро делящиеся клетки типа С⁸. Впоследствии клетки типа С дифференцируются в клетки типа А⁸. Эти нейробласты мигрируют через ростральный миграционный поток к обонятельной луковице, прежде чем дифференцироваться в интернейроны или олигодендроциты⁹. Эти интернейроны обонятельных луковиц являются ключом к обонятельной кратковременной памяти и ассоциативному обучению, тогда как олигодендроциты миелинизируют аксоны мозолистого тела⁹. Большая часть взрослого нейрогенеза происходит в подгранулевой зоне зубчатой извилины, где находятся радиальные нейронные предшественники типа 1 и нерадиальные нейронные предшественники типа^2. Большинству нейронных клеток-предшественников суждено стать зубчатыми гранулярными нейронами и астроцитами¹⁰. Соединенные щелевыми соединениями, астроциты образуют сети для модуляции пластичности, синаптической активности и возбудимости нейронов⁵. В качестве первичного возбуждающего нейрона зубчатой извилины гранулярные клетки обеспечивают вход из энторинальной коры в область CA3¹¹.

Популяции нервных стволовых клеток могут быть выделены с использованием иммуномагнитных или иммунофлуоресцентных стратегий изоляции^12,13. Нервную ткань особенно трудно диссоциировать; попытки сделать это часто приводят к тому, что образцы с плохой жизнеспособностью клеток и/или не получают необходимой одноклеточной суспензии для последующего анализа. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или комбинации методов^14,15. В исследовании, оценивающем методы нейронной диссоциации, жизнеспособность и качество ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки по сравнению с комбинациями тритурации пипетки и пищеварения с различными ферментами сравнивались¹⁵. Качество оценивали на основе количества клеточных сгустков и ДНК или субклеточного мусора в подготовленной суспензии¹⁵. Суспензии глиальных опухолей, подвергшихся только ручной механической диссоциации, имели значительно более низкую жизнеспособность клеток, чем лечение диспазой или комбинацией ДНКазы, коллагеназы и гиалуронидазы¹⁵. Volovitz et al. признали различия в жизнеспособности и качестве между различными методами и подчеркнули, что неадекватная диссоциация может снизить точность последующего анализа¹⁵.

В отдельном исследовании авторы сравнили более 60 различных методов и комбинаций диссоциации культивируемых нейрональных клеток¹⁴. Эти методы включали восемь различных вариаций ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки, сравнение инкубации с пятью отдельными ферментами через три различных интервала и различные комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением или комбинацией двух ферментов¹⁴. Ни один из механических способов не дал одноэлементной суспензии¹⁴. Четыре из одного ферментного лечения, десять комбинированных ферментативных методов лечения и четыре комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением дали одноклеточную суспензию¹⁴. Ферментативное сбраживание с TrypLE с последующим трипсином-ЭДТА наиболее эффективно диссоциировало образцы¹⁴. Кстати, образцы, обработанные TrypLE и/или Trypsin-EDTA, имели тенденцию образовывать желатиновые сгустки¹⁴. Хотя это исследование было проведено на культивируемых клетках, оно говорит о недостатках тритурации пипетки или ферментативного пищеварения.

Параллельные сравнения ручной и автоматизированной механической диссоциации отсутствуют. Тем не менее, одна группа провела проточную цитометрию для сравнения ручной и полуавтоматической механической диссоциации всего мозга мыши в сочетании с коммерческими наборами ферментативной диссоциации папаина или трипсина¹⁶. Обработка диссоциатором более последовательно давала жизнеспособные клетки¹⁶. После диссоциации авторы также выделили клетки Проминина-1, нейрональные клетки-предшественники и микроглию¹⁶. Для двух из трех изолированных клеточных популяций чистота изолированных клеток была немного выше, когда образцы обрабатывали диссоциатором, по сравнению с вручную¹⁶. Reiß et al. отметили, что вариабельность от человека к человеку в методе пипетирования препятствует воспроизводимости жизнеспособного выхода клеточной популяции при диссоциации^{тканей 16}. Авторы пришли к выводу, что автоматизированная механическая диссоциация стандартизирует обработку образцов¹⁶.

Метод диссоциации, описанный в этой рукописи, представляет собой комбинацию полностью автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения с использованием растворов, сопровождающих коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека¹⁷. В отличие от стандартных протоколов, этот оптимизированный протокол уменьшает манипуляции с образцами, дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию и предназначен для обработки минимальных количеств исходной ткани.

протокол

Эксперименты проводились в соответствии с этическими нормами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при UAMS. 6-месячные самки мышей дикого типа C57Bl6/J были куплены и размещены в группе (4 мыши на клетку) в течение постоянного 12-часового светло-темного цикла.

1. Подготовка реагентов

1. Приготовьте поправимый раствор для живых/мертвых пятен. Восстановите флуоресцентное пятно с 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
2. Заверните флакон в фольгу, пометьте его как «Восстановленный» и храните при температуре -20 °C до шести месяцев.
3. Готовят 0,9% физиологический раствор с гепарином. Развести содержимое одного флакона гепарина натрия (10 000 единиц USP на 10 мл) в 1 л двойной дистиллированной воды (ddH₂O).
4. Приготовьте достаточно примерно на 45 мл на животное и храните при температуре 4 °C в течение одной недели.
5. Внесите 1% параформальдегида (PFA).
   1. В вытяжном шкафу нагрейте конфорку до 50 °C. В микроволновой печи нагрейте 100 мл ddH₂O в стеклянном стакане примерно до 60 °C. Добавьте магнитный мешалку и переложите на конфорку.
   2. В вытяжной капюшон взвесить 1 г PFA и добавить в стакан ddH₂O. Добавить 0,1125 г кристаллов NaOH и перемешать до растворения (5-10 мин).
   3. Добавьте 0,4 г NaPO_{4-моноосновного} и перемешайте до растворения (2-5 мин). Вакуумная фильтрация раствора и регулировка рН до 7,4 с помощью HCl и NaOH.
   4. Остудить на льду или при 4°C в течение 30 мин перед хранением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты 1,5 мл могут храниться при -20 °C в течение одного года. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. Если после оттаивания раствор помутнеет или образовался осадок, раствор использовать не следует.
      ВНИМАНИЕ: Токсичный, легковоспламеняющийся. Всегда работайте с ПФА под вентилируемым капотом в надлежащих средствах индивидуальной защиты.
6. Повторное суспендирование лиофилизированного фермента А с 1 мл буфера А. Не вихряйте раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент А и буфер А, а также буферы A, Y и Z являются реагентами в коммерческом наборе для диссоциации мозга взрослого человека¹⁷.
7. Разделить фермент Р на аликвоты по 50 мкл и повторно суспендировать фермент А на 10 мкл аликвоты. В соответствии с инструкциями по набору хранить при температуре -20 °C до шести месяцев. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.

2. День эксперимента

1. Охладите настольную центрифугу до 4 °C.
2. Поместите аликвоту (аликвоты) PFA в холодильник для постепенного размораживания.
3. Поместите восстановленное живое/мертвое пятно в темноту (например, ящик), чтобы оттаять при комнатной температуре.
4. Подготовьте буфер сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA). Добавьте 0,5 г BSA к 100 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco без кальция и магния (D-PBS), рН 7,2.
5. Добавьте перемешивание и перемешайте на перемешиваемой пластине в течение 30 минут. Переложить в конические трубки объемом 50 мл и хранить при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный буфер BSA.
6. Приготовьте живое/мертвое пятно, рабочее разбавление. Добавьте 1 мкл восстановленного живого/мертвого раствора для пятен в 360 мкл D-PBS и храните его в темноте (например, в ящике или коробке) при комнатной температуре. Приготовьте 50 мкл рабочего разбавления на образец.

3. Перфузия

1. Поместите солевой раствор с гепарином на лед.
2. Включите кислород, установите индикаторный шарик расходомера на системе испарителя анестезии мелких животных на 1 л/мин. Убедитесь, что есть адекватное давление кислорода и изофлурана.
3. Отрегулируйте циферблат испарителя до 3,5% (для индукции и технического обслуживания).
4. Загрунтуйте перфузионные насосные линии раствором физиологического раствора/гепарина. Установите скорость 6 мл/мин.
5. Поместите мышь в индукционную камеру, включите дыхательную машину и подождите несколько минут, пока мышь не перестанет реагировать. Подтвердить достаточную глубину анестезии за счет отсутствия снятия педали до вредного защемления.
6. Поместите мышь на спину на лоток для рассечения носом в носовом конусе. Выполните вторичное подтверждение полной анестезии через отсутствие отвода педали до вредного щепотки. Прикрепите все четыре лапы к лотку.
7. Опрыскивайте брюшко животного 20% этанолом.
8. С помощью щипцов зажмите нижнюю часть живота и поднимите кожу. Используйте ножницы, чтобы разрезать мех и кожу до нижней части грудной клетки.
9. Сделайте два диагональных разреза из-под грудной клетки к каждому плечу.
10. Тщательно резецируйте диафрагму (избегая легких и сердца). Ресектируйте грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
11. Осторожно разрежьте любую соединительную ткань вокруг сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.10-3.11 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью.
12. Используйте ножницы, чтобы обрезать правое предсердие (темная доля в левом верхнем углу сердца). Выключите поток изофлурана к дыхательному аппарату.
13. Держите сердце устойчивым щипцами. Скосом иглы бабочки лицом вверх проткните левый желудочек, сохраняя иглу на одном уровне и параллельно животному.
14. Удерживайте иглу на месте, включите насос и перфьмин не менее 30 мл раствора физиологического раствора / гепарина до тех пор, пока жидкость, выходящая из сердца, не станет непрозрачной, а печень и легкие не бледнеют по цвету.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.14 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью.
15. Выключите насос, извлеките иглу и перенесите мышь в область рассечения.

4. Рассечение

1. Используя большие хирургические ножницы, обезглавить голову.
2. Вырежьте мех от затылка до глаз. Очистите кожу обратно, чтобы обнажить череп.
3. Зажмите череп между глазами. Сделайте два разреза в задней части черепа, в положении «10» и «2 часа», затем сделайте один длинный разрез (держите кончики вверх, чтобы не повредить мозг) вдоль средней сагиттальной линии черепа до первоначального разреза между глазами.
4. Используйте щипцы, чтобы отклеить две половины черепа в стороны. Используйте шпатель, чтобы удалить мозг и поместить его в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри на льду, наполненную холодным D-PBS (рисунок 1).
5. Используйте скальпель или бритву, чтобы отделить каждое полушарие. Затем удаляют обонятельные луковицы и мозжечок.
6. Используйте щипцы, чтобы удалить средний мозг до тех пор, пока гиппокамп не будет открыт.
7. Закрепите мозг щипцами. Используя второй набор щипцов, осторожно дразните гиппокамп из каждого полушария и перенесите оба гиппокампа в меченую трубку объемом 1,5 мл, содержащую холодный D-PBS.
8. Поместите пробоотборник, содержащий два гиппокампа от мыши, на лед.

5. Подготовьте ферментную смесь 1 и 2 для каждого образца

ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов более 2 мл используйте серологическую пипетку объемом 10 мл; для объемов 200 мкл-2 мл используйте пипетку 1000 мкл; для объемов, 21-199 мкл, используйте пипетку 200 мкл; для объемов, 2-20 мкл, используйте пипетку 20 мкл; для объемов менее 2 мкл используйте пипетку 0-2 мкл.

1. Для каждого образца разморозьте по одной аликвоте фермента Р и фермента А при комнатной температуре.
2. Для ферментной смеси 1 соедините 50 мкл фермента P и 1900 мкл буфера Z в меченой C-трубке (Таблица материалов).
3. Для смеси ферментов 2 добавьте 20 мкл буфера Y к размороженной 10-мкл аликвоте фермента А.

6. Протокол диссоциации мозга взрослого^{человека 17}

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с образцами трубки должны быть помещены в трубную стойку при комнатной температуре, в то время как BSA и D-PBS остаются на льду, если не указано иное.

1. Включите диссоциатор.
2. Используйте щипцы для переноса кусочков ткани гиппокампа в трубку С.
3. Переложите 30 мкл смеси ферментов 2 в трубку C. Поверните колпачок до тех пор, пока не почувствуется напряжение, затем затяните, пока он не щелкнет.
4. Поместите трубку C вверх ногами в положение диссоциатора; образцу будет присвоен статус Selected (рисунок 2). Закрепите нагреватель над трубкой C.
5. Нажмите значок папки, выберите Папка Избранное , прокрутите до и выберите 37C_ABDK_02 программу. Нажмите OK , чтобы применить программу ко всем выбранным трубкам C, затем нажмите «Пуск» (рисунок 2).
6. Нанесите этикетку на одну коническую пробирку объемом 50 мл на образец.
7. Поместите клеточный ситечко 70 мкм на каждую коническую трубку объемом 50 мл и смочите 2 мл буфера BSA.
8. По завершении программы снимите нагреватель и трубку С из диссоциатора.
9. Добавьте 4 мл буфера BSA к образцу и нанесите смесь на клеточный ситечко на конической пробирке объемом 50 мл.
10. Добавьте 10 мл D-PBS в трубку C, закройте ее и осторожно закрутите раствор. Нанесите его на клеточный ситечко на конической трубке объемом 50 мл.
11. Выбросьте клеточный ситечко и трубку C. Центрифугировать суспензию при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C. Затем аспирируйте и выбросьте супернатант.

7. Удаление мусора

1. Повторно суспендировать гранулу с 1550 мкл холодного D-PBS и перенести суспензию в меченую коническую трубку объемом 15 мл.
2. Добавьте 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и пипетку вверх и вниз (не вихрь).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для удаления мусора является реагентом в коммерческом наборе для диссоциации взрослого Брайана¹⁷.
3. Аккуратно наложите 1 мл холодного D-PBS поверх клеточной суспензии, удерживая наконечник у стенки конической трубки. Повторять до тех пор, пока общее наложение не составит 2 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью.
4. Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если фазы четко не разделены, повторите шаги 7.2-7.3. Центрифуга конечное время при 1000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
5. Теперь суспензия должна состоять из трех отдельных слоев (рисунок 3). Аспирировать самый верхний слой. Проведите кончик пипетки вперед и назад, чтобы аспирировать белый средний слой. Удалите как можно больше среднего слоя, не нарушая самый нижний слой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью.
6. Добавьте 2 мл холодного D-PBS и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.
7. Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением. Аспирировать и выбросить супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл буфера BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, а затем магнитно маркированы и изолированы в рамках подготовки к секвенированию одиночных клеток на этом этапе.

8. Количество ячеек

1. Выполнять подсчет ячеек в соответствии с протоколом производителя доступного счетчика ячеек (один из вариантов указан в Таблице материалов)

9. Живое/мертвое пятно

1. Центрифуга оставшихся 900 мкл (от 7,7) при 1000 х g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
2. Пока образец вращается, маркируйте одну проточную трубку на образец и оберните ее в фольгу, чтобы ограничить воздействие света.
3. Аспирировать и выбросить супернатант.
4. Повторно суспендировать гранулу в 50 мкл разбавленного живого/мертвого пятна (предварительно приготовленного).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен выполняться при слабом освещении. Выключите верхний свет в комнате, чтобы достичь этого.
5. Переложите каждый образец в соответствующую маркированную проточную трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 8-10 мин в темноте (например, ящик или коробку).
6. Добавьте 500 мкл буфера BSA и центрифуги при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
7. Аспирировать и выбросить супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу. Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, заблокированы и окрашены клеточно-специфическими антителами в этот момент. Пример протокола¹⁸ см. в дополнительном файле 1.

10. Фиксация (опционально)

1. Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл 1% PFA (предварительно приготовленные). Инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
2. Промыть, добавив 500 мкл D-PBS и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
3. Аспирировать супернатанта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу.
4. Повторно суспендировать гранулу в 200 мкл D-PBS и хранить при 4 °C до 3 дней.

11. Проточная цитометрия

1. Наклейте крышки фильтров на новые трубки.
2. Используя пипетку объемом 1 мл, пипетка каждого образца помещается на крышку фильтра.
3. Центрифуга ненадолго при 200 x g при 4 °C, что позволяет центрифуге достигать 200 x g до остановки пробега.
4. Приступайте к проточной цитометрии керна для последующего анализа.

Результаты

Образцы обрабатывали проточным цитометром на стержневом объекте, а полученные данные оценивали с помощью программного пакета для анализа потока. Ранее анализировались компенсационные элементы управления — живое/мертвое пятно и отрицательный контроль. Если используется несколько ф?...

Обсуждение

Несколько шагов в этом протоколе нейронной диссоциации требуют профессиональной техники и ловкости — перфузии, аспирации супернатанта и удаления миелина. На протяжении всего процесса перфузии внутренние органы должны оставаться нетронутыми (кроме удаления диафрагмы и купирования с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting