离体 从内侧前额叶皮层到外嗅皮层的远距离突触传递和可塑性的光遗传学询问

摘要

在这里，我们提出了一种协议，描述了具有光遗传学构建体的离散大脑区域的病毒转导，以允许在急性啮齿动物脑切片中进行突触特异性电生理表征。

摘要

研究大脑中特定突触的生理特性，以及它们如何经历可塑性变化，是现代神经科学的一个关键挑战。传统的 体外 电生理技术使用电刺激来唤起突触传递。这种方法的一个主要缺点是其非特异性;刺激电极区域的所有轴突都将被激活，因此很难将效应归因于特定的传入连接。这个问题可以通过用基于光遗传学的刺激代替电刺激来克服。我们描述了一种将光遗传学与 体外 膜片钳记录相结合的方法。这是研究精确解剖学定义的突触连接的基底突触传递和突触可塑性的有力工具，几乎适用于大脑中的任何通路。在这里，我们描述了编码通道视紫红质蛋白的病毒载体的制备和处理，用于手术注射到啮齿动物大脑中感兴趣的突触前区域（内侧前额叶皮层），并制作下游靶区域的急性切片（外嗅皮层）。还介绍了将膜片钳记录与光刺激突触激活相结合以研究短期和长期突触可塑性的详细程序。我们讨论了通过结合光遗传学和Cre依赖性细胞标记来实现途径和细胞特异性的实验示例。最后，描述感兴趣的突触前区域的组织学确认以及突触后细胞的生物细胞素标记，以允许进一步识别精确位置和细胞类型。

引言

了解突触的生理学以及它们如何经历可塑性变化是了解大脑网络如何在^{健康大脑中}发挥作用的基础1，以及它们如何在脑部疾病中出现故障。使用急性 离体 脑切片允许使用全细胞膜片钳记录以高信噪比记录来自单个神经元的突触的电活动。膜电位控制和直接的药理操作允许分离受体亚型。这些记录可以具有精确的特异性来识别突触后神经元，包括层状和亚区域位置²，细胞形态³，^{分子标记的存在}4，其传入投影⁵，甚至^{最近是否活跃}6。

然而，实现突触前输入的特异性更具挑战性。传统方法使用刺激电极来激发在特定薄片中运行的轴突。这方面的一个例子是在海马体中，辐射层中的局部刺激激活从CA3投射到CA1子场⁷的突触。在这种情况下，由于CA3输入代表位于投射到CA1锥^体细胞8的辐射层内的唯一兴奋性输入，因此实现了突触前特异性。然而，CA3-CA1轴突的常规电突触前激活可实现的这种高度的输入特异性是一个例外，反映在该突触所受到的深入研究中。在其他大脑区域中，来自多个传入通路的轴突共存于同一层中，例如，在新皮层⁹的第1层中，因此使用传统的刺激电极无法进行特定于输入的突触前刺激。这是有问题的，因为不同的突触输入可能具有不同的生理特性;因此，它们的共刺激可能导致突触生理学的错误表征。

光遗传学的出现，即通道视紫红质-2（ChR2）等光敏膜蛋白（视蛋白）的遗传编码，为研究大脑区域之间的孤立突触投影提供了巨大的可能性^10，11。在这里，我们描述了一种可推广且低成本的解决方案，用于研究长距离突触生理学和可塑性。光遗传学构建体使用病毒载体以高度特异性的方式传递，允许对感兴趣的突触前区域进行极其精确的控制。传出投影将表达光激活通道，允许在目标区域中激活这些纤维。因此，可以研究不能通过传统的非特异性电刺激独立激活的长距离解剖弥漫通路。

我们描述了作为示例途径，内侧前额叶皮层（mPFC）与编码兴奋性阳离子通道视蛋白的腺相关病毒（AAV）的转导。然后，我们描述了从外嗅皮层（LEC）制备急性切片，从第5层LEC锥体神经元的膜片钳记录以及谷氨酸能mPFC-LEC投影的光诱发激活（图1）。我们还描述了注射部位的组织学评估，以确认感兴趣的突触前区域的位置并识别突触后细胞形态。

研究方案

所有动物程序均按照《英国动物科学程序法》（1986年）和相关指南以及当地机构指南进行。

1.立体定位病毒注射

注意:当前协议需要解剖学特异性，但不是突触后细胞类型。

1. 选择合适的动物。在该协议中使用雄性野生型李斯特连帽大鼠（300-350g，约3个月大）。
2. 选择合适的病毒构建体。有几个因素需要考虑（见讨论）。目前的协议使用病毒表达光遗传学通道ChETA_TC 12，以转导兴奋性神经元（AAV9 - CaMKIIa - ChR2（E123T / T159C） - mCherry;滴度:3.3 x^{10 13}病毒基因组/ mL）。
3. 如前所述，使用脑图谱建立注射的坐标和体积³⁵。
4. 病毒制剂的立体定向注射
   注意:应遵循有关动物使用和护理的所有相关国家和机构指南。如前所述，立体定向注射病毒载体¹³ 进行以下修改。
   1. 在麻醉和制备动物期间将病毒制剂保持在冰上。
   2. 在含有4%异氟醚的麻醉诱导室中诱导麻醉。监测由较慢的常规呼吸频率（1 Hz）和没有踏板和角膜反射指示的麻醉水平（分别通过捏脚趾和轻轻触摸眼角进行测试;不应检测到任何反应）。
   3. 在侵入性手术前至少 30 分钟给予术前镇痛药，如美洛昔康。
   4. 当动物完全麻醉后，使用剪刀去除头皮上的皮毛。将异氟醚流切换到立体定位框架的鼻锥，并将大鼠安装在框架中。将润滑眼部凝胶涂抹在眼睛上，以防止在手术过程中干燥。
   5. 手术应在无菌条件下进行。在整个过程中使用无菌手套和器械。在用4%w / v氯己定溶液消毒头皮之前，涂抹利多卡因软膏（5% w / w），然后用无菌窗帘覆盖身体。使用手术刀在头皮上做一个长约 15 毫米的纵向切口，以露出前膛。
   6. 将汉密尔顿注射器装入微注射泵中，该注射泵连接到安装在立体定位框架上的可移动臂。
   7. 将 5 μL 等分试样的病毒放入 0.2 mL 管中并旋转几秒钟，直到所有体积都在管底部。将 2 μL 病毒制剂移液到管盖中。
   8. 首先用手术显微镜观察针尖，用病毒制剂填充注射器，然后手动将病毒推注在针尖，并使用泵控制撤回注射器柱塞。
   9. 将泵进样体积设置为 300 nL，将流速设置为 100 nL/min。运行泵并通过观察针尖处的病毒液滴来确认正常流动。在棉签上吸收病毒，并用70%乙醇轻轻清洁针头。
   10. 使用立体定位框架上的调节螺钉将针尖导航到前胛（颅骨上冠状缝合线和矢状面缝合线相交的点），并注意在框架上的三个游标尺度上观察到的立体定位测量值。相对于大鼠mPFC前后部的坐标为前后+ 3.1毫米，中外侧±0.7毫米，背腹 - 4.5毫米;从前膛坐标添加/减去（如所示）这些距离，然后将针导航到前后和中外侧坐标，并将针轻轻降低到颅骨表面。
       注意:上面给出的mPFC坐标适用于300-350g的雄性李斯特罩大鼠;大鼠品系、大小的变化可能需要改变这些坐标（见 讨论）。
   11. 将针从颅骨表面抬起，并用细尖永久性记号笔标记该点。此时使用安装在立体定位臂上的微型钻头打一个毛刺孔。
   12. 将针头以预定的背腹坐标插入大脑并输注预定体积（对于mPFC:300nL）。将针头原位放置10分钟，以使推注扩散。取出针头后，运行泵以确保针头没有堵塞。
       注意:缓慢插入和取出针头（~3毫米/分钟），以尽量减少对脑组织的损害和病毒回流到针道。
   13. 皮下注射 2.5 mL 温热的氯化钠 （0.9% w/v） 和葡萄糖 （5% w/v） 溶液以维持水合作用。
   14. 重复步骤 1.4.12。对于第二个半球。
   15. 缝合头皮切口，并在手术完成后，给予 2.5 mL 氯化钠和葡萄糖溶液以及适当的、机构推荐的止痛药用于疼痛管理，例如丁丙诺啡或美洛昔康。不要在动物失去知觉时无人看管。将大鼠放在加热的恢复盒中，直到它完全恢复意识。只有在完全康复后才能与其他动物一起返回笼子。
   16. 遵循病毒转染啮齿动物术后护理和住房程序的机构指南。等待至少2周，让视蛋白转基因充分表达，然后再开始实验。
       注意:转导所需的时间取决于突触前和突触后区域之间的连接距离和强度。对于mPFC到LEC，需要4-6周。

2.急性脑切片的制备

注意:在这里，我们描述了一种制备脑切片的简单方法，该方法在我们手中足以从成年小鼠和大鼠中获得高质量的皮质，海马和丘脑切片。

1. 准备解剖溶液。
   1. 用 ~200 mL 冰冷的蔗糖切割溶液（189 mM 蔗糖、26 mM NaHCO 3、10 mM D-葡萄糖、5 mM MgSO 4、₃ mM KCl、1.25 mM NaH 2 PO₄ 和 0.2 mM CaCl 2 在超纯水 （UPW） 中填充 250 mL 烧杯，在 25 °C 下电阻率为 18.2 MΩ cm）或足够的体积以填充振动切片机组织室。用碳原（95% O 2，5% CO₂）泡泡并保持在冰上。
   2. 在室温下用人造脑脊液（aCSF;124 mM NaCl、26 mM NaHCO 3、10 mM D-葡萄糖、₃ mM KCl、2 mM CaCl 2、1.25 mM NaH₂PO 4 和 1 mM MgSO₄）填充切片收集室，用碳化物鼓泡。切片收集室¹⁴由粘在尼龙网片上的微量离心管架定制制成，并放入浸没在aCSF中的烧杯中（图2A）。
   3. 在磷酸盐缓冲液（PB;75.4 mM Na 2 HPO 4.7H 2 O和24.6 mM NaH₂PO ₄）中填充50 mL管。H₂O）。
      注意:PFA有毒。在通风橱中使用。
2. 解剖大脑。
   1. 使用5%异氟醚在诱导室中麻醉大鼠，直到呼吸缓慢而规律（~1Hz）。确保有足够的麻醉测试水平，以消除踏板和角膜反射。
   2. 使用断头台将动物斩首。
   3. 如前所述快速解剖整个大脑¹⁵并转移到蔗糖切割溶液中。在斩首后 90 秒内完成该步骤，以获得良好的切片质量和成功的全细胞记录。
   4. 使用金属茶匙，拿起大脑，丢弃多余的切割溶液，然后将其放在台面上的一张滤纸上。
   5. 使用手术刀或剃须刀片，快速切除小脑，并在冠状平面中沿其长度约一半切开大脑;后半部分是LEC组织块。除了要切片的区域外，请务必包括一些多余的组织以进行下一步。将该组织块和大脑的其余部分返回到蔗糖切割溶液中。
   6. 将一滴氰基丙烯酸酯胶水滴在振动切片机组织载物台上。将其铺成薄层，其面积略大于上一步中创建的组织块。
   7. 用茶匙拿起LEC组织块，丢弃多余的溶液，然后转移到胶贴上，使前冠状切口粘附。
   8. 将载物台安装到振动切片机组织室中，并快速倒入足量的蔗糖切割溶液以浸没组织;用碳水化合物使该溶液起泡。将 LEC 组织块定向，腹面朝向刀片。虽然室内环境照明不足以激活视蛋白，但请避免使用振动切片机上可能存在的其他光源。
   9. 使用高叶片振荡速度 （100 Hz） 和缓慢的叶片前进速度 （0.06 mm/s） 从腹侧到背侧切割 350 μm 厚的切片。通常，每个半球可以获得七个LEC切片。
   10. 将切片转移到切片收集室。切片收集完成后，将收集室转移到34°C水浴中1小时，然后返回室温。用碳原连续起泡。切片将足够健康，可以记录至少 6 小时。
   11. 将大脑的其余部分置于PFA中48小时，以进行注射部位的事后检查（见第4节）。

3. 电生理学和光遗传学刺激

1. 鉴定靶细胞。
   1. 将切片放入浸没的记录室中，在34°C下通过蠕动泵以2mL / min的速率注入aCSF。使用切片锚点固定切片。
   2. 在使用倾斜红外照明的宽场显微镜的低放大倍率（4x）物镜下，导航到LEC层5。测量从pial表面到所需层的距离。
      注意:倾斜红外照明是通过将近红外LED放置在记录室盖玻片下方约3 mm处，与盖玻片平面成~55°角来实现的（图2B）。微分干涉对比是切片电生理学的另一种常用成像技术。
   3. 更换为高倍率水浸物镜（40x）并识别锥体神经元。用胶带标记计算机显示器上单元的位置。
      注意:锥体神经元具有大致的三角形形态，突出的顶端树突向切片的pial表面突出（图3A）。细胞健康可以通过没有浓缩的可见细胞核和检查应该看起来光滑的质膜来评估。使用宽场荧光显微镜时，不太可能看到视蛋白-荧光团融合蛋白对轴突的清晰荧光标记。为了可视化轴突投影，使用针对视蛋白荧光团的一抗进行事后免疫组织化学，并使用与相同或相似波长的荧光团偶联的二抗扩增。
2. 形成全细胞膜片钳。
   1. 使用移液器拉拔器制造硼硅酸盐玻璃微量移液器，并填充过滤的细胞内记录溶液（120 mM k-葡萄糖酸盐、40 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM NaCl、2 mM MgATP、1 mM MgCl、0.3 mM NaGTP、0.2 mM EGTA 和 0.25% 生物细胞素，在 UPW、pH 7.25、285-300 mOsm 中制造）。将填充的微量移液器放在膜片钳放大器头台上的电极支架中，确保电极丝与细胞内溶液接触。
   2. 通过用管子向电极支架侧端口连接的吹嘴（例如移除柱塞的 1 mL 注射器）用力吹气，通过口施加正压，并通过关闭在线三通阀来保持压力。抬起显微镜物镜，使弯月面形成，并将电极插入弯月面，直到可以在显微镜上看到。
   3. 在WinLTP¹⁶（或其他采集软件/示波器）中打开"密封测试"窗口，在放大器处于电压钳模式的情况下，施加5 mV方脉冲以确定移液器电阻是否为3-6 MΩ。
   4. 用移液器吸头接近并触摸识别的细胞;这应该会导致细胞膜压痕（图3A;右图）和移液器电阻的小幅增加（0.1 MΩ）。
   5. 释放正压，通过在吹嘴处施加适度的吸力来施加负压;这应该会导致移液器阻力（>1000 MΩ）大幅增加。压力现在可以保持中立。以逐渐增加的斜坡施加负压，直到细胞膜破裂导致全电池电容瞬变。
3. 记录光遗传诱发的突触事件。
   1. 进入电流钳配置。
      注意:在大多数情况下，长距离突触传递是谷氨酸能的，因此在接近氯化物逆转电位的膜电位下记录将最好地隔离AMPA受体（AMPAR）介导的传输，并最大限度地减少任何前馈抑制（FFI）的测量诱发。氯化物逆转取决于细胞内记录溶液和aCSF的组成，可以使用Goldman-Hodgkin-Katz方程计算;对于上述解决方案，为-61.3 mV。第 5 层 LEC 锥体神经元的平均静息膜电位为 -62 mV，并在必要时通过注入恒流维持在此电位。或者，可以将电池电压钳位到所需的电位。为了记录长程抑制预测¹⁶ 或记录FFI，在阳离子反转电位处进行电压钳位以隔离GABA能氯电导。当膜电位高于动作电位阈值时，使用含有电压门控钠通道阻滞剂的铯基细胞内溶液来改善电压钳位并防止动作电位的启动（130 mM CsMeSO 4、10 mM HEPES、8 mM NaCl、5 mM QX 314 氯化物、₄ mM MgATP、0.5 mM EGTA、0.3 mM NaGTP、0.25% 超纯水生物细胞素， pH 7.25，285-300 mOsm）。
   2. 使用数据采集软件，将晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 信号发送到 LED 驱动器，以激活已安装的 470 nm LED。安装的LED使用滤光片立方体和适当的光学元件（图2B）引导到显微镜光路中，通过40倍物镜 将 光脉冲施加到切片上，以唤起光遗传学兴奋性突触后电位（oEPSP）。
      注意:光脉冲可以在周围/树突上施加，这将导致轴突和突触前布顿中视蛋白的激活，或者研究者可以将物镜移动到轴突上，远离记录的细胞以避免过度的布顿刺激（见 讨论）。最大 oEPSP 振幅取决于突触投射的强度、病毒注射的功效和使用的视蛋白。oEPSP可以通过改变光强度和/或持续时间滴定至所需振幅¹⁸;改变光脉冲的持续时间（最大LED功率输出时的典型持续时间在0.2-5 ms之间，导致4.4 mW/mm光密度¹⁹）比改变LED的功率输出提供更一致的oEPSP幅度。
   3. 通过传递具有不同刺激间隔的多个光脉冲序列来研究突触前释放特性（电压变化）（图 3E）;在解释光遗传诱发传播时应小心（ 讨论）。
   4. 通过反复唤起oEPSPS¹⁹ 或配体的应用来研究长期可塑性。监测oEPSP振幅5-10分钟以确保在诱导塑性之前稳定性，然后监测直到达到稳定的振幅（通常为30-40分钟）。
      注意:大多数当前的视蛋白不能可靠地在高频下唤起多个动作电位，例如，以100 Hz传递100个刺激，通常用于诱导LTP。
   5. 为了确认oEPSP是单突触的，通过将物镜定位在树突状乔木上并在0.5μM河豚毒素和100μM氨基吡啶存在下刺激来对转导途径进行过度bouton激活。如果反应是动作电位依赖性的，则河豚毒素的应用将消除传播，如果oEPSP单突触产生，则随后加入氨基吡啶将部分恢复传输^19，20。
   6. 为了让生物细胞素充满神经元，在进入全细胞配置后等待至少15分钟。在电压钳位中，监视膜电容和输入电阻。
   7. 沿着接近角缓慢地将移液器从细胞体上抽出，观察电容瞬变和膜电流的缓慢消失，表明细胞膜重新密封并在移液器尖端形成由外的贴片。记下切片的方向和切片中单元格的位置。将切片放入24孔板中的PFA中，并在4°C下孵育过夜，然后转移到0.1M PB中。
      注意:切片最多可以存储一周。如果需要更长的储存时间，请定期更换PB或使用含叠氮化钠（叠氮化钠的0.02%-0.2%）。

4. 组织学

1. 切片注射部位
   1. 固定后，在PB中的30%蔗糖（w / v）中冷冻保护组织，直到其下沉（最初将漂浮在蔗糖溶液中），通常在室温下过夜或在4°C下24-48小时。
   2. 使用最佳切割温度 （OCT） 培养基，将一块组织连接到低温恒温器样品盘上。按照步骤4.1.3至4.1.4冷冻组织块。
   3. 将异戊烷放入适当的容器中。仅浸没标本盘，确保组织高于异戊烷的水平。将异戊烷容器放入液氮（或干冰）中，让组织冻结。
   4. 一旦完全冷冻（整个组织块变得苍白和坚硬），将组织块留在-20°C的低温恒温室中30分钟，以使块的温度平衡。
   5. 在-20°C的低温恒温器中切割40μm厚的切片。 使用细画笔引导刀片上的部分。通过将载玻片接触切片，将冷冻切片粘附在室温，聚L-赖氨酸包被的玻璃显微镜载玻片上。
   6. 向每张载玻片中加入约 150 μL 封片剂，并用盖玻片盖住;轻轻按压盖玻片以去除任何气泡。盖上载玻片以防止光漂白并在室温下风干至少12小时（或过夜）。使用荧光显微镜检查病毒注射部位的位置。
2. 生物细胞素染色方案
   注意:此协议可应用于厚截面;切片不需要重新切片。
   1. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na 2 HPO₄和1.8 mM KH₂PO₄）洗涤脑切片六次，每次洗涤10分钟。每一步后使用移液器清空孔。
   2. 将切片在PBS中的3%H₂O₂ （w / v）中孵育30分钟以阻断任何内源性过氧化物酶活性。生成氧气气泡。
   3. 用PBS清洗脑切片六次，每次洗涤10分钟，或直到没有进一步的氧气气泡可见。将脑切片在含有0.1%（v / v）Triton X-100的PBS中的1%（v / v）亲和素化HRP复合物（ABC）溶液中孵育3小时。
   4. 用PBS清洗脑切片六次，每次洗涤10分钟。
   5. 将每个切片在3，3′-二氨基联苯胺（DAB）溶液中孵育几分钟，直到神经元结构的生物细胞素染色变得可见（大约需要5-10分钟）。
      注意:轻拍是有毒的。在通风橱中使用。
      注意:DAB孵育时间可能无法预测，随着颜色的发展密切监测组织。
   6. 通过将切片转移到冷（4°C）PBS中来停止反应。用PBS清洗脑切片六次，每次洗涤10分钟。使用刷子将脑切片安装到聚-L-赖氨酸涂层玻璃显微镜载玻片上。
   7. 用干净的纸巾去除所有多余的PBS。用约 200 μL 封片剂覆盖每个切片;盖上盖玻片，轻轻按压盖玻片以推出气泡。在室温下风干至少12小时（或过夜）。使用光学显微镜检查细胞的位置和形态细节。
      注意:生物细胞素也可以使用荧光团偶联的链霉亲和素可视化;然而，成像可能需要切除或使用共聚焦显微镜²¹。

结果

在该协议中，我们描述了如何使用光遗传学构建体的病毒递送来研究长距离突触生理学和可塑性。该协议可以很容易地适应研究大脑中几乎所有的远程连接。例如，我们描述了将编码视蛋白的AAV注射到大鼠mPFC中，从LEC制备急性切片，从第5层LEC锥体神经元中膜片钳记录，以及LEC中mPFC末端的光诱发激活（图1）。

找到并修补健康的锥体细胞（例如，

讨论

这里介绍的方案描述了一种探索高度特异性的远程突触投影的方法，该方法结合了立体定位手术来提供编码光遗传学构建体的AAV，以及急性脑切片中的电生理学（图1）。这些技术共同提供了工具，可以在以前使用传统的非特异性电刺激无法获得的远程和解剖弥漫通路中高精度地表征脑回路的生理学和可塑性。与细胞特异性分子标记相结合，可以表征从一个大脑区域到另一个...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tube	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µL pipette	Gilson	FD10001
24 well plate	SARSTEDT	83.3922
3 way luer valve	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate	Vector Laboratories	SK-4105
40x objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Hello Bio	HB1073
4x objective	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens	Edmund Optics	49363	Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Borosillicate glass capillary	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Fine science tools	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Chlorhexidine surgical scrub	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	22445	AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens	ThorLabs	ACL2520-A
Coverslips	Fisher Scientific Ltd	10011913
Cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Cyanoacrylate glue	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Data acquisition device	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass	Edmund Optics	69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass	Edmund Optics	69901
Dichroic mirror cube	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Electrode holder with side port	HEKA	895150
Emission filter	Chroma	59022m
Excitation filter	Chroma	ET570/20x
Eye gel	Dechra	Lubrithal
Fine paint brush	Scientific Laboratory Supplies	BRU2052
Guillotine	World Precision Instruments	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Isoflurane	Henry Schein	988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematic fluorescence filter cube	ThorLabs	DFM1T1
LED driver	ThorLabs	LEDD1B
Lidocaine ointment	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro drill	Harvard Apparatus	75-1887
Microelectrode puller	Sutter instruments	P-87
Microinjection syringe	Hamilton	7634-01/00
Microinjection syringe needle	Hamilton	7803-05	Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	UMP3T-1
Mounted blue LED	ThorLabs	M470L5
Mounted green LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM	SFH4550	Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium	VWR International	RAYLLAMB/OCT	Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	700A
Peristaltic pump	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Scalpel blade	Swann Morton	#24
Slice anchor	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame	Kopf	Model 902
Stereotaxic holder for micro drill	Harvard Apparatus	75-1874
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Surgical Microscope	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
Syringe filter for intracellular recording solution	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoxin citrate	Hello Bio	HB1035
Transfer pipettes	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Upright fluorescence microscope	Leica	DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit	Vector Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	Version 2.32	Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?