АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий вирусную трансдукцию дискретных областей мозга с оптогенетическими конструкциями, позволяющими синапсеспецифическую электрофизиологическую характеристику в острых срезах мозга грызунов.

Аннотация

Изучение физиологических свойств специфических синапсов в мозге и того, как они претерпевают пластические изменения, является ключевой задачей в современной нейробиологии. Традиционные электрофизиологические методы in vitro используют электрическую стимуляцию, чтобы вызвать синаптическую передачу. Основным недостатком данного метода является его неспецифический характер; все аксоны в области стимулирующего электрода будут активированы, что затруднит приписывание эффекта конкретному афферентному соединению. Эту проблему можно преодолеть, заменив электрическую стимуляцию оптогенетической стимуляцией. Описан метод сочетания оптогенетики с записями патч-зажимов in vitro . Это мощный инструмент для изучения как базальной синаптической передачи, так и синаптической пластичности точных анатомически определенных синаптических связей и применим практически к любому пути в головном мозге. Здесь мы описываем подготовку и обработку вирусного вектора, кодирующего канально-мозговой белок, для хирургической инъекции в пресинаптическую область, представляющую интерес (медиальную префронтальную кору) в мозге грызунов и создание острых срезов нисходящих целевых областей (латеральная энторинальная кора). Также представлена подробная процедура комбинирования записей патч-зажима с синаптической активацией путем световой стимуляции для изучения краткосрочной и долгосрочной синаптической пластичности. Мы обсуждаем примеры экспериментов, которые достигают специфичности пути и клеток путем объединения оптогенетики и cre-зависимой маркировки клеток. Наконец, гистологическое подтверждение пресинаптической области, представляющей интерес, описано вместе с маркировкой биоцитина постсинаптической клетки, чтобы обеспечить дальнейшую идентификацию точного местоположения и типа клетки.

Введение

Понимание физиологии синапсов и того, как они претерпевают пластические изменения, имеет основополагающее значение для понимания того, как мозговые сети функционируют в здоровом мозге1 и как они неисправны при расстройствах мозга. Использование острых срезов мозга ex vivo позволяет регистрировать электрическую активность синапсов от одиночных нейронов с высоким отношением сигнал/шум с использованием записей цельноклеточных патч-зажимов. Контроль мембранного потенциала и простые фармакологические манипуляции позволяют выделить подтипы рецепторов. Эти записи могут быть сделаны с изысканной специфичностью для идентификации постсинаптического нейрона, включая ламинарное и субрегиональное положение2, клеточную морфологию3, наличие молекулярных маркеров4, его афферентные проекции5 или даже если он был недавно активным6.

Достижение специфичности пресинаптических входов, однако, несколько сложнее. Традиционный метод использует стимулирующие электроды для возбуждения аксонов, которые работают в определенной пластине. Примером этого является гиппокамп, где локальная стимуляция в радиатном слое активирует синапсы, которые проецируются из CA3 в подполе CA17. В этом случае достигается пресинаптическая специфичность, поскольку вход CA3 представляет собой единственный возбуждающий вход, расположенный внутри радиатного слоя, который проецируется на пирамидальные ячейки CA18. Однако эта высокая степень входной специфичности, достижимая при обычной электрической пресинаптической активации аксонов CA3-CA1, является исключением, которое отражено в интенсивном исследовании, которому подвергался этот синапс. В других областях мозга аксоны из нескольких афферентных путей сосуществуют в одной и той же пластинке, например, в слое 1 неокортекса9, что делает невозможной пресинаптическую стимуляцию с помощью обычных стимулирующих электродов. Это проблематично, поскольку различные синаптические входы могут иметь расходящиеся физиологические свойства; поэтому их стимуляция может привести к неправильной характеристике синаптической физиологии.

Появление оптогенетики, генетического кодирования фоточувствительных мембранных белков (опсинов), таких как каналродопсин-2 (ChR2), позволило значительно расширить возможности для изучения изолированных синаптических проекций между областями мозга10,11. Здесь мы описываем обобщающее и недорогое решение для изучения долгосрочной синаптической физиологии и пластичности. Оптогенетические конструкции доставляются очень специфическим образом с использованием вирусных векторов, что позволяет чрезвычайно точно контролировать пресинаптическую область, представляющую интерес. Эфферентные проекции будут выражать светоактивированный канал, позволяющий активировать эти волокна в целевой области. Таким образом, могут быть изучены дальние, анатомически диффузные пути, которые не могут быть независимо активированы традиционной, неспецифической, электрической стимуляцией.

В качестве примера мы описываем трансдукцию медиальной префронтальной коры (mPFC) аденоассоциированными вирусами (AAV), кодирующими возбуждающие катион-канальные опсины. Затем мы описываем подготовку острых срезов из латеральной энторинальной коры (LEC), записей зажимов из пирамидных нейронов LEC слоя 5 и световой активации глутаматергических проекций mPFC-LEC (рисунок 1). Мы также описываем гистологическую оценку места инъекции для подтверждения местоположения пресинаптической области, представляющей интерес, и идентификации морфологии постсинаптических клеток.

протокол

Все процедуры для животных проводились в соответствии с Законом Соединенного Королевства о научных процедурах в отношении животных (1986 год) и связанными с ним руководящими принципами, а также местными институциональными руководящими принципами.

1. Стереотаксическая вирусная инъекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол требует анатомической, но не постсинаптической специфичности типа клеток.

  1. Выберите подходящее животное. В этом протоколе использовались самцы крыс с капюшоном Lister дикого типа (300-350 г, примерно 3 месяца).
  2. Выберите подходящую вирусную конструкцию. Есть несколько факторов, которые следует учитывать (см. Обсуждение). Текущий протокол использует вирус для экспрессии оптогенетического канала ChETATC12, для передачи возбуждающих нейронов (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (E123T / T159C) - mCherry; титр: 3,3 х 1013 вирусных геномов / мл).
  3. Установите координаты и объем инъекции с помощью атласа мозга, какописано ранее 35.
  4. Стереотаксическая инъекция вирусного препарата
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать все соответствующие национальные и институциональные руководящие принципы использования животных и ухода за ними. Вирусные векторы стереотаксически вводятся, как описано ранее13 со следующими изменениями.
    1. Держите вирусный препарат на льду во время обезболивания и подготовки животного.
    2. Индуцировать анестезию в анестетической индукционной камере с 4% изофлураном. Контролировать уровень анестезии можно по более медленному регулярному дыханию (1 Гц) и отсутствию педальных и роговичных рефлексов (тест путем защемления пальцев ног и легкого прикосновения к уголку глаза соответственно; реакция не должна быть обнаружена).
    3. Вводите предоперационный анальгетик, такой как мелоксикам, по крайней мере, за 30 минут до инвазивной процедуры.
    4. Когда животное будет полностью обезболено, используйте кусачки, чтобы удалить шерсть с кожи головы. Переключите поток изофлурана на носовой конус стереотаксической рамки и установите крысу в кадр. Нанесите смазывающий гель для глаз на глаза, чтобы предотвратить сухость во время процедуры.
    5. Операция должна проводиться в асептических условиях. Используйте стерильные перчатки и инструменты на протяжении всей процедуры. Применяют лидокаиновую мазь (5% мас./мас.) перед дезинфекцией кожи головы 4% мас./об. раствором хлоргексидина, а затем накрывают тело стерильной драпировкой. Используя скальпель, сделайте продольный разрез длиной примерно 15 мм на коже головы, чтобы обнажить брегму.
    6. Загрузите шприц Гамильтона в микроинъекционный шприцевой насос, прикрепленный к подвижному рычагу, установленному на стереотаксической раме.
    7. Поместите 5 мкл аликвоты вируса в трубку объемом 0,2 мл и вращайте в течение нескольких секунд, пока весь объем не окажется в нижней части трубки. Пипетка 2 мкл вирусного препарата попадает в крышку пробирки.
    8. Заполните шприц вирусным препаратом, сначала рассмотрев кончик иглы хирургическим микроскопом, а затем вручную поместите болюс вируса на кончик иглы и выньте плунжер шприца с помощью органов управления насосом.
    9. Установите объем впрыска насоса на 300 нЛ и расход на 100 нл/мин. Запустите насос и подтвердите правильное течение, наблюдая за каплей вируса на кончике иглы. Впитать вирус на ватную палочку и аккуратно очистить иглу 70% этанолом.
    10. Используя винты регулятора на стереотаксической раме, перейдите кончиком иглы к брегме (точке на черепе, где встречаются корональный и сагиттальный швы) и обратите внимание на стереотаксические измерения, наблюдаемые на трех шкалах Вернье на раме. Координаты относительно брегмы крыс mPFC передне-задние + 3,1 мм, медиолатеральные ± 0,7 мм, дорсовентральные - 4,5 мм; сложите/вычтите (как указано) эти расстояния от координат брегмы, а затем переместите иглу к передне-задним и медиолатеральным координатам и осторожно опустите иглу на поверхность черепа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные выше координаты mPFC подходят для самцов крыс с капюшоном весом 300-350 г; изменения штамма крыс, размера могут потребовать изменения этих координат (см. Обсуждение).
    11. Поднимите иглу с поверхности черепа и отметьте эту точку перманентной маркерной ручкой с тонким наконечником. Сделайте отверстие для заусенцев в этой точке с помощью микросверла, установленного на стереотаксическом рычаге.
    12. Вводят иглу в мозг по заранее определенной дорсовентральной координате и вводят заранее определенный объем (для mPFC: 300 нЛ). Оставьте иглу на месте в течение 10 минут, чтобы обеспечить диффузию болюса. После извлечения иглы запустите насос, чтобы убедиться, что игла не заблокирована.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставляйте и извлекайте иглу медленно (~3 мм/мин), чтобы свести к минимуму повреждение мозговой ткани и обратный поток вируса в игольчатый тракт.
    13. Вводите 2,5 мл подкожного раствора хлорида натрия (0,9% мас./об.) и глюкозы (5% мас./об.) для поддержания гидратации.
    14. Повторите шаг 1.4.12. для второго полушария.
    15. Зашить разрез кожи головы и по завершении процедуры ввести 2,5 мл раствора хлорида натрия и глюкозы и соответствующий, рекомендованный в установленном законом, анальгетик для лечения боли, например, бупренорфин или мелоксикам. Не оставляйте животное без присмотра в бессознательном состоянии. Поместите крысу в нагретую спасательную коробку до тех пор, пока она полностью не придет в сознание. Возвращайтесь в домашнюю клетку только после полного выздоровления с другими животными.
    16. Следуйте институциональным руководящим принципам послеоперационного ухода и процедур содержания инфицированных вирусом грызунов. Подождите не менее 2 недель, пока трансген опсина адекватно экспрессируется, прежде чем начинать эксперимент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для трансдукции, зависит от расстояния и прочности связи между пре- и постсинаптическими областями. Для перехода от mPFC к LEC требуется 4-6 недель.

2. Подготовка острых срезов мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы описываем простой метод приготовления срезов мозга, которых в наших руках достаточно для получения высококачественных кортикальных, гиппокампальных и таламических срезов от взрослых мышей и крыс.

  1. Подготовьте растворы для рассечения.
    1. Наполните стакан объемом 250 мл ~200 мл ледяного раствора для резки сахарозы (189 мМ сахарозы, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 5 мМ MgSO4, 3 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4 и 0,2 мМ CaCl2 , изготовленных в сверхчистой воде (UPW) с удельным сопротивлением 18,2 МОм см при 25 °C) или достаточным объемом для заполнения камеры вибратомной ткани. Пузырьки с карбогеном (95% O2, 5% CO2) и держат на льду.
    2. Наполните камеру сбора срезов искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF; 124 мМ NaCl, 26 мМ NaHCO3, 10 мМ D-глюкозы, 3 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1,25 мМ2PO4 и 1 мМ MgSO4 , изготовленной в UPW) при комнатной температуре, пузырьков карбогеном. Камера14 для сбора срезов изготовлена на заказ из стойки для микроцентрифуги, наклеенной на лист нейлоновой сетки и помещенной в стакан, в который она погружена в aCSF (фиг.2A).
    3. Заполните трубку объемом 50 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буфере (PB; 75,4 мМ Na2HPO 4,7H 2O и 24,6 мМ2PO4. Н2О).
      ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Используйте в вытяжном шкафу.
  2. Рассечение головного мозга.
    1. Обезболивайте крысу в индукционной камере, используя 5% изофлурана, пока дыхание не станет медленным и регулярным (~1 Гц). Для обеспечения достаточного уровня анестезии проверяют на отсутствие педальных и роговичных рефлексов.
    2. Обезглавить животное с помощью гильотины.
    3. Быстро рассекают весь мозг, как описано ранее15 и переносят в раствор сахарозы. Выполните шаг в течение 90 с после обезглавливания для хорошего качества срезов и успешной записи целых клеток.
    4. Используя металлическую чайную ложку, поднимите мозг, выбросьте лишний режущий раствор и поместите его на лист фильтровальной бумаги на столешнице.
    5. С помощью скальпеля или лезвия бритвы быстро удалить мозжечок и разрезать головной мозг в корональной плоскости примерно на полпути по его длине; задняя половина представляет собой тканевый блок LEC. Обязательно включите некоторую избыточную ткань в дополнение к области, которая будет разрезана для следующих шагов. Верните как этот тканевой блок, так и остальную часть мозга в раствор для резки сахарозы.
    6. Поместите каплю цианоакрилатного клея на стадию ткани вибратома. Распределите его тонким слоем с площадью, немного большей, чем тканевый блок, созданный на предыдущем этапе.
    7. Возьмите блок ткани LEC с помощью чайной ложки, выбросьте лишний раствор и переложите на клеевой пластырь так, чтобы передний корональный срез прилип.
    8. Установите ступень в тканевую камеру вибратома и быстро налейте достаточное количество режущего раствора сахарозы для погружения ткани; пузырьковый этот раствор с карбогеном. Направьте тканевый блок LEC вентральной поверхностью к лезвию. В то время как окружающее освещение комнаты недостаточно для активации опсина, избегайте использования дополнительных источников света, которые могут присутствовать на вибратоме.
    9. Нарезайте срезы толщиной 350 мкм от вентрального до дорсального с использованием высокой скорости колебаний лезвия (100 Гц) и медленной скорости продвижения лезвия (0,06 мм/с). Как правило, на полушарие можно получить семь срезов LEC.
    10. Перенесите ломтики в камеру сбора ломтиков. По завершении сбора срезов переведите камеру сбора на водяную баню 34 °C в течение 1 ч, прежде чем вернуться к комнатной температуре. Пузырь с карбогеном непрерывно. Ломтики будут достаточно здоровыми для записи в течение не менее 6 ч.
    11. Поместите оставшуюся часть мозга в PFA в течение 48 ч для пост-специального обследования места инъекции (см. раздел 4).

3. Электрофизиология и оптогенетическая стимуляция

  1. Идентификация клетки-мишени.
    1. Поместите срез в погружную регистрирующую камеру при 34 °C, перфузионную с aCSF со скоростью 2 мл/мин перистальтическим насосом. Обездвижите фрагмент с помощью привязки фрагмента.
    2. Под объективом с низким увеличением (4x) широкоугольного микроскопа с использованием наклонного инфракрасного освещения перейдите к уровню LEC 5. Измерьте расстояние от поверхности пиала до требуемого слоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Косая инфракрасная подсветка была достигнута путем размещения вблизи инфракрасного светодиода примерно на 3 мм ниже крышки регистрирующей камеры под углом ~55° к плоскости крышки (рисунок 2B). Дифференциальный интерференционный контраст является альтернативным и широко используемым методом визуализации для электрофизиологии срезов.
    3. Перейдите на объектив погружения в воду с большим увеличением (40x) и определите пирамидальные нейроны. Отметьте положение ячейки на мониторе компьютера лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пирамидальные нейроны имеют примерно треугольную морфологию с выдающимися апикальными дендритами, выступающими к пиальной поверхности среза (рисунок 3A). Здоровье клеток можно оценить по отсутствию конденсированного, видимого ядра и осмотру плазматической мембраны, которая должна казаться гладкой. Маловероятно, что четкая флуоресцентная маркировка аксонов белком слияния опсин-флуорофора будет видна при использовании широкопольного флуоресцентного микроскопа. Для визуализации аксональных проекций выполняют иммуногистохимию пост-хок с использованием первичного антитела против флуорофора опсина и амплируют вторичным антителом, конъюгированным с флуорофором той же или аналогичной длины волны.
  2. Формирование цельноклеточного пластыря-зажима.
    1. Изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла с помощью съемника пипетки и заполните фильтрованным внутриклеточным регистрирующим раствором (120 мМ k-глюконата, 40 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 2 мМ NaCl, 2 мМ MgATP, 1 мМ MgCl, 0,3 мМ NaGTP, 0,2 мМ EGTA и 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, рН 7,25, 285-300 мОсм). Поместите заполненную микропипетку в держатель электрода на головную ступень усилителя с патч-зажимом, чтобы провод электрода контактировал с внутриклеточным раствором.
    2. Применяйте положительное давление ртом, сильно вдувая мундштук (например, шприц объемом 1 мл со снятым плунжером), соединенный трубкой со боковым портом держателя электрода, и поддерживайте давление, закрывая линейный трехсторонний клапан. Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск, пока его не увидят на микроскопе.
    3. Откройте окно Seal Test в WinLTP16 (или другом программном обеспечении/осциллографе) и с усилителем в режиме зажима напряжения примените квадратный импульс 5 мВ, чтобы определить, составляет ли сопротивление пипетки 3-6 МОм.
    4. Подойдите и прикоснитесь к идентифицированной ячейке кончиком пипетки; это должно привести к углублению в клеточной мембране (рисунок 3A; правая панель) и небольшому увеличению сопротивления пипетки (0,1 МОм).
    5. Освободите положительное давление и примените отрицательное давление, применяя умеренное всасывание на мундштуке; это должно привести к значительному увеличению сопротивления пипетки (>1000 МОм). Давление теперь можно оставить нейтральным. Применяйте отрицательное давление в постепенно увеличивающейся рампе до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости цельноклеточной клетки.
  3. Записывайте оптогенетически вызванные синаптические события.
    1. Введите конфигурацию тока-зажима.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев синаптическая передача на большие расстояния является глутаматергической, поэтому регистрация на мембранных потенциалах, близких к потенциалу разворота хлоридов, наилучшим образом изолирует передачу, опосредованную рецептором AMPA (AMPAR), и минимизирует измерение любого вызванного ингибирования прямой передачи (FFI). Разворот хлорида зависит от состава внутриклеточного регистрирующего раствора и aCSF и может быть рассчитан с использованием уравнения Голдмана-Ходжкина-Каца; для вышеуказанных решений это было -61,3 мВ. Пирамидальные нейроны LEC 5-го слоя имели средний мембранный потенциал покоя -62 мВ и, при необходимости, поддерживались на этом уровне путем впрыска постоянного тока. Альтернативно, ячейки могут быть зажаты напряжением до желаемого потенциала. Для регистрации ингибирующих проекций16 на большие расстояния или для регистрации FFI, зажим напряжения при потенциале разворота катионов для выделения проводимости ГАМКергического хлорида. При напряжении зажимных нейронов на мембранных потенциалах выше порога потенциала действия внутриклеточный раствор на основе цезия, содержащий блокаторы натриевых каналов с напряжением, для улучшения напряжения-зажима и предотвращения инициирования потенциалов действия (130 мМ CsMeSO4, 10 мМ HEPES, 8 мМ NaCl, 5 мМ QX 314 хлорида, 4 мМ MgATP, 0,5 мМ EGTA, 0,3 мМ NaGTP, 0,25% биоцитина, произведенного в UPW, pH 7,25, 285-300 мОсм).
    2. Используя программное обеспечение для сбора данных, отправляйте сигналы транзистор-транзисторной логики (TTL) на светодиодный драйвер для активации установленного светодиода 470 нм. Установленный светодиод направляется в световой путь микроскопа с помощью фильтрующих кубов и соответствующей оптики (рисунок 2B) для подачи световых импульсов на срез через 40-кратный объектив для вызова оптогенетических возбуждающих постсинаптических потенциалов (oEPSP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Световые импульсы могут быть применены перисоматически / над дендритами, что приведет к активации опсинов в аксонах и пресинаптическом бутоне, или исследователь может переместить цель в аксоны подальше от зарегистрированной клетки, чтобы избежать чрезмерной стимуляции бутона (см. Обсуждение). Максимальная амплитуда oEPSP зависит от силы синаптической проекции, эффективности вирусных инъекций и используемого опсина. oEPSP могут титроваться до желаемой амплитуды путем изменения интенсивности света и/или длительности18; изменение длительности световых импульсов (типичная продолжительность между 0,2-5 мс при максимальной выходной мощности светодиода, что приводит к плотности света 4,4 мВт / мм19) дает более последовательные амплитуды oEPSP, чем изменение выходной мощности светодиода.
    3. Исследовать пресинаптические свойства высвобождения (изменение напряжения) путем подачи потоков множественных световых импульсов с различными межстимульными интервалами (рисунок 3E); следует соблюдать осторожность при интерпретации оптогенетически вызванной передачи (см. Обсуждение).
    4. Исследуйте долгосрочную пластичность либо путем повторного вызова oEPSP19 , либо путем применения лигандов. Контролируйте амплитуду oEPSP в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить стабильность до индукции пластичности, а затем контролируйте до достижения стабильной амплитуды (обычно 30-40 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство современных опсинов не способны надежно вызывать множественные потенциалы действия на высоких частотах, например, 100 стимулов, подаваемых при 100 Гц, как это обычно используется для индуцирования LTP.
    5. Чтобы подтвердить, что oEPSP являются моносинаптическими, выполните чрезмерную активацию бутона трансдуцированного пути, расположив объектив над дендритной беседкой и стимулируя в присутствии 0,5 мкМ тетродотоксина и 100 мкМ аминопиридина. Применение тетродотоксина отменит передачу, если реакции зависят от потенциала действия, а последующее включение аминопиридина частично восстановит передачу, если oEPSP генерируются моносинаптически19,20.
    6. Чтобы биоцитин заполнил нейрон, подождите не менее 15 минут после входа в полноклеточную конфигурацию. В напряжении-зажиме, контролируйте емкость мембраны и входное сопротивление.
    7. Медленно отведите пипетку вдоль угла подхода подальше от сомы клетки, наблюдая медленное исчезновение емкостных переходных процессов и мембранного тока, что указывает на повторное уплотнение клеточной мембраны и образование внешнего пятна на кончике пипетки. Обратите внимание на ориентацию фрагмента и расположение ячеек внутри фрагмента. Поместите ломтик в PFA в 24-луночную пластину и инкубируйте в течение ночи при 4 °C, а затем переведите в 0,1 М ПБ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты могут храниться до недели. Если требуется более длительное хранение, регулярно меняйте ПБ или используйте ПБ, содержащий азид натрия (0,02%-0,2% азида натрия).

4. Гистология

  1. Место нарезки инъекции
    1. После фиксации криозащитите ткань в 30% сахарозе (мас./об.) в ПБ до тех пор, пока она не утонет (первоначально она будет плавать в растворе сахарозы), обычно на ночь при комнатной температуре или через 24-48 ч при 4 °C.
    2. Используя среду с оптимальной температурой резания (OCT), прикрепите блок ткани к диску образца криостата. Заморозьте тканевый блок в соответствии с шагами 4.1.3-4.1.4.
    3. Поместите изопентан в соответствующий контейнер. Погрузите только диск образца, гарантируя, что ткань находится выше уровня изопентана. Опустите контейнер изопентана в жидкий азот (или сухой лед) и дайте ткани замерзнуть.
    4. После полной заморозки (весь тканевый блок становится бледным и твердым), оставьте тканевый блок в криостатной камере при -20 ° C в течение 30 минут, чтобы температура блока уравновешивалась.
    5. Вырежьте в криостате участки толщиной 40 мкм при -20 °C. Используйте тонкую кисть, чтобы направить участки от лезвия. Приклейте замороженные срезы к комнатной температуре, с поли-L-лизином покрытием, стеклянный микроскоп скользит, касаясь слайда к секциям.
    6. Добавьте около 150 мкл монтажного носителя на каждый слайд и крышку с крышкой; удалите пузырьки воздуха, осторожно надавливая на крышку. Накройте слайды для защиты от фотоотбеливания и высушите воздухом при комнатной температуре не менее 12 ч (или ночью). Используя флуоресцентный микроскоп, исследуйте местоположение места вирусной инъекции.
  2. Протокол окрашивания биоцитином
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к толстым сечениям; срезы не нуждаются в повторном секционировании.
    1. Промывайте срезы мозга фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4) шесть раз в течение 10 мин за одну промывку. Используйте передаточную пипетку для опорожнения скважин после каждого шага.
    2. Инкубировать ломтики в 3% H2O2 (мас./об.) в PBS в течение 30 мин, чтобы блокировать любую эндогенную активность пероксидазы. При этом образуются пузырьки кислорода.
    3. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку или до тех пор, пока не будут видны новые пузырьки кислорода. Инкубируют срезы мозга в 1% (v/v) авидин-биотинилированном растворе HRP комплекса (ABC) в PBS, содержащем 0,1% (v/v) Triton X-100 при комнатной температуре в течение 3 ч.
    4. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку.
    5. Инкубируйте каждый ломтик в растворе 3,3'-диаминобензидина (DAB) в течение нескольких минут, пока не станет видно окрашивание биоцитином нейронных структур (занимает около 5-10 мин).
      ВНИМАНИЕ: DAB токсичен. Используйте в вытяжном шкафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации DAB может быть непредсказуемым, внимательно следите за тканями по мере развития цвета.
    6. Остановите реакцию, перенеся срезы в холодные (4 °C) PBS. Промывайте кусочки мозга PBS шесть раз в течение 10 минут за одну промывку. Используйте щетку для крепления срезов мозга на стеклянные стекла микроскопа с поли-L-лизином.
    7. Удалите все излишки PBS чистой тканью. Накройте каждый срез примерно 200 мкл монтажной среды; накройте крышкой и осторожно надавите на крышку, чтобы вытолкнуть пузырьки воздуха. Высушивают на воздухе при комнатной температуре не менее 12 ч (или на ночь). Используя световой микроскоп, изучите местоположение и морфологические детали клетки (клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биоцитин может быть альтернативно визуализирован с использованием флуорофор-конъюгированного стрептавидина; однако для визуализации может потребоваться резекция или использование конфокального микроскопа21.

Результаты

В этом протоколе мы описываем, как изучать долгосрочную синаптическую физиологию и пластичность с использованием вирусной доставки оптогенетических конструкций. Протокол может быть очень легко адаптирован для изучения практически любой дальней связи в мозге. В качестве примера мы о?...

Обсуждение

Протокол, представленный здесь, описывает метод исследования высокоспецифичных синаптических проекций дальнего действия с использованием комбинации стереотаксической хирургии для доставки AAV, кодирующих оптогенетические конструкции, и электрофизиологии в острых срезах мозга (

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа поддерживается грантом Wellcome 206401/Z/17/Z. Мы хотели бы поблагодарить Зафара Башира за его экспертное наставничество и доктора Клэра Бута за техническую помощь и комментарии к рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright fluorescence microscopeLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

Ссылки

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены