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Résumé

Nous présentons ici un protocole décrivant la transduction virale de régions cérébrales discrètes avec des constructions optogénétiques pour permettre une caractérisation électrophysiologique spécifique des synapses dans des tranches de cerveau de rongeurs aigus.

Résumé

L’étude des propriétés physiologiques de synapses spécifiques dans le cerveau et de la façon dont elles subissent des changements plastiques est un défi clé dans les neurosciences modernes. Les techniques électrophysiologiques in vitro traditionnelles utilisent la stimulation électrique pour évoquer la transmission synaptique. Un inconvénient majeur de cette méthode est sa nature non spécifique; Tous les axones de la région de l’électrode stimulante seront activés, ce qui rendra difficile l’attribution d’un effet à une connexion afférente particulière. Ce problème peut être surmonté en remplaçant la stimulation électrique par une stimulation optogénétique. Nous décrivons une méthode pour combiner l’optogénétique avec des enregistrements in vitro patch-clamp. Il s’agit d’un outil puissant pour l’étude de la transmission synaptique basale et de la plasticité synaptique des connexions synaptiques anatomiquement définies avec précision et est applicable à presque toutes les voies du cerveau. Ici, nous décrivons la préparation et la manipulation d’un vecteur viral codant pour la protéine channelrhodopsine pour injection chirurgicale dans une région d’intérêt pré-synaptique (cortex préfrontal médial) dans le cerveau des rongeurs et la fabrication de tranches aiguës de régions cibles en aval (cortex entorhinal latéral). Une procédure détaillée pour combiner des enregistrements patch-clamp avec l’activation synaptique par stimulation lumineuse pour étudier la plasticité synaptique à court et à long terme est également présentée. Nous discutons d’exemples d’expériences qui atteignent la spécificité de la voie et de la cellule en combinant l’optogénétique et le marquage cellulaire Cre-dépendant. Enfin, la confirmation histologique de la région d’intérêt pré-synaptique est décrite avec le marquage biocytine de la cellule post-synaptique, afin de permettre une identification plus approfondie de l’emplacement précis et du type de cellule.

Introduction

Comprendre la physiologie des synapses et comment elles subissent des changements plastiques est fondamental pour comprendre comment les réseaux cérébraux fonctionnent dans le cerveau sain1, et comment ils fonctionnent mal dans les troubles cérébraux. L’utilisation de tranches cérébrales ex vivo aiguës permet d’enregistrer l’activité électrique des synapses à partir de neurones individuels avec un rapport signal sur bruit élevé à l’aide d’enregistrements patch-clamp à cellules entières. Le contrôle du potentiel membranaire et la manipulation pharmacologique directe permettent d’isoler les sous-types de récepteurs. Ces enregistrements peuvent être réalisés avec une spécificité exquise pour identifier le neurone post-synaptique, y compris la position laminaire et sous-régionale2, la morphologie cellulaire3, la présence de marqueurs moléculaires4, ses projections afférentes5, ou même s’il était récemment actif6.

Atteindre la spécificité des entrées pré-synaptiques est, cependant, un peu plus difficile. La méthode conventionnelle a utilisé des électrodes de stimulation pour exciter les axones qui courent dans une lame particulière. Un exemple de ceci est dans l’hippocampe où la stimulation locale dans la strate radiane active les synapses qui se projettent du CA3 au sous-champ CA17. Dans ce cas, la spécificité présynaptique est atteinte car l’entrée CA3 représente la seule entrée excitatrice située dans la strate radiale qui se projette vers les cellules pyramidales CA18. Ce haut degré de spécificité d’entrée réalisable avec l’activation électrique présynaptique conventionnelle des axones CA3-CA1 est cependant une exception qui se reflète dans l’étude intense à laquelle cette synapse a été soumise. Dans d’autres régions du cerveau, les axones de plusieurs voies afférentes coexistent dans la même lame, par exemple dans la couche 1 du néocortex9, rendant ainsi impossible la stimulation présynaptique spécifique à l’entrée avec des électrodes de stimulation conventionnelles. Ceci est problématique car différentes entrées synaptiques peuvent avoir des propriétés physiologiques divergentes; Par conséquent, leur co-stimulation peut conduire à une mauvaise caractérisation de la physiologie synaptique.

L’avènement de l’optogénétique, le codage génétique de protéines membranaires photosensibles (opsines) telles que la channelrhodopsine-2 (ChR2), a permis une vaste expansion des possibilités d’étude des projections synaptiques isolées entre les régions du cerveau10,11. Nous décrivons ici une solution généralisable et peu coûteuse pour étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme. Les constructions optogénétiques sont délivrées de manière très spécifique à l’aide de vecteurs viraux permettant un contrôle extrêmement précis de la région pré-synaptique d’intérêt. Les projections efférentes exprimeront le canal activé par la lumière permettant l’activation de ces fibres dans une région cible. Ainsi, les voies anatomiquement diffuses à longue portée qui ne peuvent pas être activées indépendamment par une stimulation électrique traditionnelle et non spécifique peuvent être étudiées.

Nous décrivons, à titre d’exemple, la transduction du cortex préfrontal médian (mPFC) avec des virus adéno-associés (AAV) codant pour les opsines des canaux cationiques excitateurs. Nous décrivons ensuite la préparation de tranches aiguës à partir du cortex entorhinal latéral (LEC), les enregistrements patch-clamp des neurones pyramidaux LEC de couche 5 et l’activation évoquée par la lumière des projections glutamatergiques mPFC-LEC (Figure 1). Nous décrivons également l’évaluation histologique du site d’injection pour confirmer l’emplacement de la région d’intérêt pré-synaptique et l’identification de la morphologie cellulaire post-synaptique.

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Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément à la loi britannique sur les procédures scientifiques relatives aux animaux (1986) et aux directives connexes ainsi qu’aux directives institutionnelles locales.

1. Injection virale stéréotaxique

REMARQUE: Le protocole actuel exige une spécificité anatomique, mais pas de type de cellule post-synaptique.

  1. Choisissez l’animal approprié. Des rats à capuchon Lister mâles de type sauvage ont été utilisés dans ce protocole (300-350 g, âgés d’environ 3 mois).
  2. Choisissez la construction virale appropriée. Il y a plusieurs facteurs à considérer (voir la discussion). Le protocole actuel utilise un virus pour exprimer le canal optogénétique ChETATC 12, pour transduire les neurones excitateurs (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titre: 3,3 x10 13 génomes viraux/mL).
  3. Établir les coordonnées et le volume d’injection à l’aide d’un atlas cérébral tel que décrit précédemment35.
  4. Injection stéréotaxique de la préparation virale
    REMARQUE : Toutes les directives nationales et institutionnelles pertinentes pour l’utilisation et les soins des animaux doivent être suivies. Les vecteurs viraux sont injectés stéréotaxiquement comme décrit précédemment13 avec les modifications suivantes.
    1. Gardez la préparation virale sur la glace pendant l’anesthésie et la préparation de l’animal.
    2. Induire l’anesthésie dans une chambre d’induction anesthésique avec 4% d’isoflurane. Surveiller le niveau d’anesthésie indiqué par une respiration régulière plus lente (1 Hz) et l’absence de réflexes pédales et cornéens (test en pinçant les orteils et en touchant légèrement le coin de l’œil, respectivement; aucune réponse ne doit être détectée).
    3. Administrer un analgésique préopératoire tel que le méloxicam au moins 30 minutes avant la procédure invasive.
    4. Lorsque l’animal est complètement anesthésié, utilisez des tondeuses pour enlever la fourrure du cuir chevelu. Basculez le flux d’isoflurane vers le cône de nez du cadre stéréotaxique et montez le rat dans le cadre. Appliquez un gel lubrifiant pour les yeux sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant la procédure.
    5. La chirurgie doit être entreprise dans des conditions aseptiques. Utilisez des gants et des instruments stériles tout au long de la procédure. Appliquez une pommade à la lidocaïne (5% p / p) avant de désinfecter le cuir chevelu avec une solution de chlorhexidine à 4% p / v, puis couvrez le corps avec un champ stérile. À l’aide d’un scalpel, faites une incision longitudinale d’environ 15 mm de longueur sur le cuir chevelu pour exposer le bregma.
    6. Chargez une seringue Hamilton dans une pompe à seringue à microinjection fixée à un bras mobile monté sur le cadre stéréotaxique.
    7. Placez une partie aliquote de 5 μL du virus dans un tube de 0,2 mL et faites tourner pendant quelques secondes jusqu’à ce que tout le volume soit dans le fond du tube. Pipeter 2 μL de la préparation virale dans le couvercle du tube.
    8. Remplissez la seringue avec la préparation virale en regardant d’abord l’extrémité de l’aiguille avec un microscope chirurgical, puis placez manuellement le bolus du virus à l’extrémité de l’aiguille et retirez le piston de la seringue à l’aide des commandes de la pompe.
    9. Réglez le volume d’injection de la pompe à 300 nL et le débit à 100 nL/min. Faites fonctionner la pompe et confirmez le bon débit en observant la gouttelette du virus à l’extrémité de l’aiguille. Absorbez le virus sur un coton-tige et nettoyez délicatement l’aiguille avec de l’éthanol à 70%.
    10. À l’aide des vis de réglage sur le cadre stéréotaxique, naviguez la pointe de l’aiguille vers le bregma (le point sur le crâne où les sutures coronales et sagittales se rencontrent) et notez les mesures stéréotaxiques observées sur les trois échelles de vernier sur le cadre. Les coordonnées relatives au bregma du mPFC chez le rat sont antéro-postérieur + 3,1 mm, médiolatéral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm ; Ajoutez/soustrayez (comme indiqué) ces distances des coordonnées de Bregma, puis naviguez l’aiguille vers les coordonnées antérieure-postérieure et médiolatérale et abaissez doucement l’aiguille sur la surface du crâne.
      NOTA: Les coordonnées mPFC indiquées ci-dessus sont appropriées pour les rats à capuchon mâles de 300 à 350 g; les changements dans la souche et la taille du rat peuvent nécessiter des modifications de ces coordonnées (voir la discussion).
    11. Soulevez l’aiguille de la surface du crâne et marquez ce point avec un marqueur permanent à pointe fine. Faites un trou de bavure à cet endroit à l’aide d’une micro-perceuse montée sur le bras stéréotaxique.
    12. Insérez l’aiguille dans le cerveau à la coordonnée dorso-ventrale prédéterminée et perfuser un volume prédéterminé (pour mPFC: 300 nL). Laisser l’aiguille in situ pendant 10 min pour permettre la diffusion du bol alimentaire. Lors du retrait de l’aiguille, faites fonctionner la pompe pour vous assurer que l’aiguille n’est pas bloquée.
      REMARQUE : Insérez et retirez l’aiguille lentement (~3 mm/min) pour minimiser les dommages au tissu cérébral et le reflux du virus dans le tractus de l’aiguille.
    13. Administrer 2,5 mL de solution de chlorure de sodium réchauffé (0,9 % p/v) et de glucose (5 % p/v) par voie sous-cutanée pour maintenir l’hydratation.
    14. Répétez l’étape 1.4.12. pour le deuxième hémisphère.
    15. Suturer l’incision du cuir chevelu et, à la fin de la procédure, administrer 2,5 mL de chlorure de sodium et de solution de glucose et un analgésique approprié, recommandé par l’institution, pour la gestion de la douleur, par exemple la buprénorphine ou le méloxicam. Ne laissez pas l’animal sans surveillance pendant qu’il est inconscient. Placez le rat dans une boîte de récupération chauffée jusqu’à ce qu’il reprenne complètement conscience. Ne retournez dans la cage familiale avec d’autres animaux qu’une fois complètement rétablis.
    16. Suivez les lignes directrices de l’établissement pour les soins postopératoires et les procédures d’hébergement pour les rongeurs transfectés par viraux. Attendez au moins 2 semaines que le transgène d’opsine s’exprime adéquatement avant de commencer l’expérience.
      REMARQUE: Le temps nécessaire à la transduction dépend de la distance et de la force de la connexion entre les régions pré et post-synaptiques. Pour mPFC à LEC, 4-6 semaines sont nécessaires.

2. Préparation de tranches de cerveau aiguës

REMARQUE: Nous décrivons ici une méthode simple pour la préparation de tranches de cerveau qui, entre nos mains, est suffisante pour obtenir des tranches corticales, hippocampiques et thalamiques de haute qualité provenant de souris et de rats adultes.

  1. Préparer les solutions pour la dissection.
    1. Remplir un bécher de 250 mL avec ~200 mL de solution de coupe de saccharose glacée (189 mM de saccharose, 26 mM de NaHCO3, 10 mM de D-glucose, 5 mM de MgSO 4, 3 mM de KCl, 1,25 mM de NaH 2 PO4 et 0,2 mM de CaCl 2 fabriqué dans de l’eau ultrapure (UPW) avec une résistivité de 18,2 MΩ cm à 25 °C) ou un volume suffisant pour remplir la chambre tissulaire du vibratome. Buller avec du carbogène (95% O 2, 5% CO2) et garder sur la glace.
    2. Remplir une tranche de la chambre de collecte avec du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucose,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 et 1 mM MgSO4 fabriqué en UPW) à température ambiante, bulle de carbogène. La chambre de collecte des tranches14 est fabriquée sur mesure à partir d’un support de tubes microcentrifugés collés sur une feuille de maille de nylon et placés dans un bécher dans lequel il est immergé dans un CSF (Figure 2A).
    3. Remplir un tube de 50 mL avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon phosphate (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O et 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
      ATTENTION : Le PFA est toxique. Utiliser dans la hotte.
  2. Dissection du cerveau.
    1. Anesthésier le rat dans une chambre à induction en utilisant 5% d’isoflurane jusqu’à ce que la respiration soit lente et régulière (~1 Hz). Assurer un niveau suffisant de test d’anesthésie pour l’absence de réflexes pédales et cornéens.
    2. Décapitez l’animal à l’aide d’une guillotine.
    3. Disséquer rapidement tout le cerveau comme décrit précédemment15 et transférer dans une solution de coupe de saccharose. Terminez l’étape dans les 90 s suivant la décapitation pour une bonne qualité de tranche et un enregistrement complet réussi.
    4. À l’aide d’une cuillère à café en métal, ramassez le cerveau, jetez l’excès de solution de coupe et placez-le sur un morceau de papier filtre sur la paillasse.
    5. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, retirez rapidement le cervelet et coupez le cerveau dans le plan coronal environ à mi-chemin sur sa longueur; la moitié postérieure est le bloc tissulaire LEC. Assurez-vous d’inclure un excès de tissu en plus de la région à trancher pour les prochaines étapes. Retournez à la fois ce bloc tissulaire et le reste du cerveau à la solution de coupe de saccharose.
    6. Déposer une goutte de colle cyanoacrylate sur une scène de tissu de vibratome. Étalez-le en une fine couche avec une zone légèrement plus grande que le bloc de tissu créé à l’étape précédente.
    7. Ramassez le bloc de tissu LEC à l’aide d’une cuillère à café, jetez l’excès de solution et transférez-le sur le patch de colle de sorte que la coupe coronale antérieure ait adhéré.
    8. Installez la scène dans la chambre tissulaire du vibratome et versez rapidement une quantité suffisante de solution de coupe de saccharose pour submerger le tissu; Buller cette solution avec du carbogen. Orientez le bloc tissulaire LEC avec la surface ventrale vers la lame. Bien que l’éclairage ambiant de la pièce soit insuffisant pour activer l’opsine, évitez d’utiliser des sources lumineuses supplémentaires qui pourraient être présentes sur le vibratome.
    9. Couper des tranches de 350 μm d’épaisseur du ventral au dorsal en utilisant une vitesse d’oscillation élevée de la lame (100 Hz) et une vitesse d’avancement lente de la lame (0,06 mm/s). En règle générale, sept tranches LEC peuvent être obtenues par hémisphère.
    10. Transférer les tranches dans la chambre de collecte des tranches. Une fois la collecte des tranches terminée, transférer la chambre de collecte dans un bain-marie à 34 °C pendant 1 h avant de revenir à température ambiante. Bulle avec carbogen en continu. Les tranches seront suffisamment saines pour être enregistrées pendant au moins 6 h.
    11. Placer le reste du cerveau dans du PFA pendant 48 heures pour un examen post-hoc du site d’injection (voir rubrique 4).

3. Électrophysiologie et stimulation optogénétique

  1. Identification de la cellule cible.
    1. Placer la tranche dans une chambre d’enregistrement immergée à 34 °C perfusée avec du LCa à un débit de 2 mL/min par une pompe péristaltique. Immobiliser la tranche à l’aide d’une ancre de tranche.
    2. Sous l’objectif à faible grossissement (4x) d’un microscope grand champ utilisant un éclairage infrarouge oblique, naviguez jusqu’à la couche LEC 5. Mesurez la distance entre la surface de la pile et la couche requise.
      REMARQUE : L’éclairage infrarouge oblique a été obtenu en positionnant une LED proche infrarouge à environ 3 mm sous le couvercle de la chambre d’enregistrement à un angle de ~55° par rapport au plan de la lamelle de couverture (figure 2B). Le contraste interférentiel différentiel est une technique d’imagerie alternative et couramment utilisée pour l’électrophysiologie des coupes.
    3. Passez à un objectif d’immersion dans l’eau à fort grossissement (40x) et identifiez les neurones pyramidaux. Marquez la position de la cellule sur l’écran de l’ordinateur avec du ruban adhésif.
      NOTE: Les neurones pyramidaux ont une morphologie à peu près triangulaire avec des dendrites apicales proéminentes projetant vers la surface piale de la tranche (Figure 3A). La santé cellulaire peut être évaluée par l’absence d’un noyau condensé et visible et l’inspection de la membrane plasmique qui devrait apparaître lisse. Il est peu probable que le marquage fluorescent clair des axones par la protéine de fusion opsine-fluorophore soit visible lors de l’utilisation d’un microscope à fluorescence à grand champ. Pour visualiser les projections axonales, effectuer une immunohistochimie post-hoc en utilisant un anticorps primaire contre le fluorophore de l’opsine et amplifier avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore de longueur d’onde identique ou similaire.
  2. Formation de patch-clamp à cellules entières.
    1. Fabriquer une micropipette en verre borosilicaté à l’aide d’un extracteur de pipette et remplir avec une solution d’enregistrement intracellulaire filtrée (120 mM de k-gluconate, 40 mM HEPES, 10 mM de KCl, 2 mM de NaCl, 2 mM de MgATP, 1 mM de MgCl, 0,3 mM de NaGTP, 0,2 mM d’EGTA et 0,25 % de biocytine fabriquée en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Placez la micropipette remplie dans le porte-électrode sur la tête de l’amplificateur à pince patch en veillant à ce que le fil d’électrode soit en contact avec la solution intracellulaire.
    2. Appliquez une pression positive par la bouche en soufflant fort dans un embout buccal (comme une seringue de 1 mL avec le piston retiré) relié par un tube à l’orifice latéral du porte-électrode et maintenez la pression en fermant une valve à trois voies en ligne. Soulevez l’objectif du microscope de telle sorte qu’un ménisque se forme et insérez l’électrode dans le ménisque jusqu’à ce qu’elle puisse être vue au microscope.
    3. Ouvrez la fenêtre Test d’étanchéité dans WinLTP16 (ou un autre logiciel d’acquisition/oscilloscope) et avec l’amplificateur en mode tension-pince, appliquez une impulsion carrée de 5 mV pour déterminer si la résistance de la pipette est de 3 à 6 MΩ.
    4. Approchez et touchez la cellule identifiée avec l’embout de la pipette; cela devrait entraîner une indentation dans la membrane cellulaire (Figure 3A; panneau de droite) et une légère augmentation de la résistance de la pipette (0,1 MΩ).
    5. Relâchez la pression positive et appliquez une pression négative en appliquant une aspiration modérée à l’embout buccal; cela devrait entraîner une augmentation considérable de la résistance des pipettes (>1000 MΩ). La pression peut maintenant être laissée neutre. Appliquez une pression négative dans une rampe progressivement croissante jusqu’à ce que la membrane cellulaire se rompe, ce qui entraîne des transitoires de capacité de la cellule entière.
  3. Enregistrer les événements synaptiques évoqués optogénétiquement.
    1. Entrez la configuration de la pince de courant.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, la transmission synaptique à longue distance est glutamatergique, par conséquent, l’enregistrement à des potentiels membranaires proches du potentiel d’inversion du chlorure permettra d’isoler au mieux la transmission médiée par le récepteur AMPA (AMPAR) et de minimiser la mesure de toute inhibition du flux vers l’avant (FFI) évoquée. L’inversion du chlorure dépend de la composition de la solution d’enregistrement intracellulaire et du LCa et peut être calculée à l’aide de l’équation de Goldman-Hodgkin-Katz; pour les solutions ci-dessus, il s’agissait de -61,3 mV. Les neurones pyramidaux LEC de couche 5 avaient un potentiel membranaire au repos moyen de -62 mV et, si nécessaire, étaient maintenus à ce potentiel par injection de courant constant. Alternativement, les cellules peuvent être serrées en tension au potentiel souhaité. Pour enregistrer des projections inhibitrices à longue portée16 ou pour enregistrer FFI, pince de tension au potentiel d’inversion cationique pour isoler la conductance du chlorure GABAergique. Lorsque les neurones de serrage de tension à des potentiels membranaires supérieurs au seuil de potentiel d’action, une solution intracellulaire à base de césium contenant des inhibiteurs des canaux sodiques voltage-dépendants est utilisée pour améliorer la pince de tension et empêcher l’initiation des potentiels d’action (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 chlorure,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% de biocytine fabriquée en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
    2. À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données, envoyez des signaux de logique transistor-transistor (TTL) à un pilote LED pour activer une LED 470 nm montée. La LED montée est dirigée dans le trajet lumineux du microscope à l’aide de cubes filtrants et d’optiques appropriées (Figure 2B) pour appliquer des impulsions lumineuses à la tranche via l’objectif 40x pour évoquer des potentiels post-synaptiques optogénétiques (oEPSP).
      REMARQUE: Les impulsions lumineuses peuvent être appliquées périsomatiquement / sur les dendrites, ce qui entraînera l’activation des opsines dans les axones et le bouton présynaptique, ou l’investigateur peut déplacer l’objectif vers les axones loin de la cellule enregistrée pour éviter la stimulation par sur-bouton (voir Discussion). L’amplitude maximale de l’oEPSP dépend de la force de la projection synaptique, de l’efficacité des injections virales et de l’opsine utilisée. les oEPSP peuvent être titrés à l’amplitude souhaitée en faisant varier l’intensité et/ou la durée de la lumière18; La variation de la durée des impulsions lumineuses (durée typique comprise entre 0,2 et 5 ms à la puissance maximale de sortie de la LED, ce qui donne une densité lumineuse de 4,4 mW/mm19) donne des amplitudes oEPSP plus constantes que la modification de la puissance de sortie de la LED.
    3. Étudier les propriétés de libération présynaptique (changement de tension) en délivrant des trains d’impulsions lumineuses multiples avec différents intervalles inter-stimulus (figure 3E); Des précautions doivent être prises lors de l’interprétation de la transmission optogénétiquement évoquée (voir Discussion).
    4. Étudier la plasticité à long terme soit en évoquant de manière répétitive les oEPSP19 ou en appliquant des ligands. Surveillez l’amplitude oEPSP pendant 5 à 10 minutes pour assurer la stabilité avant l’induction de la plasticité, puis surveillez jusqu’à ce qu’une amplitude stable soit atteinte (généralement 30 à 40 minutes).
      REMARQUE: La plupart des opsines actuelles ne sont pas capables d’évoquer de manière fiable des potentiels d’action multiples à des fréquences élevées, par exemple, 100 stimuli délivrés à 100 Hz, comme c’est généralement le cas pour induire la LTP.
    5. Pour confirmer que les EPSP sont monosynaptiques, effectuer une activation sur-bouton de la voie transduite en positionnant l’objectif au-dessus de la tonnelle dendritique et en stimulant en présence de tétrodotoxine 0,5 μM et d’aminopyridine 100 μM. L’application de tétrodotoxine abolira la transmission si les réponses dépendent du potentiel d’action et l’inclusion subséquente d’aminopyridine rétablira partiellement la transmission si les PSEP sont générées de manière monosynaptique19,20.
    6. Pour permettre à la biocytine de remplir le neurone, attendez au moins 15 minutes après être entré dans la configuration de la cellule entière. Dans la pince de tension, surveillez la capacité de la membrane et la résistance d’entrée.
    7. Retirez lentement la pipette le long de l’angle d’approche loin du soma de la cellule, en observant la lente disparition des transitoires capacitifs et du courant membranaire indiquant le re-scellement de la membrane cellulaire et la formation d’un patch extérieur à l’extrémité de la pipette. Notez l’orientation de la tranche et l’emplacement de la ou des cellules dans la tranche. Mettre la tranche dans PFA dans une plaque de 24 puits et incuber pendant la nuit à 4 °C, puis transférer à 0,1 M PB.
      REMARQUE: Les tranches peuvent être stockées jusqu’à une semaine. Si un stockage plus long est nécessaire, changez le PB régulièrement ou utilisez du PB contenant de l’azoture de sodium (0,02% -0,2% d’azoture de sodium).

4. Histologie

  1. Site d’injection de tranchage
    1. Après la fixation, cryoprotéger le tissu dans 30% de saccharose (p/v) dans PB jusqu’à ce qu’il coule (il flottera initialement dans la solution de saccharose), généralement pendant la nuit à température ambiante ou 24-48 h à 4 ° C.
    2. À l’aide d’un milieu à température de coupe optimale (TCM), fixer un bloc de tissu au disque de l’échantillon cryostatique. Congeler le bloc tissulaire en suivant les étapes 4.1.3 à 4.1.4.
    3. Placer l’isopentane dans un contenant approprié. Immergez uniquement le disque de l’échantillon, en vous assurant que le tissu est au-dessus du niveau de l’isopentane. Abaissez le récipient d’isopentane dans de l’azote liquide (ou de la glace sèche) et laissez le tissu geler.
    4. Une fois complètement congelé (le bloc tissulaire entier devient pâle et dur), laissez le bloc tissulaire dans la chambre du cryostat à -20 °C pendant 30 minutes pour permettre à la température du bloc de s’équilibrer.
    5. Couper des profilés de 40 μm d’épaisseur dans le cryostat à -20 °C. Utilisez un pinceau fin pour guider les sections de la lame. Collez les sections congelées à une lame de microscope en verre revêtue de poly-L-lysine à température ambiante en touchant la lame aux sections.
    6. Ajouter environ 150 μL de support de montage à chaque glissière et couvrir avec une lame; Retirez les bulles d’air en appuyant doucement sur la lamelle de couverture. Couvrir les lames pour les protéger contre le photoblanchiment et sécher à l’air libre à température ambiante pendant au moins 12 h (ou toute la nuit). À l’aide d’un microscope à fluorescence, examiner l’emplacement du site d’injection virale.
  2. Protocole de coloration à la biocytine
    REMARQUE : Ce protocole peut être appliqué à des sections épaisses ; Les tranches n’ont pas besoin d’être resectionnées.
    1. Laver les tranches de cerveau avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 et 1,8 mM KH2PO4) six fois pendant 10 minutespar lavage. Utilisez une pipette de transfert pour vider les puits après chaque étape.
    2. Incuber les tranches dans 3% H 2 O2(p / v) dans PBS pendant 30 min pour bloquer toute activité endogène de la peroxydase. Cela génère des bulles d’oxygène.
    3. Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage ou jusqu’à ce qu’aucune autre bulle d’oxygène ne soit visible. Incuber les tranches de cerveau dans une solution de complexe HRP (ABC) biotinylé à 1% (v / v) dans du PBS contenant 0,1% (v / v) Triton X-100 à température ambiante pendant 3 heures.
    4. Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage.
    5. Incuber chaque tranche dans une solution de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la coloration biocytine des structures neuronales devienne visible (prend environ 5-10 min).
      ATTENTION : Le DAB est toxique. Utiliser dans la hotte.
      REMARQUE: Les temps d’incubation DAB peuvent être imprévisibles, surveillez de près le tissu au fur et à mesure que la couleur se développe.
    6. Arrêter la réaction en transférant les tranches dans du PBS froid (4 °C). Lavez les tranches de cerveau avec du PBS six fois pendant 10 minutes par lavage. Utilisez un pinceau pour monter les tranches de cerveau sur des lames de microscope en verre revêtu de poly-L-lysine.
    7. Enlevez tout excès de PBS avec un mouchoir propre. Couvrir chaque tranche avec environ 200 μL de support de montage; Couvrir avec des lamelles de couverture et appuyer doucement sur la lamelle de couverture pour expulser les bulles d’air. Sécher à l’air libre à température ambiante pendant au moins 12 h (ou toute la nuit). À l’aide d’un microscope optique, examiner l’emplacement et les détails morphologiques de la ou des cellules.
      REMARQUE: La biocytine peut également être visualisée à l’aide de streptavidine conjuguée au fluorophore; Cependant, l’imagerie peut nécessiter une résection ou l’utilisation d’un microscope confocal21.

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Résultats

Dans ce protocole, nous décrivons comment étudier la physiologie synaptique et la plasticité à long terme en utilisant l’administration virale de constructions optogénétiques. Le protocole peut être très facilement adapté à l’étude de presque toutes les connexions à longue distance dans le cerveau. À titre d’exemple, nous décrivons l’injection d’AAV codant pour une opsine dans le mPFC du rat, la préparation de tranches aiguës à partir de LEC, les enregistrements patch-clamp à partir de neurone...

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Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour explorer des projections synaptiques à longue distance très spécifiques en utilisant une combinaison de chirurgie stéréotaxique pour délivrer des AAV codant pour des constructions optogénétiques et d’électrophysiologie dans des coupes cérébrales aiguës (Figure 1). Ensemble, ces techniques offrent des outils pour caractériser la physiologie et la plasticité des circuits cérébraux avec une grande précision dans des voies ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la subvention Wellcome 206401/Z/17/Z. Nous tenons à remercier Zafar Bashir pour son mentorat expert et le Dr Clair Booth pour son assistance technique et ses commentaires sur le manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright fluorescence microscopeLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

Références

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