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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Offenlegungen
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  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften bestimmter Synapsen im Gehirn und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist eine zentrale Herausforderung in den modernen Neurowissenschaften. Traditionelle elektrophysiologische In-vitro-Techniken verwenden elektrische Stimulation, um eine synaptische Übertragung hervorzurufen. Ein großer Nachteil dieser Methode ist ihre unspezifische Natur; Alle Axone im Bereich der stimulierenden Elektrode werden aktiviert, was es schwierig macht, einen Effekt einer bestimmten afferenten Verbindung zuzuordnen. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die elektrische Stimulation durch eine optogenetisch-basierte Stimulation ersetzt wird. Wir beschreiben eine Methode zur Kombination von Optogenetik mit in vitro Patch-Clamp-Aufnahmen. Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung sowohl der basalen synaptischen Übertragung als auch der synaptischen Plastizität präziser anatomisch definierter synaptischer Verbindungen und ist auf fast jeden Signalweg im Gehirn anwendbar. Hier beschreiben wir die Herstellung und Handhabung eines viralen Vektors, der für das Kanalrhodopsin-Protein kodiert, zur chirurgischen Injektion in eine präsynaptische Interessenregion (medialer präfrontaler Kortex) im Nagetiergehirn und zur Herstellung von akuten Schnitten nachgeschalteter Zielregionen (lateraler entorhinaler Kortex). Ein detailliertes Verfahren zur Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation zur Untersuchung der kurz- und langfristigen synaptischen Plastizität wird ebenfalls vorgestellt. Wir diskutieren Beispiele von Experimenten, die durch die Kombination von Optogenetik und Cre-abhängiger Zellmarkierung Signalweg- und Zellspezifität erreichen. Schließlich wird die histologische Bestätigung der präsynaptischen Region von Interesse zusammen mit der Biocytin-Markierung der postsynaptischen Zelle beschrieben, um eine weitere Identifizierung des genauen Ortes und des Zelltyps zu ermöglichen.

Einleitung

Das Verständnis der Physiologie von Synapsen und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist grundlegend für das Verständnis, wie Gehirnnetzwerke im gesunden Gehirn funktionieren1 und wie sie bei Hirnerkrankungen fehlfunktionieren. Die Verwendung von akuten ex vivo Gehirnschnitten ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von Synapsen einzelner Neuronen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Die Kontrolle des Membranpotentials und die einfache pharmakologische Manipulation ermöglichen die Isolierung von Rezeptorsubtypen. Diese Aufnahmen können mit exquisiter Spezifität gemacht werden, um das postsynaptische Neuron zu identifizieren, einschließlich laminarer und subregionaler Position2, zellulärer Morphologie3, Vorhandensein molekularer Marker4, seiner afferenten Projektionen5 oder sogar, wenn es kürzlich aktiv war6.

Das Erreichen der Spezifität präsynaptischer Inputs ist jedoch etwas schwieriger. Die konventionelle Methode hat Stimulationselektroden verwendet, um die Axone anzuregen, die in einer bestimmten Lamina verlaufen. Ein Beispiel dafür ist der Hippocampus, wo lokale Stimulation im Stratum radiatum Synapsen aktiviert, die vom CA3 in das CA1-Teilfeld7 projizieren. In diesem Fall wird eine präsynaptische Spezifität erreicht, da der CA3-Input den einzigen exzitatorischen Input darstellt, der sich innerhalb des Stratum radiatum befindet, das auf CA1-Pyramidenzellen8 projiziert. Dieser hohe Grad an Eingangsspezifität, der mit konventioneller elektrischer präsynaptischer Aktivierung von CA3-CA1-Axonen erreicht werden kann, ist jedoch eine Ausnahme, die sich in der intensiven Studie widerspiegelt, der diese Synapse unterzogen wurde. In anderen Hirnregionen koexistieren Axone aus mehreren afferenten Signalwegen in derselben Lamina, beispielsweise in Schicht 1 des Neocortex9, so dass eine inputspezifische präsynaptische Stimulation mit herkömmlichen Stimulationselektroden unmöglich wird. Dies ist problematisch, da verschiedene synaptische Inputs unterschiedliche physiologische Eigenschaften haben können; Daher kann ihre Co-Stimulation zu einer Fehlcharakterisierung der synaptischen Physiologie führen.

Das Aufkommen der Optogenetik, der genetischen Kodierung von lichtempfindlichen Membranproteinen (Opsinen) wie Kanalrhodopsin-2 (ChR2), hat eine enorme Erweiterung der Möglichkeiten zur Untersuchung isolierter synaptischer Projektionen zwischen Gehirnregionen ermöglicht10,11. Hier beschreiben wir eine verallgemeinerbare und kostengünstige Lösung zur Untersuchung der synaptischen Physiologie und Plastizität mit großer Reichweite. Die optogenetischen Konstrukte werden hochspezifisch mit Hilfe viraler Vektoren geliefert, die eine äußerst präzise Kontrolle der präsynaptischen Region von Interesse ermöglichen. Efferente Projektionen drücken den lichtaktivierten Kanal aus, der die Aktivierung dieser Fasern in einer Zielregion ermöglicht. So können langreichweitige, anatomisch diffuse Signalwege untersucht werden, die durch herkömmliche, unspezifische, elektrische Stimulation nicht unabhängig aktiviert werden können.

Wir beschreiben als Beispielweg die Transduktion des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) mit adeno-assoziierten Viren (AAVs), die exzitatorische Kationenkanal-Opsine kodieren. Wir beschreiben dann die Herstellung von akuten Schnitten aus lateralem entorhinalen Kortex (LEC), Patch-Clamp-Aufnahmen von LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 und die lichtevozierte Aktivierung glutamaterger mPFC-LEC-Projektionen (Abbildung 1). Wir beschreiben auch die histologische Beurteilung der Injektionsstelle, um die Lage der präsynaptischen Region von Interesse zu bestätigen und die postsynaptische Zellmorphologie zu identifizieren.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) und den damit verbundenen Richtlinien sowie lokalen institutionellen Richtlinien durchgeführt.

1. Stereotaktische Virusinjektion

HINWEIS: Das aktuelle Protokoll erfordert anatomische, aber keine postsynaptische Zelltyp-Spezifität.

  1. Wählen Sie das passende Tier aus. In diesem Protokoll wurden männliche Wildtyp-Lister-Kapuzenratten verwendet (300-350 g, ca. 3 Monate alt).
  2. Wählen Sie das geeignete virale Konstrukt aus. Es gibt mehrere Faktoren zu berücksichtigen (siehe Diskussion). Das aktuelle Protokoll verwendet ein Virus, um den optogenetischen Kanal ChETATC 12 zu exprimieren, um exzitatorische Neuronen zu transduzieren (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; Titer: 3,3 x 1013 virale Genome/ml).
  3. Ermitteln Sie die Koordinaten und das Volumen der Injektion unter Verwendung eines Hirnatlas, wie zuvor beschrieben35.
  4. Stereotaktische Injektion des viralen Präparats
    HINWEIS: Alle relevanten nationalen und institutionellen Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Tieren sollten befolgt werden. Die viralen Vektoren werden wie zuvor beschrieben stereotaktisch injiziert13 mit den folgenden Änderungen.
    1. Halten Sie das virale Präparat während der Anästhesie und Vorbereitung des Tieres auf Eis.
    2. Induktion der Anästhesie in einer Anästhesieinduktionskammer mit 4% Isofluran. Überwachen Sie den Grad der Anästhesie, der durch eine langsamere regelmäßige Atemfrequenz (1 Hz) und das Fehlen von Pedal- und Hornhautreflexen angezeigt wird (Test durch Einklemmen der Zehen bzw. leichtes Berühren des Augenwinkels; es sollte keine Reaktion festgestellt werden).
    3. Verabreichen Sie präoperative Analgetika wie Meloxicam mindestens 30 Minuten vor dem invasiven Eingriff.
    4. Wenn das Tier vollständig betäubt ist, verwenden Sie Haarschneider, um das Fell von der Kopfhaut zu entfernen. Schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkegel des stereotaktischen Rahmens und montieren Sie die Ratte in den Rahmen. Tragen Sie Gleitgel auf die Augen auf, um Trockenheit während des Eingriffs zu vermeiden.
    5. Die Operation sollte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Verwenden Sie während des gesamten Verfahrens sterile Handschuhe und Instrumente. Tragen Sie Lidocainsalbe (5% w/w) auf, bevor Sie die Kopfhaut mit 4% w/v Chlorhexidinlösung desinfizieren, und bedecken Sie dann den Körper mit einem sterilen Tuch. Machen Sie mit einem Skalpell einen etwa 15 mm langen Längsschnitt auf der Kopfhaut, um Bregma freizulegen.
    6. Legen Sie eine Hamilton-Spritze in eine Mikroinjektionsspritzenpumpe, die an einem beweglichen Arm befestigt ist, der am stereotaktischen Rahmen befestigt ist.
    7. Geben Sie ein 5 μL Aliquot des Virus in ein 0,2 ml Röhrchen und drehen Sie sich für einige Sekunden, bis sich das gesamte Volumen im Boden des Röhrchens befindet. Pipettieren Sie 2 μL des viralen Präparats in den Deckel der Röhre.
    8. Füllen Sie die Spritze mit dem viralen Präparat, indem Sie zuerst die Nadelspitze mit einem Operationsmikroskop betrachten und dann manuell den Bolus des Virus an der Nadelspitze platzieren und den Spritzenkolben mit den Pumpensteuerungen herausziehen.
    9. Stellen Sie das Pumpeneinspritzvolumen auf 300 nL und die Durchflussrate auf 100 nL/min ein. Lassen Sie die Pumpe laufen und bestätigen Sie den ordnungsgemäßen Durchfluss, indem Sie den Tröpfchen des Virus an der Nadelspitze beobachten. Nehmen Sie das Virus auf einem Wattestäbchen auf und reinigen Sie die Nadel vorsichtig mit 70% Ethanol.
    10. Mit den Einstellschrauben am stereotaktischen Rahmen navigieren Sie die Nadelspitze zu Bregma (der Punkt auf dem Schädel, an dem sich die koronalen und sagittalen Nähte treffen) und notieren Sie sich die stereotaktischen Messungen, die auf den drei Vernierskalen auf dem Rahmen beobachtet werden. Die Koordinaten relativ zum Bregma der Ratte mPFC sind anterior-posterior + 3,1 mm, mediolateral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; Addieren/subtrahieren (wie angegeben) diese Abstände von Bregma-Koordinaten und navigieren Sie dann die Nadel zu den vorder-posterioren und mediolateralen Koordinaten und senken Sie die Nadel vorsichtig auf die Schädeloberfläche.
      HINWEIS: Die oben angegebenen mPFC-Koordinaten sind für männliche Lister-Haubenratten von 300-350 g geeignet; Änderungen des Rattenstamms und der Größe können Änderungen an diesen Koordinaten erfordern (siehe Diskussion).
    11. Heben Sie die Nadel von der Schädeloberfläche ab und markieren Sie diesen Punkt mit einem feinspitzen Permanentmarkerstift. Machen Sie an dieser Stelle ein Gratloch mit einem Mikrobohrer, der am stereotaktischen Arm montiert ist.
    12. Führen Sie die Nadel an der vorgegebenen dorsoventralen Koordinate in das Gehirn ein und infundieren Sie ein vorgegebenes Volumen (für mPFC: 300 nL). Lassen Sie die Nadel 10 Minuten in situ , um die Diffusion des Bolus zu ermöglichen. Lassen Sie nach dem Entfernen der Nadel die Pumpe laufen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht blockiert ist.
      HINWEIS: Führen Sie die Nadel langsam ein und entfernen Sie sie (~ 3 mm / min), um die Schädigung des Hirngewebes und den Rückfluss des Virus in den Nadeltrakt zu minimieren.
    13. Verabreichen Sie 2,5 ml erwärmte Natriumchloridlösung (0,9% w/v) und Glucose (5% w/v) subkutan, um die Hydratation aufrechtzuerhalten.
    14. Wiederholen Sie Schritt 1.4.12. für die zweite Hemisphäre.
    15. Vernähen Sie den Kopfhautschnitt und verabreichen Sie nach Abschluss des Verfahrens 2,5 ml Natriumchlorid- und Glukoselösung und ein geeignetes, institutionell empfohlenes Analgetikum zur Schmerzbehandlung, z. B. Buprenorphin oder Meloxicam. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, während Sie bewusstlos sind. Legen Sie die Ratte in eine beheizte Auffangbox, bis sie wieder vollständig zu Bewusstsein kommt. Kehren Sie erst mit anderen Tieren in den heimischen Käfig zurück, wenn Sie sich vollständig erholt haben.
    16. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für postoperative Pflege und Unterbringungsverfahren für viral-transfizierte Nagetiere. Warten Sie mindestens 2 Wochen, bis das Opsin-Transgen ausreichend exprimiert ist, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
      HINWEIS: Die für die Transduktion benötigte Zeit hängt von der Entfernung und Stärke der Verbindung zwischen den prä- und postsynaptischen Regionen ab. Für mPFC zu LEC sind 4-6 Wochen erforderlich.

2. Vorbereitung von akuten Hirnschnitten

HINWEIS: Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Herstellung von Gehirnschnitten, die in unseren Händen ausreicht, um qualitativ hochwertige kortikale, hippocampusle und thalamische Schnitte von erwachsenen Mäusen und Ratten zu erhalten.

  1. Bereiten Sie die Lösungen für die Sektion vor.
    1. Füllen Sie ein 250-ml-Becherglas mit ~200 mL eiskalter Saccharose-Schneidlösung (189 mM Saccharose, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-Glucose, 5 mM MgSO4,3 mM KCl, 1,25 mMNaH2PO4 und 0,2 mM CaCl 2 in Reinstwasser (UPW) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ cm bei 25 °C) oder einem ausreichenden Volumen zum Füllen der Vibratom-Gewebekammer. Mit Carbogen (95% O2, 5%CO2) sprudeln und auf Eis halten.
    2. Füllen Sie eine Scheibensammelkammer mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-Glucose,3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mMNaH2PO 4 und 1 mM MgSO4 made in UPW) bei Raumtemperatur, bubbled mit Carbogen. Die Scheibensammelkammer14 ist maßgefertigt aus einem Mikrozentrifugenrohrgestell, das auf eine Nylongitterfolie geklebt und in ein Becherglas gegeben wird, in das es in aCSF getaucht wird (Abbildung 2A).
    3. Füllen Sie ein 50-ml-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer (PB; 75,4 mM Na2HPO4,7H2O und24,6 mM NaH2PO4). H2O).
      ACHTUNG: PFA ist giftig. Verwendung in Abzügen.
  2. Dissektion des Gehirns.
    1. Anästhesieren Sie die Ratte in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran, bis die Atmung langsam und regelmäßig ist (~ 1 Hz). Um ein ausreichendes Maß an Anästhesie zu gewährleisten, testen Sie das Fehlen von Pedal- und Hornhautreflexen.
    2. Enthaupten Sie das Tier mit einer Guillotine.
    3. Das gesamte Gehirn wie zuvor beschrieben schnell sezieren15 und in Saccharose-Schneidelösung überführen. Schließen Sie den Schritt innerhalb von 90 Sekunden nach der Enthauptung ab, um eine gute Scheibenqualität und eine erfolgreiche Ganzzellenaufzeichnung zu erzielen.
    4. Nehmen Sie mit einem Metallteelöffel das Gehirn auf, entsorgen Sie überschüssige Schneidlösung und legen Sie es auf ein Stück Filterpapier auf der Tischplatte.
    5. Entfernen Sie mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge schnell das Kleinhirn und schneiden Sie das Großhirn in der koronalen Ebene etwa zur Hälfte seiner Länge ab; die hintere Hälfte ist der LEC-Gewebeblock. Stellen Sie sicher, dass Sie zusätzlich zu der Region, die für die nächsten Schritte geschnitten werden soll, etwas überschüssiges Gewebe enthalten. Bringen Sie sowohl diesen Gewebeblock als auch den Rest des Gehirns zur Saccharose-Schneidelösung zurück.
    6. Legen Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf eine Vibratom-Gewebestufe. Verteilen Sie es in einer dünnen Schicht mit einer Fläche, die etwas größer ist als der im vorherigen Schritt erstellte Gewebeblock.
    7. Nehmen Sie den LEC-Gewebeblock mit einem Teelöffel auf, verwerfen Sie überschüssige Lösung und übertragen Sie ihn auf das Klebepflaster, so dass der vordere koronale Schnitt haften geblieben ist.
    8. Installieren Sie die Stufe in die Vibratom-Gewebekammer und gießen Sie schnell eine ausreichende Menge Saccharose-Schneidlösung, um das Gewebe einzutauchen; Bubble diese Lösung mit Carbogen. Richten Sie den LEC-Gewebeblock mit der ventralen Oberfläche in Richtung Klinge aus. Während die Umgebungsbeleuchtung nicht ausreicht, um das Opsin zu aktivieren, vermeiden Sie die Verwendung zusätzlicher Lichtquellen, die auf dem Vibratom vorhanden sein könnten.
    9. Schneiden Sie Scheiben von 350 μm Dicke von ventral nach dorsal mit einer hohen Klingenschwingungsgeschwindigkeit (100 Hz) und einer langsamen Klingenvorschubgeschwindigkeit (0,06 mm/s). Typischerweise können sieben LEC-Scheiben pro Hemisphäre erhalten werden.
    10. Übertragen Sie die Scheiben in die Schichtsammelkammer. Nach Abschluss der Scheibensammlung die Auffangkammer für 1 h in ein 34 °C warmes Wasserbad überführen, bevor sie wieder Raumtemperatur erreicht. Mit Carbogen kontinuierlich sprudeln. Die Scheiben sind ausreichend gesund, um mindestens 6 Stunden lang aufgezeichnet zu werden.
    11. Legen Sie den Rest des Gehirns für 48 Stunden in PFA zur post-hoc-Untersuchung der Injektionsstelle (siehe Abschnitt 4).

3. Elektrophysiologie und optogenetische Stimulation

  1. Identifizierung der Zielzelle.
    1. Die Scheibe wird in eine untergetauchte Aufnahmekammer bei 34 °C gegeben, die mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min durch eine Schlauchpumpe mit aCSF durchblutet wird. Immobilisieren Sie die Scheibe mit einem Schichtanker.
    2. Navigieren Sie unter dem Objektiv mit geringer Vergrößerung (4x) eines Weitfeldmikroskops mit schräger Infrarotbeleuchtung zur LEC-Schicht 5. Messen Sie den Abstand von der Pialoberfläche zur gewünschten Schicht.
      HINWEIS: Die schräge Infrarotbeleuchtung wurde erreicht, indem eine Nahinfrarot-LED etwa 3 mm unter dem Deckglas der Aufnahmekammer in einem Winkel von ~55° zur Ebene des Deckglases positioniert wurde (Abbildung 2B). Der differentielle Interferenzkontrast ist ein alternatives und häufig verwendetes bildgebendes Verfahren für die Schnittelektrophysiologie.
    3. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung (40x) und identifizieren Sie pyramidale Neuronen. Markieren Sie die Position der Zelle auf dem Computermonitor mit Klebeband.
      HINWEIS: Die pyramidalen Neuronen haben eine annähernd dreieckige Morphologie mit prominenten apikalen Dendriten, die in Richtung der Pialoberfläche der Scheibe ragen (Abbildung 3A). Die Zellgesundheit kann durch das Fehlen eines kondensierten, sichtbaren Kerns und die Inspektion der Plasmamembran, die glatt erscheinen sollte, beurteilt werden. Es ist unwahrscheinlich, dass eine klare fluoreszierende Markierung von Axonen durch das Opsin-Fluorophor-Fusionsprotein sichtbar ist, wenn ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop verwendet wird. Um axonale Projektionen zu visualisieren, führen Sie eine Immunhistochemie post-hoc mit einem primären Antikörper gegen das Fluorophor des Opsins durch und amplifizieren Sie mit einem sekundären Antikörper, der an einen Fluorophor der gleichen oder ähnlichen Wellenlänge konjugiert ist.
  2. Bildung einer Ganzzell-Patch-Klemme.
    1. Herstellung einer Borosilikatglas-Mikropipette unter Verwendung eines Pipettenziehers und Befüllung mit gefilterter intrazellulärer Aufzeichnungslösung (120 mM k-Gluconat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA und 0,25% Biocytin aus UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Setzen Sie die gefüllte Mikropipette in den Elektrodenhalter auf der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers ein, um sicherzustellen, dass der Elektrodendraht mit der intrazellulären Lösung in Kontakt steht.
    2. Üben Sie einen positiven Druck durch den Mund aus, indem Sie hart in ein Mundstück blasen (z. B. eine 1-ml-Spritze mit entferntem Kolben), das durch einen Schlauch mit dem seitlichen Anschluss des Elektrodenhalters verbunden ist, und halten Sie den Druck aufrecht, indem Sie ein Inline-Dreiwegeventil schließen. Heben Sie das Mikroskopobjektiv so an, dass sich ein Meniskus bildet, und führen Sie die Elektrode in den Meniskus ein, bis sie auf dem Mikroskop zu sehen ist.
    3. Öffnen Sie das Fenster Seal Test (Dichtungstest ) in WinLTP16 (oder einer anderen Erfassungssoftware/Oszilloskop), und wenden Sie mit dem Verstärker im Spannungsklemmmodus einen 5-mV-Rechteckimpuls an, um festzustellen, ob der Pipettenwiderstand 3-6 MΩ beträgt.
    4. Nähern Sie sich der identifizierten Zelle und berühren Sie sie mit der Pipettenspitze; Dies sollte zu einer Vertiefung in der Zellmembran (Abbildung 3A; rechtes Bild) und einer leichten Erhöhung des Pipettenwiderstands (0,1 MΩ) führen.
    5. Lassen Sie den Überdruck los und üben Sie Unterdruck aus, indem Sie eine moderate Absaugung am Mundstück anwenden. Dies sollte zu einer enormen Erhöhung des Pipettenwiderstands (>1000 MΩ) führen. Der Druck kann nun neutral gelassen werden. Anlegen Sie Unterdruck in einer allmählich zunehmenden Rampe, bis die Zellmembran reißt, was zu Kapazitätstransienten der ganzen Zelle führt.
  3. Zeichnen Sie optogenetisch evozierte synaptische Ereignisse auf.
    1. Geben Sie die Stromzangenkonfiguration ein.
      HINWEIS: In den meisten Fällen ist die synaptische Übertragung über große Entfernungen glutamatergisch, daher wird die Aufzeichnung bei Membranpotentialen nahe dem Chloridumkehrpotential die AMPA-Rezeptor (AMPAR)-vermittelte Übertragung am besten isolieren und die Messung einer evozierten Feed-Forward-Hemmung (FFI) minimieren. Die Chloridumkehr ist abhängig von der Zusammensetzung der intrazellulären Aufzeichnungslösung und aCSF und kann mit der Goldman-Hodgkin-Katz-Gleichung berechnet werden; bei den oben genannten Lösungen betrug dies -61,3 mV. Schicht 5 LEC pyramidale Neuronen hatten ein durchschnittliches Ruhemembranpotential von -62 mV und wurden, wo nötig, durch Injektion von konstantem Strom auf diesem Potential gehalten. Alternativ können Zellen auf das gewünschte Potential gespannt werden. Zur Aufzeichnung von großreichweitigen inhibitorischen Projektionen16 oder zur Aufzeichnung von FFI, Spannungsklemme am Kationenumkehrpotential, um die Leitfähigkeit von GABAergem Chlorid zu isolieren. Wenn spannungsklemmende Neuronen an Membranpotentialen oberhalb der Aktionspotentialschwelle liegen, wird eine cäsiumbasierte intrazelluläre Lösung verwendet, die spannungsgesteuerte Natriumkanalblocker enthält, um die Spannungsklemme zu verbessern und die Initiierung von Aktionspotentialen zu verhindern (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 chlorid,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% Biocytin made in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
    2. Senden Sie mithilfe von Datenerfassungssoftware TTL-Signale (Transistor-Transistor-Logik) an einen LED-Treiber, um eine montierte 470-nm-LED zu aktivieren. Die montierte LED wird mit Filterwürfeln und entsprechender Optik (Abbildung 2B) in den Lichtpfad des Mikroskops gelenkt, um Lichtpulse über das 40x-Objektiv auf die Scheibe aufzubringen, um optogenetische exzitatorische postsynaptische Potentiale (oEPSPs) hervorzurufen.
      HINWEIS: Lichtimpulse können perisomatisch / über die Dendriten angelegt werden, was zur Aktivierung von Opsinen in den Axonen und im präsynaptischen Bouton führt, oder der Forscher kann das Ziel zu Axonen von der aufgezeichneten Zelle wegbewegen, um eine Über-Bouton-Stimulation zu vermeiden (siehe Diskussion). Die maximale oEPSP-Amplitude hängt von der Stärke der synaptischen Projektion, der Wirksamkeit der viralen Injektionen und dem verwendeten Opsin ab. oEPSPs können durch Variation der Lichtintensität und/oder -dauer auf die gewünschte Amplitude titriert werden18; Die Variation der Dauer von Lichtimpulsen (typische Dauer zwischen 0,2-5 ms bei maximaler LED-Ausgangsleistung, was zu 4,4 mW/mm Leuchtdichte19 führt) ergibt konsistentere oEPSP-Amplituden als eine Änderung der Ausgangsleistung der LED.
    3. Untersuchung präsynaptischer Freisetzungseigenschaften (Spannungsänderung) durch Abgabe von Zügen mehrerer Lichtpulse mit unterschiedlichen Interstimulusintervallen (Abbildung 3E); Bei der Interpretation der optogenetisch evozierten Übertragung ist Vorsicht geboten (siehe Diskussion).
    4. Untersuchen Sie die Langzeitplastizität entweder durch wiederholtes Evozieren von oEPSPs19 oder durch Anwendung von Liganden. Überwachen Sie die oEPSP-Amplitude für 5-10 min, um die Stabilität vor der Induktion der Plastizität zu gewährleisten, und überwachen Sie dann, bis eine stabile Amplitude erreicht ist (typischerweise 30-40 min).
      HINWEIS: Die meisten aktuellen Opsine sind nicht in der Lage, zuverlässig mehrere Aktionspotentiale bei hohen Frequenzen hervorzurufen, z. B. 100 Stimuli bei 100 Hz, wie sie typischerweise zur Induktion von LTP verwendet werden.
    5. Um zu bestätigen, dass oEPSPs monosynaptisch sind, führen Sie eine Over-Bouton-Aktivierung des transduzierten Signalwegs durch, indem Sie das Objektiv über dem dendritischen Dorn positionieren und in Gegenwart von 0,5 μM Tetrodotoxin und 100 μM Aminopyridin stimulieren. Die Anwendung von Tetrodotoxin wird die Übertragung aufheben, wenn die Reaktionen aktionspotentialabhängig sind, und die anschließende Einbeziehung von Aminopyridin wird die Übertragung teilweise wiederherstellen, wenn die oEPSPs monosynaptisch erzeugt werden19,20.
    6. Damit Biocytin das Neuron füllen kann, warten Sie mindestens 15 Minuten nach dem Eintritt in die gesamte Zellkonfiguration. In der Spannungsklemme, überwachen Sie die Kapazität der Membran und den Eingangswiderstand.
    7. Ziehen Sie die Pipette langsam entlang des Annäherungswinkels vom Soma der Zelle weg und beobachten Sie das langsame Verschwinden von Kapazitätstransienten und Membranstrom, was auf die Wiederversiegelung der Zellmembran und die Bildung eines von außen nach außen gerichteten Pflasters an der Pipettenspitze hinweist. Notieren Sie sich die Ausrichtung des Segments und die Position der Zelle(n) innerhalb des Slice. Die Scheibe in PFA in eine 24-Well-Platte geben, über Nacht bei 4 °C inkubieren und dann auf 0,1 M PB überführen.
      HINWEIS: Slices können bis zu einer Woche gelagert werden. Wenn eine längere Lagerung erforderlich ist, wechseln Sie die PB regelmäßig oder verwenden Sie PB, das Natriumazid enthält (0,02% -0,2% Natriumazid).

4. Histologie

  1. Slicing-Injektionsstelle
    1. Nach der Fixierung das Gewebe in 30% Saccharose (w/v) in PB kryoschützen, bis es absinkt (es schwimmt zunächst in der Saccharoselösung), normalerweise über Nacht bei Raumtemperatur oder 24-48 h bei 4 °C.
    2. Befestigen Sie einen Gewebeblock mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) an der Kryostatprobenscheibe. Der Gewebeblock wird gemäß den Schritten 4.1.3 bis 4.1.4 eingefroren.
    3. Isopentan in einen geeigneten Behälter geben. Tauchen Sie nur die Probenscheibe ein und stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe über dem Niveau des Isopentans befindet. Senken Sie den Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff (oder Trockeneis) und lassen Sie das Gewebe einfrieren.
    4. Nach dem vollständigen Einfrieren (der gesamte Gewebeblock wird blass und hart) lassen Sie den Gewebeblock 30 Minuten lang bei -20 ° C in der Kryostatkammer, damit die Temperatur des Blocks ausgeglichen werden kann.
    5. 40 μm dicke Abschnitte in den Kryostaten bei -20 °C schneiden. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Abschnitte von der Klinge zu führen. Kleben Sie gefrorene Abschnitte auf einen Raumtemperatur, poly-L-Lysin-beschichteten, glasmikroskopischen Objektträger, indem Sie den Objektträger an den Abschnitten berühren.
    6. Fügen Sie jedem Objektträger etwa 150 μL Montagemedium hinzu und decken Sie es mit einem Deckglas ab. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie vorsichtig auf das Deckglas drücken. Die Objektträger zum Schutz vor Fotobleiche abdecken und mindestens 12 h (oder über Nacht) bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Untersuchen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die Lage der viralen Injektionsstelle.
  2. Biocytin-Färbeprotokoll
    HINWEIS: Dieses Protokoll kann auf dicke Abschnitte angewendet werden. Scheiben müssen nicht neu geschnitten werden.
    1. Waschen Sie die Gehirnscheiben mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4) sechsmal für 10 Minuten pro Waschgang. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Vertiefungen nach jedem Schritt zu entleeren.
    2. Inkubieren Sie die Scheiben in 3%H2O2(w/v) in PBS für 30 min, um jegliche endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Dadurch entstehen Sauerstoffblasen.
    3. Waschen Sie die Gehirnscheiben sechsmal mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang oder bis keine weiteren Sauerstoffblasen sichtbar sind. Die Hirnschnitte in 1% (v/v) Avidin-biotinylierter HRP-Komplex (ABC) Lösung in PBS mit 0,1% (v/v) Triton X-100 bei Raumtemperatur für 3 h inkubieren.
    4. Waschen Sie die Gehirnscheiben sechsmal mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang.
    5. Inkubieren Sie jede Scheibe in 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung für einige Minuten, bis die Biocytinfärbung neuronaler Strukturen sichtbar wird (dauert ca. 5-10 min).
      ACHTUNG: DAB ist giftig. Verwendung in Abzügen.
      HINWEIS: DAB-Inkubationszeiten können unvorhersehbar sein, überwachen Sie das Gewebe genau, während sich die Farbe entwickelt.
    6. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Scheiben in kaltes (4 °C) PBS überführen. Waschen Sie die Gehirnscheiben sechsmal mit PBS für 10 Minuten pro Waschgang. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Gehirnschnitte auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasmikroskop-Objektträger zu montieren.
    7. Entfernen Sie alle überschüssigen PBS mit einem sauberen Tuch. Decken Sie jede Scheibe mit ca. 200 μL Montagemedium ab; Mit Deckgläsern abdecken und vorsichtig auf das Deckglas drücken, um Luftblasen herauszudrücken. An der Luft trocknen bei Raumtemperatur für mindestens 12 h (oder über Nacht). Untersuchen Sie mit einem Lichtmikroskop die Lage und die morphologischen Details der Zelle(n).
      HINWEIS: Biocytin kann alternativ mit fluorophorkonjugiertem Streptavidin sichtbar gemacht werden; Die Bildgebung kann jedoch eine Resektion oder die Verwendung eines konfokalen Mikroskops erfordern21.

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Ergebnisse

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man die synaptische Physiologie und Plastizität mit Hilfe der viralen Verabreichung optogenetischer Konstrukte untersucht. Das Protokoll kann sehr leicht angepasst werden, um fast jede Langstreckenverbindung im Gehirn zu untersuchen. Als Beispiel beschreiben wir die Injektion von AAVs, die ein Opsin in mPFC der Ratte kodieren, die Herstellung von akuten Schnitten aus LEC, Patch-Clamp-Aufnahmen von LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 und die lichtevozierte Aktivierung von mPFC-Ter...

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Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Erforschung hochspezifischer synaptischer Projektionen mit großer Reichweite unter Verwendung einer Kombination aus stereotaktischer Chirurgie, um AAVs zu liefern, die optogenetische Konstrukte kodieren, und Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten (Abbildung 1). Zusammen bieten diese Techniken Werkzeuge, um die Physiologie und Plastizität von Gehirnschaltkreisen mit hoher Präzision in weiträumigen und anatomisch diffusen Bahn...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch das Wellcome-Stipendium 206401/Z/17/Z unterstützt. Wir danken Zafar Bashir für seine fachkundige Betreuung und Dr. Clair Booth für die technische Unterstützung und Kommentare zum Manuskript.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright fluorescence microscopeLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

Referenzen

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