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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Abstract

Studiare le proprietà fisiologiche di specifiche sinapsi nel cervello e come subiscono cambiamenti plastici è una sfida chiave nelle moderne neuroscienze. Le tradizionali tecniche elettrofisiologiche in vitro utilizzano la stimolazione elettrica per evocare la trasmissione sinaptica. Uno dei principali svantaggi di questo metodo è la sua natura non specifica; Tutti gli assoni nella regione dell'elettrodo stimolante saranno attivati, rendendo difficile attribuire un effetto a una particolare connessione afferente. Questo problema può essere superato sostituendo la stimolazione elettrica con la stimolazione basata sull'optogenetica. Descriviamo un metodo per combinare l'optogenetica con registrazioni di patch clamp in vitro . Questo è un potente strumento per lo studio sia della trasmissione sinaptica basale che della plasticità sinaptica di precise connessioni sinaptiche anatomicamente definite ed è applicabile a quasi tutti i percorsi nel cervello. Qui, descriviamo la preparazione e la gestione di un vettore virale che codifica la proteina channelrhodopsin per l'iniezione chirurgica in una regione pre-sinaptica di interesse (corteccia prefrontale mediale) nel cervello dei roditori e la produzione di fette acute di regioni bersaglio a valle (corteccia entorinale laterale). Viene inoltre presentata una procedura dettagliata per combinare le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica a breve e lungo termine. Discutiamo esempi di esperimenti che raggiungono la specificità del percorso e della cellula combinando l'optogenetica e l'etichettatura cellulare Cre-dipendente. Infine, viene descritta la conferma istologica della regione pre-sinaptica di interesse insieme alla marcatura della biocitina della cellula post-sinaptica, per consentire un'ulteriore identificazione della posizione precisa e del tipo di cellula.

Introduzione

Comprendere la fisiologia delle sinapsi e come subiscono cambiamenti plastici è fondamentale per capire come funzionano le reti cerebrali nel cervello sano1 e come funzionano male nei disturbi cerebrali. L'uso di fette cerebrali acute ex vivo consente la registrazione dell'attività elettrica delle sinapsi da singoli neuroni con un elevato rapporto segnale-rumore utilizzando registrazioni patch-clamp a cellule intere. Il controllo del potenziale di membrana e la semplice manipolazione farmacologica consentono l'isolamento dei sottotipi recettoriali. Queste registrazioni possono essere fatte con squisita specificità per identificare il neurone post-sinaptico, compresa la posizione laminare e sub-regionale2, la morfologia cellulare3, la presenza di marcatori molecolari4, le sue proiezioni afferenti5, o anche se era recentemente attivo6.

Raggiungere la specificità degli input pre-sinaptici è, tuttavia, un po 'più impegnativo. Il metodo convenzionale ha utilizzato elettrodi di stimolazione per eccitare gli assoni che corrono in una particolare lamina. Un esempio di questo è nell'ippocampo dove la stimolazione locale nello strato radiato attiva sinapsi che proiettano dal CA3 al sottocampo CA17. In questo caso, la specificità presinaptica è raggiunta in quanto l'input CA3 rappresenta l'unico input eccitatorio situato all'interno dello strato radiato che proietta alle cellule piramidali CA18. Questo elevato grado di specificità di input ottenibile con l'attivazione presinaptica elettrica convenzionale degli assoni CA3-CA1 è, tuttavia, un'eccezione che si riflette nell'intenso studio a cui questa sinapsi è stata soggetta. In altre regioni del cervello, assoni provenienti da più vie afferenti coesistono nella stessa lamina, ad esempio nello strato 1 della neocorteccia9, rendendo così impossibile la stimolazione presinaptica specifica dell'input con elettrodi stimolanti convenzionali. Questo è problematico in quanto diversi input sinaptici possono avere proprietà fisiologiche divergenti; Pertanto, la loro co-stimolazione può portare a un'errata caratterizzazione della fisiologia sinaptica.

L'avvento dell'optogenetica, la codifica genetica delle proteine di membrana fotosensibili (opsine) come la channelrhodopsin-2 (ChR2), ha permesso una vasta espansione delle possibilità di studio delle proiezioni sinaptiche isolate tra le regioni cerebrali10,11. Qui descriviamo una soluzione generalizzabile e a basso costo per studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità. I costrutti optogenetici sono forniti in modo altamente specifico utilizzando vettori virali che consentono un controllo estremamente preciso della regione pre-sinaptica di interesse. Le proiezioni efferenti esprimeranno il canale attivato dalla luce consentendo l'attivazione di queste fibre in una regione target. Pertanto, possono essere studiati percorsi anatomicamente diffusi a lungo raggio che non possono essere attivati in modo indipendente dalla stimolazione elettrica tradizionale, non specifica.

Descriviamo, come percorso esemplificativo, la trasduzione della corteccia prefrontale mediale (mPFC) con virus adeno-associati (AAV) che codificano opsine eccitatorie dei canali cationici. Descriviamo quindi la preparazione di fette acute dalla corteccia entorinale laterale (LEC), registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce delle proiezioni glutammatergiche mPFC-LEC (Figura 1). Descriviamo anche la valutazione istologica del sito di iniezione per confermare la posizione della regione pre-sinaptica di interesse e l'identificazione della morfologia cellulare post-sinaptica.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con lo United Kingdom Animals Scientific Procedures Act (1986) e le linee guida associate, nonché le linee guida istituzionali locali.

1. Iniezione virale stereotassica

NOTA: Il protocollo attuale richiede una specificità anatomica, ma non di tipo cellulare post-sinaptico.

  1. Scegli l'animale appropriato. In questo protocollo sono stati utilizzati ratti incappucciati Lister selvatici maschi (300-350 g, circa 3 mesi).
  2. Scegli il costrutto virale appropriato. Ci sono diversi fattori da considerare (vedi Discussione). L'attuale protocollo utilizza un virus per esprimere il canale optogenetico ChETATC 12, per trasdurre neuroni eccitatori (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; titolo: 3,3 x 10 13 genomi virali/ml).
  3. Stabilire le coordinate e il volume dell'iniezione utilizzando un atlante cerebrale come descritto in precedenza35.
  4. Iniezione stereotassica del preparato virale
    NOTA: Devono essere seguite tutte le linee guida nazionali e istituzionali pertinenti per l'uso e la cura degli animali. I vettori virali vengono iniettati stereotassicamente come descritto in precedenza13 con le seguenti modifiche.
    1. Mantenere la preparazione virale sul ghiaccio durante l'anestetizzazione e la preparazione dell'animale.
    2. Indurre l'anestesia in una camera di induzione anestetica con isoflurano al 4%. Monitorare il livello di anestesia indicato da una frequenza respiratoria regolare più lenta (1 Hz) e dall'assenza di riflessi del pedale e corneali (test pizzicando le dita dei piedi e toccando leggermente l'angolo dell'occhio, rispettivamente; nessuna risposta dovrebbe essere rilevata).
    3. Somministrare analgesici pre-operatori come meloxicam almeno 30 minuti prima della procedura invasiva.
    4. Quando l'animale è completamente anestetizzato, utilizzare le tosatrici per rimuovere la pelliccia dal cuoio capelluto. Commutare il flusso di isoflurano sul cono del naso del telaio stereotassico e montare il ratto nel telaio. Applicare un gel occhi lubrificante sugli occhi per prevenire la secchezza durante la procedura.
    5. L'intervento chirurgico deve essere eseguito in condizioni asettiche. Utilizzare guanti e strumenti sterili durante tutta la procedura. Applicare unguento alla lidocaina (5% p/p) prima di disinfettare il cuoio capelluto con una soluzione di clorexidina al 4% p/v, quindi coprire il corpo con un drappeggio sterile. Usando un bisturi, fare un'incisione longitudinale di circa 15 mm di lunghezza sul cuoio capelluto per esporre il bregma.
    6. Caricare una siringa Hamilton in una pompa a siringa a microiniezione collegata a un braccio mobile montato sul telaio stereotassico.
    7. Porre un'aliquota di 5 μL del virus in una provetta da 0,2 mL e ruotare per alcuni secondi fino a quando tutto il volume è sul fondo della provetta. Pipettare 2 μL del preparato virale nel coperchio del tubo.
    8. Riempire la siringa con il preparato virale visualizzando prima la punta dell'ago con un microscopio chirurgico, quindi posizionare manualmente il bolo del virus sulla punta dell'ago e ritirare lo stantuffo della siringa utilizzando i controlli della pompa.
    9. Impostare il volume di iniezione della pompa su 300 nL e la portata su 100 nL/min. Eseguire la pompa e confermare il flusso corretto osservando la goccia del virus sulla punta dell'ago. Assorbire il virus su un batuffolo di cotone e pulire delicatamente l'ago con etanolo al 70%.
    10. Utilizzando le viti di regolazione sul telaio stereotassico, si sposta la punta dell'ago verso il bregma (il punto sul cranio in cui si incontrano le suture coronale e sagittale) e prendere nota delle misurazioni stereotassiche osservate sulle tre scale di vernier sul telaio. Le coordinate relative al bregma del ratto mPFC sono antero-posteriore + 3,1 mm, mediolaterale ± 0,7 mm, dorsoventrale - 4,5 mm; Aggiungere/sottrarre (come indicato) queste distanze dalle coordinate Bregma, quindi far navigare l'ago verso le coordinate antero-posteriore e mediolaterale e abbassare delicatamente l'ago sulla superficie del cranio.
      NOTA: Le coordinate mPFC sopra riportate sono appropriate per ratti maschi con cappuccio di 300-350 g; cambiamenti nel ceppo di ratto, le dimensioni possono richiedere modifiche a queste coordinate (vedi Discussione).
    11. Sollevare l'ago dalla superficie del cranio e segnare questo punto con un pennarello permanente a punta fine. Fai un foro di bava a questo punto usando un micro trapano montato sul braccio stereotassico.
    12. Inserire l'ago nel cervello alla coordinata dorsoventrale predeterminata e infondere un volume predeterminato (per mPFC: 300 nL). Lasciare l'ago in situ per 10 minuti per consentire la diffusione del bolo. Dopo aver rimosso l'ago, far funzionare la pompa per assicurarsi che l'ago non sia bloccato.
      NOTA: Inserire e rimuovere lentamente l'ago (~3 mm/min) per ridurre al minimo il danno al tessuto cerebrale e il riflusso del virus nel tratto dell'ago.
    13. Somministrare 2,5 ml di soluzione riscaldata di cloruro di sodio (0,9% p/v) e glucosio (5% p/v) per via sottocutanea per mantenere l'idratazione.
    14. Ripetere il passaggio 1.4.12. per il secondo emisfero.
    15. Suturare l'incisione del cuoio capelluto e, al termine della procedura, somministrare 2,5 ml di soluzione di cloruro di sodio e glucosio e un analgesico appropriato, istituzionalmente raccomandato, per la gestione del dolore, ad esempio buprenorfina o meloxicam. Non lasciare l'animale incustodito mentre è incosciente. Metti il ratto in una scatola di recupero riscaldata fino a quando non riprende completamente conoscenza. Tornare alla gabbia di casa con altri animali solo una volta completamente recuperati.
    16. Seguire le linee guida istituzionali per le cure post-operatorie e le procedure abitative per i roditori trasfettati da virus. Attendere almeno 2 settimane affinché il transgene opsina si esprima adeguatamente prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: Il tempo necessario per la trasduzione dipende dalla distanza e dalla forza della connessione tra le regioni pre e post-sinaptiche. Per mPFC a LEC, sono necessarie 4-6 settimane.

2. Preparazione di fette di cervello acute

NOTA: Qui descriviamo un metodo semplice per la preparazione di fette di cervello che nelle nostre mani è sufficiente per ottenere fette corticali, ippocampali e talamiche di alta qualità da topi e ratti adulti.

  1. Preparare le soluzioni per la dissezione.
    1. Riempire un becher da 250 mL con ~200 mL di soluzione di taglio di saccarosio ghiacciato (189 mM di saccarosio, 26 mM di NaHCO 3, 10 mM di D-glucosio, 5 mM di MgSO 4,3 mM di KCl, 1,25 mM di NaH 2 PO4 e 0,2 mM di CaCl 2 in acqua ultrapura (UPW) con resistività di 18,2 MΩ cm a 25 °C) o un volume sufficiente per riempire la camera del tessuto vibratomo. Bollire con carbogeno (95% O 2, 5% CO2) e mantenere in ghiaccio.
    2. Riempire una camera di raccolta delle fette con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glucosio,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH2PO 4 e 1 mM MgSO4 prodotto in UPW) a temperatura ambiente, bollire con carbogeno. La camera di raccolta delle fette14 è realizzata su misura da un rack per tubi di microcentrifuga incollato su un foglio di rete di nylon e posto in un becher in cui è immerso in aCSF (Figura 2A).
    3. Riempire un tubo da 50 mL con paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O e 24,6 mM NaH2PO4. H2O).
      ATTENZIONE: PFA è tossico. Utilizzare in cappa aspirante.
  2. Dissezione del cervello.
    1. Anestetizzare il ratto in una camera di induzione usando isoflurano al 5% fino a quando la respirazione è lenta e regolare (~1 Hz). Per garantire un livello sufficiente di test di anestesia per l'assenza di pedale e riflessi corneali.
    2. Decapitare l'animale usando una ghigliottina.
    3. Sezionare rapidamente l'intero cervello come descritto in precedenza15 e trasferirlo in soluzione di taglio di saccarosio. Completa il passaggio entro 90 secondi dalla decapitazione per una buona qualità della fetta e una corretta registrazione dell'intera cellula.
    4. Usando un cucchiaino di metallo, raccogli il cervello, scarta la soluzione di taglio in eccesso e posizionala su un pezzo di carta da filtro sul banco.
    5. Usando un bisturi o una lama di rasoio, rimuovere rapidamente il cervelletto e tagliare il cervello nel piano coronale circa a metà della sua lunghezza; la metà posteriore è il blocco di tessuto LEC. Assicurati di includere del tessuto in eccesso oltre alla regione da affettare per i passaggi successivi. Restituire sia questo blocco di tessuto che il resto del cervello alla soluzione di taglio di saccarosio.
    6. Posizionare una goccia di colla cianoacrilica su uno stadio di tessuto vibratomo. Stenderlo in uno strato sottile con un'area leggermente più grande del blocco di tessuto creato nel passaggio precedente.
    7. Raccogliere il blocco di tessuto LEC usando un cucchiaino, eliminare la soluzione in eccesso e trasferirlo sul cerotto di colla in modo che il taglio coronale anteriore abbia aderito.
    8. Installare il palco nella camera del tessuto vibratomo e versare rapidamente una quantità sufficiente di soluzione di taglio di saccarosio per immergere il tessuto; Bolle questa soluzione con carbogen. Orientare il blocco di tessuto LEC con la superficie ventrale verso la lama. Mentre l'illuminazione ambientale della stanza è insufficiente per attivare l'opsina, evitare di utilizzare fonti di luce aggiuntive che potrebbero essere presenti sul vibratomo.
    9. Tagliare fette di spessore 350 μm da ventrale a dorsale utilizzando un'elevata velocità di oscillazione della lama (100 Hz) e una velocità di avanzamento lenta della lama (0,06 mm/s). Tipicamente, è possibile ottenere sette fette LEC per emisfero.
    10. Trasferire le fette nella camera di raccolta delle fette. Al termine della raccolta delle fette, trasferire la camera di raccolta a bagnomaria a 34 °C per 1 ora prima di tornare a temperatura ambiente. Bolla con carbogen continuamente. Le fette saranno sufficientemente sane per la registrazione per almeno 6 ore.
    11. Mettere il resto del cervello in PFA per 48 ore per l'esame post-hoc del sito di iniezione (vedere paragrafo 4).

3. Elettrofisiologia e stimolazione optogenetica

  1. Identificazione della cellula bersaglio.
    1. Porre la fetta in una camera di registrazione sommersa a 34 °C perfusa con aCSF ad una velocità di 2 mL/min da una pompa peristaltica. Immobilizzate la fetta utilizzando un ancoraggio di seziona.
    2. Sotto l'obiettivo a basso ingrandimento (4x) di un microscopio a campo largo che utilizza l'illuminazione obliqua a infrarossi, passare allo strato LEC 5. Misurare la distanza dalla superficie pial allo strato richiesto.
      NOTA: L'illuminazione obliqua a infrarossi è stata ottenuta posizionando un LED vicino all'infrarosso a circa 3 mm sotto il coprivetrino della camera di registrazione con un angolo di ~55° rispetto al piano del coprivetrino (Figura 2B). Il contrasto di interferenza differenziale è una tecnica di imaging alternativa e comunemente usata per l'elettrofisiologia delle fette.
    3. Passare a un obiettivo di immersione in acqua ad alto ingrandimento (40x) e identificare i neuroni piramidali. Contrassegnare la posizione della cella sul monitor del computer con del nastro.
      NOTA: I neuroni piramidali hanno una morfologia approssimativamente triangolare con dendriti apicali prominenti che si proiettano verso la superficie piale della fetta (Figura 3A). La salute delle cellule può essere valutata dall'assenza di un nucleo condensato e visibile e dall'ispezione della membrana plasmatica che dovrebbe apparire liscia. È improbabile che una chiara marcatura fluorescente degli assoni da parte della proteina di fusione opsina-fluoroforo sia visibile quando si utilizza un microscopio a fluorescenza a campo largo. Per visualizzare le proiezioni assonali, eseguire l'immunoistochimica post-hoc utilizzando un anticorpo primario contro il fluoroforo dell'opsina e amplificare con un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo della stessa lunghezza d'onda o simile.
  2. Formazione di patch-clamp a cellule intere.
    1. Fabbricare una micropipetta in vetro borosilicato utilizzando un estrattore di pipette e riempire con una soluzione di registrazione intracellulare filtrata (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA e 0,25% biocitina prodotta in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Posizionare la micropipetta riempita nel supporto dell'elettrodo sul frontale dell'amplificatore patch-clamp assicurandosi che il filo dell'elettrodo sia a contatto con la soluzione intracellulare.
    2. Applicare una pressione positiva per bocca soffiando forte in un boccaglio (come una siringa da 1 mL con lo stantuffo rimosso) collegato tramite tubo alla porta laterale del supporto dell'elettrodo e mantenere la pressione chiudendo una valvola a tre vie in linea. Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo tale che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio.
    3. Aprire la finestra Seal Test in WinLTP16 (o altro software di acquisizione/oscilloscopio) e con l'amplificatore in modalità tension-clamp, applicare un impulso quadrato di 5 mV per determinare se la resistenza della pipetta è 3-6 MΩ.
    4. Avvicinarsi e toccare la cella identificata con la punta della pipetta; ciò dovrebbe comportare una rientranza nella membrana cellulare (Figura 3A; pannello di destra) e un piccolo aumento della resistenza delle pipette (0,1 MΩ).
    5. Rilasciare la pressione positiva e applicare una pressione negativa applicando un'aspirazione moderata al boccaglio; ciò dovrebbe comportare un notevole aumento della resistenza delle pipette (>1000 MΩ). La pressione può ora essere lasciata neutra. Applicare una pressione negativa in una rampa gradualmente crescente fino a quando la membrana cellulare non si rompe con conseguente transitori di capacità dell'intera cellula.
  3. Registrare eventi sinaptici evocati optogeneticamente .
    1. Immettere la configurazione del morsetto di corrente.
      NOTA: Nella maggior parte dei casi la trasmissione sinaptica a lungo raggio è glutammatergica, quindi la registrazione a potenziali di membrana vicini al potenziale di inversione del cloruro isolerà al meglio la trasmissione mediata dal recettore AMPA (AMPAR) e ridurrà al minimo la misurazione di qualsiasi inibizione feed-forward (FFI) evocata. L'inversione del cloruro dipende dalla composizione della soluzione di registrazione intracellulare e dell'aCSF e può essere calcolata utilizzando l'equazione di Goldman-Hodgkin-Katz; per le soluzioni di cui sopra, questo era -61,3 mV. I neuroni piramidali LEC di livello 5 avevano un potenziale medio di membrana a riposo di -62 mV e, ove necessario, sono stati mantenuti a questo potenziale mediante iniezione di corrente costante. In alternativa, le celle possono essere bloccate in tensione al potenziale desiderato. Per registrare proiezioni inibitorie a lungo raggio16 o per registrare FFI, tension-clamp al potenziale di inversione cationica per isolare la conduttanza del cloruro GABAergico. Quando i neuroni di bloccaggio della tensione a potenziali di membrana al di sopra della soglia del potenziale d'azione, viene utilizzata una soluzione intracellulare a base di cesio contenente bloccanti dei canali del sodio voltaggio-dipendenti per migliorare il tension-clamp e prevenire l'inizio di potenziali d'azione (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloruro,4 mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% biocitina prodotta in UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
    2. Utilizzando il software di acquisizione dati, inviare segnali TTL (transistor-transistor logic) a un driver LED per attivare un LED da 470 nm montato. Il LED montato viene diretto nel percorso luminoso del microscopio utilizzando cubi filtranti e ottiche appropriate (Figura 2B) per applicare impulsi luminosi alla fetta attraverso l'obiettivo 40x per evocare potenziali post-sinaptici eccitatori optogenetici (oEPSP).
      NOTA: Gli impulsi luminosi possono essere applicati perisomaticamente/sopra i dendriti, il che comporterà l'attivazione delle opsine negli assoni e nel bouton presinaptico, oppure lo sperimentatore può spostare l'obiettivo sugli assoni lontano dalla cellula registrata per evitare la stimolazione eccessiva del bouton (vedi Discussione). L'ampiezza massima dell'EPSP dipende dalla forza della proiezione sinaptica, dall'efficacia delle iniezioni virali e dall'opsina utilizzata. gli EPSP possono essere titolati all'ampiezza desiderata variando l'intensità e/o la durata della luce18; variando la durata degli impulsi luminosi (durata tipica tra 0,2-5 ms alla massima potenza di uscita del LED, che si traduce in una densità luminosa di 4,4 mW/mm19) si ottengono ampiezze oEPSP più coerenti rispetto all'alterazione della potenza di uscita del LED.
    3. Studiare le proprietà di rilascio presinaptico (variazione di tensione) erogando treni di impulsi luminosi multipli con diversi intervalli di inter-stimolo (Figura 3E); Bisogna prestare attenzione nell'interpretare la trasmissione evocata optogeneticamente (vedi Discussione).
    4. Studiare la plasticità a lungo termine evocando ripetutamente gli EPSP19 o l'applicazione di ligandi. Monitorare l'ampiezza dell'EPSP per 5-10 minuti per garantire la stabilità prima dell'induzione della plasticità, quindi monitorare fino a raggiungere un'ampiezza stabile (in genere 30-40 minuti).
      NOTA: La maggior parte delle opsine attuali non sono in grado di evocare in modo affidabile molteplici potenziali d'azione ad alte frequenze, ad esempio 100 stimoli erogati a 100 Hz, come viene tipicamente utilizzato per indurre LTP.
    5. Per confermare che gli oEPSP sono monosinaptici, eseguire l'attivazione over-bouton della via trasdotta posizionando l'obiettivo sopra il pergolato dendritico e stimolando in presenza di 0,5 μM di tetrodotossina e 100 μM di aminopiridina. L'applicazione di tetrodotossina abolirà la trasmissione se le risposte sono dipendenti dal potenziale d'azione e la successiva inclusione di aminopiridina ripristinerà parzialmente la trasmissione se gli oEPSP sono generati monosinapticamente19,20.
    6. Per consentire alla biocitina di riempire il neurone, attendere almeno 15 minuti dopo aver inserito la configurazione dell'intera cellula. In tensione-morsetto, monitorare la capacità della membrana e la resistenza di ingresso.
    7. Prelevare lentamente la pipetta lungo l'angolo di attacco lontano dal soma della cella, osservando la lenta scomparsa dei transitori di capacità e la corrente di membrana che indica la risigillatura della membrana cellulare e la formazione di un cerotto esterno-esterno sulla punta della pipetta. Osservate l'orientamento della sezione e la posizione delle celle all'interno della sezione. Mettere la fetta in PFA in una piastra a 24 pozzetti e incubare per una notte a 4 °C, quindi trasferire a 0,1 M PB.
      NOTA: Le fette possono essere conservate fino a una settimana. Se è necessaria una conservazione più lunga, cambiare regolarmente il PB o utilizzare PB contenente azoturo di sodio (0,02% -0,2% di azoturo di sodio).

4. Istologia

  1. Sito di iniezione di affettatura
    1. Dopo la fissazione, crioproteggere il tessuto in saccarosio al 30% (p/v) in PB fino a quando non affonda (inizialmente galleggerà nella soluzione di saccarosio), di solito durante la notte a temperatura ambiente o 24-48 ore a 4 °C.
    2. Utilizzando il mezzo di temperatura di taglio ottimale (OCT), collegare un blocco di tessuto al disco del campione di criostato. Congelare il blocco di tessuto seguendo i punti da 4.1.3 a 4.1.4.
    3. Mettere l'isopentano in un contenitore appropriato. Immergere solo il disco del campione, assicurandosi che il tessuto sia al di sopra del livello dell'isopentano. Abbassare il contenitore di isopentano in azoto liquido (o ghiaccio secco) e lasciare congelare il tessuto.
    4. Una volta completamente congelato (l'intero blocco di tessuto diventa pallido e duro), lasciare il blocco di tessuto nella camera del criostato a -20 °C per 30 minuti per consentire alla temperatura del blocco di equilibrarsi.
    5. Tagliare sezioni spesse 40 μm nel criostato a -20 °C. Utilizzare un pennello fine per guidare le sezioni dalla lama. Far aderire le sezioni congelate a temperatura ambiente, rivestite di poli-L-lisina, vetrino da microscopio toccando il vetrino alle sezioni.
    6. Aggiungere circa 150 μL di supporto a ciascuna slitta e coprire con un vetrino; Rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente sul vetrino di copertina. Coprire i vetrini per proteggerli dal fotosbiancamento e asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno 12 ore (o durante la notte). Utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare la posizione del sito di iniezione virale.
  2. Protocollo di colorazione della biocitina
    NOTA: questo protocollo può essere applicato a sezioni spesse; Le fette non devono essere risezionate.
    1. Lavare le fette di cervello con soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e 1,8 mM KH2PO4) sei volte per 10 minutiper lavaggio. Utilizzare una pipetta di trasferimento per svuotare i pozzetti dopo ogni passaggio.
    2. Incubare le fette in 3% H 2O2 (w / v) in PBS per 30 minuti per bloccare qualsiasi attività endogena perossidasi. Questo genera bolle di ossigeno.
    3. Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio o fino a quando non sono visibili ulteriori bolle di ossigeno. Incubare le fette di cervello in una soluzione di complesso HRP avidino-biotinilato (ABC) all'1% (v/v) in PBS contenente Triton X-100 allo 0,1% (v/v) a temperatura ambiente per 3 ore.
    4. Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio.
    5. Incubare ogni fetta in soluzione di 3,3′-diaminobenzidina (DAB) per alcuni minuti fino a quando la colorazione biocitina delle strutture neuronali diventa visibile (richiede circa 5-10 minuti).
      ATTENZIONE: DAB è tossico. Utilizzare in cappa aspirante.
      NOTA: i tempi di incubazione del DAB possono essere imprevedibili, monitorare attentamente il tessuto man mano che il colore si sviluppa.
    6. Interrompere la reazione trasferendo le fette a PBS freddo (4 °C). Lavare le fette di cervello con PBS sei volte per 10 minuti per lavaggio. Utilizzare un pennello per montare le fette di cervello su vetrini da microscopio rivestiti di poli-L-lisina.
    7. Rimuovere tutto il PBS in eccesso con un fazzoletto pulito. Coprire ogni fetta con circa 200 μL di mezzo di montaggio; Coprire con dei coprivetrini e premere delicatamente sul coprislip per spingere fuori le bolle d'aria. Asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno 12 ore (o durante la notte). Utilizzando un microscopio ottico, esaminare la posizione e i dettagli morfologici delle cellule.
      NOTA: La biocitina può essere visualizzata in alternativa utilizzando streptavidina coniugata con fluorofori; Tuttavia, l'imaging può richiedere la resezione o l'uso di un microscopio confocale21.

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Risultati

In questo protocollo, descriviamo come studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità utilizzando la consegna virale di costrutti optogenetici. Il protocollo può essere facilmente adattato allo studio di quasi tutte le connessioni a lungo raggio nel cervello. Ad esempio, descriviamo l'iniezione di AAV che codifica un'opsina in mPFC di ratto, la preparazione di fette acute da LEC, registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce dei terminali mPFC in LEC ...

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Discussione

Il protocollo qui presentato descrive un metodo per esplorare proiezioni sinaptiche a lungo raggio altamente specifiche utilizzando una combinazione di chirurgia stereotassica per fornire AAV che codificano costrutti optogenetici ed elettrofisiologia in fette di cervello acute (Figura 1). Insieme, queste tecniche offrono strumenti per caratterizzare la fisiologia e la plasticità dei circuiti cerebrali con alta precisione in percorsi a lungo raggio e anatomicamente diffusi che in precedenza ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione Wellcome 206401/Z/17/Z. Vorremmo ringraziare Zafar Bashir per il suo tutoraggio esperto e il Dr. Clair Booth per l'assistenza tecnica e i commenti sul manoscritto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright fluorescence microscopeLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

Riferimenti

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