Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Resumo

Estudar as propriedades fisiológicas de sinapses específicas no cérebro, e como elas sofrem mudanças plásticas, é um desafio fundamental na neurociência moderna. As técnicas eletrofisiológicas tradicionais in vitro usam estimulação elétrica para evocar a transmissão sináptica. Uma grande desvantagem deste método é a sua natureza inespecífica; todos os axônios na região do eletrodo estimulante serão ativados, dificultando a atribuição de um efeito a uma conexão aferente particular. Este problema pode ser superado substituindo a estimulação elétrica pela estimulação baseada em optogenética. Descrevemos um método para combinar optogenética com registros in vitro patch-praçad. Esta é uma ferramenta poderosa para o estudo da transmissão sináptica basal e da plasticidade sináptica de conexões sinápticas anatomicamente definidas precisas e é aplicável a quase qualquer via no cérebro. Aqui, descrevemos a preparação e o manuseio de um vetor viral que codifica a proteína da canalrodopsina para injeção cirúrgica em uma região pré-sináptica de interesse (córtex pré-frontal medial) no cérebro do roedor e na confecção de fatias agudas de regiões-alvo a jusante (córtex entorrinal lateral). Um procedimento detalhado para combinar registros patch-clamp com ativação sináptica por estimulação luminosa para estudar a plasticidade sináptica de curto e longo prazo também é apresentado. Discutimos exemplos de experimentos que alcançam a especificidade da via e da célula combinando optogenética e marcação celular dependente de Cre. Finalmente, a confirmação histológica da região pré-sináptica de interesse é descrita juntamente com a marcação de biocitina da célula pós-sináptica, para permitir uma identificação mais aprofundada da localização precisa e do tipo de célula.

Introdução

Entender a fisiologia das sinapses e como elas sofrem alterações plásticas é fundamental para entender como as redes cerebrais funcionam no cérebro saudável¹ e como elas funcionam mal em distúrbios cerebrais. O uso de fatias cerebrais ex vivo agudas permite o registro da atividade elétrica das sinapses de neurônios individuais com uma alta relação sinal-ruído usando gravações de patch clamp de células inteiras. O controle do potencial de membrana e a manipulação farmacológica direta permitem o isolamento dos subtipos de receptores. Esses registros podem ser feitos com requintada especificidade para identificar o neurônio pós-sináptico, incluindo posição laminar e sub-regional², morfologia celular³, presença de marcadores moleculares⁴, suas projeções aferentes⁵, ou mesmo se ele estava recentemente ativo⁶.

Alcançar a especificidade das entradas pré-sinápticas é, no entanto, um pouco mais desafiador. O método convencional tem usado eletrodos de estimulação para excitar os axônios que correm em uma lâmina particular. Um exemplo disso é no hipocampo, onde a estimulação local no estrato radiado ativa sinapses que se projetam do subcampo CA3 ao CA1⁷. Neste caso, a especificidade pré-sináptica é alcançada, pois a entrada CA3 representa a única entrada excitatória localizada dentro do estrato radiado que se projeta para células piramidais CA1⁸. Esse alto grau de especificidade de entrada alcançável com a ativação pré-sináptica elétrica convencional dos axônios CA3-CA1 é, no entanto, uma exceção que se reflete no intenso estudo a que essa sinapse tem sido submetida. Em outras regiões do cérebro, axônios de múltiplas vias aferentes coexistem na mesma lâmina, por exemplo, na camada 1 do neocórtex⁹, tornando impossível a estimulação pré-sináptica específica de entrada com eletrodos estimulantes convencionais. Isso é problemático, pois diferentes entradas sinápticas podem ter propriedades fisiológicas divergentes; portanto, sua co-estimulação pode levar à descaracterização da fisiologia sináptica.

O advento da optogenética, codificação genética de proteínas de membrana fotossensíveis (opsinas), como a canalrodopsina-2 (ChR2), tem permitido uma vasta expansão de possibilidades para o estudo de projeções sinápticas isoladas entre regiões cerebrais^10,11. Aqui descrevemos uma solução generalizável e de baixo custo para estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade. Os construtos optogenéticos são entregues de maneira altamente específica usando vetores virais, permitindo um controle extremamente preciso da região pré-sináptica de interesse. Projeções eferentes expressarão o canal ativado pela luz, permitindo a ativação dessas fibras em uma região alvo. Assim, vias anatomicamente difusas de longo alcance que não podem ser ativadas independentemente pela estimulação elétrica tradicional e inespecífica podem ser estudadas.

Descrevemos, como um exemplo de via, a transdução do córtex pré-frontal medial (mPFC) com vírus adenoassociados (AAVs) que codificam opsinas excitatórias de canal catiônico. Em seguida, descrevemos o preparo de cortes agudos do córtex entorrinal lateral (LEC), registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC da camada 5 e ativação evocada por luz de projeções glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). Também descrevemos a avaliação histológica do local da injeção para confirmar a localização da região pré-sináptica de interesse e identificação da morfologia celular pós-sináptica.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram conduzidos de acordo com a Lei de Procedimentos Científicos de Animais do Reino Unido (1986) e diretrizes associadas, bem como diretrizes institucionais locais.

1. Injeção viral estereotáxica

NOTA: O protocolo atual requer especificidade anatômica, mas não do tipo de célula pós-sináptica.

1. Escolha o animal apropriado. Ratos machos do tipo selvagem Lister com capuz foram utilizados neste protocolo (300-350 g, aproximadamente 3 meses de idade).
2. Escolha a construção viral apropriada. Há vários fatores a serem considerados (consulte Discussão). O protocolo atual utiliza um vírus para expressar o canal optogenético ChETA_TC 12, para transduzir neurônios excitatórios (AAV9 - CaMKIIa - ^ChR2(E123T/T159C) - mCherry; título: 3,3 x 10¹³ genomas virais/mL).
3. Estabelecer as coordenadas e o volume de injeção usando um atlas cerebral, conforme descrito anteriormente³⁵.
4. Injeção estereotáxica da preparação viral
   NOTA: Todas as diretrizes nacionais e institucionais relevantes para o uso e cuidado de animais devem ser seguidas. Os vetores virais são injetados estereotaxicamente como descrito anteriormente¹³ com as seguintes modificações.
   1. Mantenha a preparação viral no gelo durante a anestesiação e preparação do animal.
   2. Induzir anestesia em câmara de indução anestésica com isoflurano a 4%. Monitore o nível de anestesia indicado pela frequência respiratória regular mais lenta (1 Hz) e ausência de reflexos pedais e corneanos (teste apertando os dedos dos pés e tocando levemente o canto do olho, respectivamente; nenhuma resposta deve ser detectada).
   3. Administrar analgésico pré-operatório, como meloxicam, pelo menos 30 minutos antes do procedimento invasivo.
   4. Quando o animal estiver totalmente anestesiado, use cortadores para remover a pele do couro cabeludo. Alterne o fluxo de isoflurano para o cone do nariz do quadro estereotáxico e monte o rato no quadro. Aplique gel lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento.
   5. A cirurgia deve ser realizada em condições assépticas. Use luvas e instrumentos estéreis durante todo o procedimento. Aplique pomada de lidocaína (5% p/p) antes de desinfetar o couro cabeludo com solução de clorexidina a 4% p/v e, em seguida, cubra o corpo com uma cortina estéril. Usando um bisturi, faça uma incisão longitudinal de aproximadamente 15 mm de comprimento no couro cabeludo para expor o bregma.
   6. Carregue uma seringa Hamilton numa bomba de seringa de microinjeção ligada a um braço móvel montado na estrutura estereotáxica.
   7. Coloque uma alíquota de 5 μL do vírus em um tubo de 0,2 mL e gire por alguns segundos até que todo o volume esteja no fundo do tubo. Pipeta 2 μL da preparação viral para a tampa do tubo.
   8. Encha a seringa com a preparação viral, primeiro visualizando a ponta da agulha com um microscópio cirúrgico e, em seguida, coloque manualmente o bolo do vírus na ponta da agulha e retire o êmbolo da seringa usando os controles da bomba.
   9. Ajuste o volume de injeção da bomba para 300 nL e a vazão para 100 nL/min. Execute a bomba e confirme o fluxo adequado observando a gota do vírus na ponta da agulha. Absorva o vírus em um cotonete e limpe suavemente a agulha com etanol a 70%.
   10. Usando os parafusos ajustadores no quadro estereotáxico, navegue pela ponta da agulha até o bregma (o ponto no crânio onde as suturas coronal e sagital se encontram) e tome nota das medidas estereotáxicas observadas nas três escalas vernier no quadro. As coordenadas relativas ao bregma do mPFC de rato são anteroposterior + 3,1 mm, mediolateral ± 0,7 mm, dorsoventral - 4,5 mm; adicione/subtraia (conforme indicado) essas distâncias das coordenadas do bregma e, em seguida, navegue pela agulha até as coordenadas anteroposterior e mediolateral e abaixe suavemente a agulha na superfície do crânio.
       NOTA: As coordenadas mPFC dadas acima são apropriadas para ratos machos encapuzados de 300-350 g; alterações na estirpe do rato, o tamanho pode exigir alterações a estas coordenadas (ver Discussão).
   11. Levante a agulha da superfície do crânio e marque este ponto com uma caneta de marcador permanente de ponta fina. Faça um furo de rebarba neste ponto usando uma micro broca montada no braço estereotáxico.
   12. Insira a agulha no cérebro na coordenada dorsoventral pré-determinada e infunda um volume pré-determinado (para mPFC: 300 nL). Deixe a agulha no local por 10 minutos para permitir a difusão do bolo. Após a remoção da agulha, execute a bomba para garantir que a agulha não esteja bloqueada.
       NOTA: Insira e remova a agulha lentamente (~ 3 mm / min) para minimizar os danos ao tecido cerebral e o refluxo do vírus para o trato da agulha.
   13. Administrar 2,5 mL de cloreto de sódio aquecido (0,9% p/v) e solução de glicose (5% p/v) por via subcutânea para manter a hidratação.
   14. Repita a etapa 1.4.12. para o segundo hemisfério.
   15. Suture a incisão do couro cabeludo e, após a conclusão do procedimento, administre 2,5 mL de solução de cloreto de sódio e glicose e um analgésico apropriado, institucionalmente recomendado, para o controle da dor, por exemplo, buprenorfina ou meloxicam. Não deixe o animal sozinho enquanto estiver inconsciente. Coloque o rato em uma caixa de recuperação aquecida até que ele recupere totalmente a consciência. Só retorne à gaiola de origem com outros animais uma vez totalmente recuperados.
   16. Siga as diretrizes institucionais para cuidados pós-operatórios e procedimentos de alojamento para roedores transfectados viralmente. Aguarde pelo menos 2 semanas para que o transgene de opsina se expresse adequadamente antes de iniciar o experimento.
       NOTA: O tempo necessário para a transdução depende da distância e da força da conexão entre as regiões pré e pós-sináptica. Para mPFC a LEC, são necessárias 4-6 semanas.

2. Preparação de fatias cerebrais agudas

NOTA: Aqui descrevemos um método simples para a preparação de fatias cerebrais que, em nossas mãos, é suficiente para alcançar fatias corticais, hipocampais e talâmicas de alta qualidade de camundongos e ratos adultos.

1. Prepare as soluções para dissecação.
   1. Encha um copo de 250 mL com ~200 mL de solução de corte de sacarose gelada (sacarose de 189 mM, NaHCO₃ de 26 mM, D-glicose de 10 mM, MgSO 4 de 5 mM, KCl de 3 mM, NaH 2 PO₄ de 1,25 mM e CaCl 2 de_0,2mM feita em água ultrapura (UPW) com resistividade de 18,2 MΩ cm a 25 °C) ou um volume suficiente para encher a câmara de tecido vibratomo. Bolha com carbogênio (95% O 2, 5% CO₂) e mantenha no gelo.
   2. Encha uma câmara de coleta de fatias com líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glicose,₃ mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1,25 mM NaH₂ PO 4 e 1 mM MgSO₄ feito em UPW) à temperatura ambiente, borbulhado com carbogênio. A câmara de coleta de fatias¹⁴ é feita sob medida a partir de um rack de tubo de microcentrífuga colado em uma folha de malha de nylon e colocado em um copo no qual está submerso em aCSF (Figura 2A).
   3. Encher um tubo de 50 mL com paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão fosfato (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O e 24,6 mM NaH₂PO₄. H₂O).
      CUIDADO: O PFA é tóxico. Use em exaustor.
2. Dissecção do cérebro.
   1. Anestesiar o rato em uma câmara de indução usando isoflurano a 5% até que a respiração seja lenta e regular (~1 Hz). Para garantir um nível suficiente de teste de anestesia para a ausência de reflexos pedais e corneanos.
   2. Decapitar o animal usando uma guilhotina.
   3. Dissecar rapidamente todo o cérebro como descrito anteriormente¹⁵ e transferir para a solução de corte de sacarose. Complete a etapa dentro de 90 s de decapitação para uma boa qualidade de fatia e gravação bem-sucedida de células inteiras.
   4. Usando uma colher de chá de metal, pegue o cérebro, descarte o excesso de solução de corte e coloque-o em um pedaço de papel de filtro na bancada.
   5. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, remova rapidamente o cerebelo e corte o cérebro no plano coronal aproximadamente na metade do seu comprimento; a metade posterior é o bloqueio tecidual LEC. Certifique-se de incluir algum excesso de tecido, além da região a ser cortada para os próximos passos. Devolva este bloco de tecido e o restante do cérebro para a solução de corte de sacarose.
   6. Coloque uma gota de cola de cianoacrilato em um estágio de tecido vibratome. Espalhe-o em uma camada fina com uma área ligeiramente maior do que o bloco de tecido criado na etapa anterior.
   7. Pegue o bloco de tecido LEC usando uma colher de chá, descarte o excesso de solução e transfira para o adesivo de tal forma que o corte coronal anterior tenha aderido.
   8. Instale o estágio na câmara de tecido vibratório e despeje rapidamente uma quantidade suficiente de solução de corte de sacarose para submergir o tecido; borbulhar esta solução com carbogênio. Oriente o bloco de tecido LEC com a superfície ventral em direção à lâmina. Embora a iluminação ambiente da sala seja insuficiente para ativar a opsina, evite usar fontes de luz adicionais que possam estar presentes no vibratome.
   9. Corte fatias de 350 μm de espessura ventral para dorsal usando uma alta velocidade de oscilação da lâmina (100 Hz) e uma velocidade de avanço lenta da lâmina (0,06 mm/s). Normalmente, sete fatias LEC podem ser obtidas por hemisfério.
   10. Transfira as fatias para a câmara de coleta de fatias. Após a conclusão da recolha de fatias, transferir a câmara de recolha para um banho-maria de 34 °C durante 1 h antes de regressar à temperatura ambiente. Bolha com carbogênio continuamente. As fatias serão suficientemente saudáveis para gravação por pelo menos 6 h.
   11. Coloque o restante do cérebro em PFA durante 48 h para exame post-hoc do local de injeção (ver secção 4).

3. Eletrofisiologia e estimulação optogenética

1. Identificação da célula de destino.
   1. Colocar a fatia numa câmara de registo submersa a 34 °C perfundida com um LCR a uma velocidade de 2 ml/min por uma bomba peristáltica. Imobilize a fatia usando uma âncora de fatia.
   2. Sob a objetiva de baixa ampliação (4x) de um microscópio de campo largo usando iluminação infravermelha oblíqua, navegue até a camada LEC 5. Meça a distância da superfície pial até a camada necessária.
      NOTA: A iluminação infravermelha oblíqua foi obtida posicionando um LED infravermelho próximo aproximadamente 3 mm abaixo da tampa da câmara de gravação em um ângulo de ~55° em relação ao plano da tampa (Figura 2B). O contraste de interferência diferencial é uma técnica de imagem alternativa e comumente usada para eletrofisiologia de fatias.
   3. Mude para um objetivo de imersão em água de alta ampliação (40x) e identifique neurônios piramidais. Marque a posição da célula no monitor do computador com fita adesiva.
      NOTA: Os neurônios piramidais têm uma morfologia aproximadamente triangular com dendritos apicais proeminentes projetando-se em direção à superfície pial do corte (Figura 3A). A saúde celular pode ser avaliada pela ausência de um núcleo condensado e visível e pela inspeção da membrana plasmática, que deve parecer suave. É improvável que a marcação fluorescente clara dos axônios pela proteína de fusão opsina-fluoróforo seja visível ao usar um microscópio de fluorescência de campo amplo. Para visualizar as projeções axonais, realizar imuno-histoquímica post-hoc usando um anticorpo primário contra o fluoróforo da opsina e amplificar com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo do mesmo comprimento de onda ou similar.
2. Formação de patch-clamp de células inteiras.
   1. Fabricar uma micropipeta de vidro borossilicato usando um extrator de pipeta e encher com solução de gravação intracelular filtrada (120 mM k-gluconato, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA e 0,25% de biocitina feita em UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque a micropipeta cheia no suporte do eletrodo no headstage do amplificador patch-clamp, garantindo que o fio do eletrodo esteja em contato com a solução intracelular.
   2. Aplique pressão positiva por via oral soprando com força em um bocal (como uma seringa de 1 mL com o êmbolo removido) conectado por tubulação à porta lateral do suporte do eletrodo e mantenha a pressão fechando uma válvula de três vias em linha. Levante a objetiva do microscópio de tal forma que um menisco se forme e insira o eletrodo no menisco até que ele possa ser visto no microscópio.
   3. Abra a janela Teste de vedação no WinLTP¹⁶ (ou outro software/osciloscópio de aquisição) e, com o amplificador no modo tensão-braçadeira, aplique um pulso quadrado de 5 mV para determinar se a resistência da pipeta é de 3-6 MΩ.
   4. Aproxime-se e toque na célula identificada com a ponta da pipeta; isso deve resultar em um recuo na membrana celular (Figura 3A; painel direito) e um pequeno aumento na resistência da pipeta (0,1 MΩ).
   5. Liberar pressão positiva e aplicar pressão negativa aplicando sucção moderada no bocal; isso deve resultar em um grande aumento na resistência da pipeta (>1000 MΩ). A pressão agora pode ser deixada neutra. Aplique pressão negativa em uma rampa gradualmente crescente até que a membrana celular se rompa, resultando em transientes de capacitância de célula inteira.
3. Registrar eventos sinápticos optogeneticamente evocados.
   1. Insira a configuração de grampo atual.
      NOTA: Na maioria dos casos, a transmissão sináptica de longo alcance é glutamatérgica, portanto, o registro em potenciais de membrana próximos ao potencial de reversão de cloreto isolará melhor a transmissão mediada pelo receptor AMPA (AMPAR) e minimizará a medição de qualquer inibição de feed-forward (FFI) evocada. A reversão de cloreto depende da composição da solução de registro intracelular e do aCSF e pode ser calculada usando a equação de Goldman-Hodgkin-Katz; para as soluções acima, foi de -61,3 mV. Os neurônios piramidais LEC da camada 5 tinham um potencial médio de membrana em repouso de -62 mV e, quando necessário, eram mantidos nesse potencial por injeção de corrente constante. Alternativamente, as células podem ser presas à tensão ao potencial desejado. Para registrar projeções inibitórias de longo alcance¹⁶ ou para registrar FFI, pinça de tensão no potencial de reversão de cátions para isolar a condutância de cloreto GABAérgico. Quando os neurônios de pinçamento de voltagem em potenciais de membrana acima do limiar do potencial de ação, uma solução intracelular à base de césio contendo bloqueadores de canal de sódio dependentes de voltagem é usada para melhorar a pinça de voltagem e prevenir o início de potenciais de ação (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 cloreto,₄ mM MgATP, 0,5 mM EGTA, 0,3 mM NaGTP, 0,25% de biocitina feita em UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Usando o software de aquisição de dados, envie sinais lógicos de transistor-transistor (TTL) para um driver de LED para ativar um LED montado de 470 nm. O LED montado é direcionado para o caminho da luz do microscópio usando cubos de filtro e óptica apropriada (Figura 2B) para aplicar pulsos de luz à fatia através da objetiva de 40x para evocar potenciais pós-sinápticos excitatórios optogenéticos (oEPSPs).
      NOTA: Os pulsos de luz podem ser aplicados perisomaticamente / sobre os dendritos, o que resultará na ativação de opsinas nos axônios e no bouton pré-sináptico, ou o investigador pode mover o objetivo para os axônios para longe da célula registrada para evitar a estimulação excessiva de bouton (ver Discussão). A amplitude máxima da oEPSP depende da força da projeção sináptica, da eficácia das injeções virais e da opsina utilizada. As oEPSPs podem ser tituladas para a amplitude desejada variando a intensidade e/ou duração da luz¹⁸; variar a duração dos pulsos de luz (duração típica entre 0,2-5 ms na potência máxima do LED, o que resulta em densidade de luz de 4,4 mW/mm¹⁹) fornece amplitudes de oEPSP mais consistentes do que alterar a saída de potência do LED.
   3. Investigar as propriedades de liberação pré-sináptica (mudança de tensão) fornecendo trens de múltiplos pulsos de luz com diferentes intervalos interestímulos (Figura 3E); deve-se ter cuidado ao interpretar a transmissão optogeneticamente evocada (ver Discussão).
   4. Investigar a plasticidade a longo prazo, evocando repetidamente oEPSPs¹⁹ ou a aplicação de ligantes. Monitore a amplitude da oEPSP por 5-10 min para garantir a estabilidade antes da indução da plasticidade e, em seguida, monitore até que uma amplitude estável seja atingida (tipicamente 30-40 min).
      NOTA: A maioria das opsinas atuais não é capaz de evocar de forma confiável múltiplos potenciais de ação em altas frequências, por exemplo, 100 estímulos entregues a 100 Hz, como é tipicamente usado para induzir LTP.
   5. Para confirmar que as oEPSPs são monossinápticas, realize a ativação sobre-bouton da via transduzida posicionando a objetiva sobre o mandril dendrítico e estimulando na presença de tetrodotoxina 0,5 μM e aminopiridina 100 μM. A aplicação de tetrodotoxina abolirá a transmissão se as respostas forem dependentes do potencial de ação e a subsequente inclusão da aminopiridina restaurará parcialmente a transmissão se as oEPSPs forem geradas monossinapticamente^19,20.
   6. Para permitir que a biocitina preencha o neurônio, aguarde pelo menos 15 minutos depois de entrar na configuração de células inteiras. Na braçadeira de tensão, monitore a capacitância da membrana e a resistência de entrada.
   7. Retire lentamente a pipeta ao longo do ângulo de aproximação para longe do soma da célula, observando o lento desaparecimento dos transientes de capacitância e da corrente de membrana, indicando a re-vedação da membrana celular e a formação de um remendo externo na ponta da pipeta. Observe a orientação da fatia e a localização da(s) célula(s) dentro da fatia. Colocar a fatia em PFA numa placa de 24 poços e incubar durante a noite a 4 °C e, em seguida, transferir para 0,1 M PB.
      NOTA: As fatias podem ser armazenadas por até uma semana. Se for necessário um armazenamento mais longo, troque o PB regularmente ou use PB contendo azida de sódio (0,02%-0,2% de azida de sódio).

4. Histologia

1. Local de injeção de fatiamento
   1. Após a fixação, crioproteger o tecido em sacarose a 30% (p/v) em PB até afundar (inicialmente flutuará na solução de sacarose), geralmente durante a noite à temperatura ambiente ou 24-48 h a 4 °C.
   2. Usando o meio de temperatura de corte ideal (OCT), prenda um bloco de tecido ao disco da amostra de criostato. Congelar o bloco de tecidos seguindo os passos 4.1.3 a 4.1.4.
   3. Coloque isopentano em um recipiente apropriado. Submerja apenas o disco da amostra, garantindo que o tecido esteja acima do nível do isopentano. Abaixe o recipiente de isopentano em nitrogênio líquido (ou gelo seco) e deixe o tecido congelar.
   4. Uma vez completamente congelado (todo o bloco de tecido torna-se pálido e duro), deixe o bloco de tecido na câmara de criostato a -20 °C durante 30 minutos para permitir que a temperatura do bloco se equilibre.
   5. Cortar secções de 40 μm de espessura no criostato a -20 °C. Use um pincel fino para guiar as seções para fora da lâmina. Aderir seções congeladas a uma temperatura ambiente, poli-L-lisina revestida, lâmina de microscópio de vidro, tocando a lâmina para as seções.
   6. Adicionar cerca de 150 μL de meio de montagem a cada lâmina e cobrir com uma folha de cobertura; remova quaisquer bolhas de ar pressionando suavemente a tampa. Cubra as lâminas para proteger contra o fotobranqueamento e seque ao ar livre à temperatura ambiente por pelo menos 12 h (ou durante a noite). Usando um microscópio de fluorescência, examine a localização do local da injeção viral.
2. Protocolo de coloração de biocitotina
   NOTA: Este protocolo pode ser aplicado a seções espessas; as fatias não precisam ser resseccionadas.
   1. Lave as fatias cerebrais com solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO4 e 1,8 mM KH₂PO₄) seis vezes por 10 minutos por lavagem. Use uma pipeta de transferência para esvaziar os poços após cada etapa.
   2. Incubar os cortes em 3% H 2 O₂(p/v) em PBS por 30 min para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase. Isso gera bolhas de oxigênio.
   3. Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem ou até que não haja mais bolhas de oxigênio visíveis. Incubar as fatias cerebrais em solução de complexo HRP (ABC) avidina-biotinilada a 1% em PBS contendo Triton X-100 a 0,1% (v/v) à temperatura ambiente por 3 h.
   4. Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem.
   5. Incubar cada fatia em solução de 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) por vários minutos até que a coloração de biocitina das estruturas neuronais se torne visível (leva cerca de 5-10 min).
      CUIDADO: DAB é tóxico. Use em exaustor.
      NOTA: Os tempos de incubação do DAB podem ser imprevisíveis, monitore o tecido de perto à medida que a cor se desenvolve.
   6. Parar a reacção transferindo as fatias para PBS frio (4 °C). Lave as fatias cerebrais com PBS seis vezes por 10 minutos por lavagem. Use uma escova para montar as fatias cerebrais em lâminas de microscópio de vidro revestidas com poli-L-lisina.
   7. Remova todo o excesso de PBS com um tecido limpo. Cubra cada fatia com cerca de 200 μL de meio de montagem; cubra com folhas de cobertura e pressione suavemente a tampa para empurrar as bolhas de ar. Seque ao ar livre à temperatura ambiente por pelo menos 12 h (ou durante a noite). Usando um microscópio de luz, examine a localização e os detalhes morfológicos da(s) célula(s).
      NOTA: A biocitina pode alternativamente ser visualizada usando estreptavidina conjugada com fluoróforo; no entanto, a imagem pode exigir ressecção ou o uso de microscópio confocal²¹.

Resultados

Neste protocolo, descrevemos como estudar a fisiologia sináptica de longo alcance e a plasticidade usando a entrega viral de construtos optogenéticos. O protocolo pode ser muito facilmente adaptado para estudar quase qualquer conexão de longo alcance no cérebro. Como exemplo, descrevemos a injeção de AAVs codificando uma opsina em mPFC de ratos, a preparação de fatias agudas de LEC, registros de patch-clamp de neurônios piramidais LEC de camada 5 e ativação evocada por luz de terminais mPFC em LEC (

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve um método para explorar projeções sinápticas de longo alcance altamente específicas usando uma combinação de cirurgia estereotáxica para fornecer AAVs codificando construções optogenéticas e eletrofisiologia em cortes cerebrais agudos (Figura 1). Juntas, essas técnicas oferecem ferramentas para caracterizar a fisiologia e a plasticidade dos circuitos cerebrais com alta precisão em vias de longo alcance e anatomicamente difusas que antes eram...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tube	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 µL pipette	Gilson	FD10001
24 well plate	SARSTEDT	83.3922
3 way luer valve	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate	Vector Laboratories	SK-4105
40x objective	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine	Hello Bio	HB1073
4x objective	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lens	Edmund Optics	49363	Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1005*
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Borosillicate glass capillary	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Fine science tools	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Camera - Qimaging Retiga Electro	Photometrics	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Chlorhexidine surgical scrub	Vetasept	XHG008
Clippers	Andis	22445	AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens	ThorLabs	ACL2520-A
Coverslips	Fisher Scientific Ltd	10011913
Cryostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Cyanoacrylate glue	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Data acquisition device	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass	Edmund Optics	69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass	Edmund Optics	69901
Dichroic mirror cube	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Electrode holder with side port	HEKA	895150
Emission filter	Chroma	59022m
Excitation filter	Chroma	ET570/20x
Eye gel	Dechra	Lubrithal
Fine paint brush	Scientific Laboratory Supplies	BRU2052
Guillotine	World Precision Instruments	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	30% (w/w)
Isoflurane	Henry Schein	988-3245
Isopentane	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematic fluorescence filter cube	ThorLabs	DFM1T1
LED driver	ThorLabs	LEDD1B
Lidocaine ointment	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Micro drill	Harvard Apparatus	75-1887
Microelectrode puller	Sutter instruments	P-87
Microinjection syringe	Hamilton	7634-01/00
Microinjection syringe needle	Hamilton	7803-05	Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	UMP3T-1
Mounted blue LED	ThorLabs	M470L5
Mounted green LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM	SFH4550	Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium	VWR International	RAYLLAMB/OCT	Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	700A
Peristaltic pump	World Precision Instruments	Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Scalpel blade	Swann Morton	#24
Slice anchor	Warner Instruments	SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame	Kopf	Model 902
Stereotaxic holder for micro drill	Harvard Apparatus	75-1874
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Surgical Microscope	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Suture	Ethicon	W577H
Syringe filter for intracellular recording solution	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoxin citrate	Hello Bio	HB1035
Transfer pipettes	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Upright fluorescence microscope	Leica	DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit	Vector Laboratories	PK-4000
Vibratome	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	Version 2.32	Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?