JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

Abstract

חקר התכונות הפיזיולוגיות של סינפסות מסוימות במוח, וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים, הוא אתגר מרכזי במדעי המוח המודרניים. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות במבחנה משתמשות בגירוי חשמלי כדי לעורר תמסורת סינפטית. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא האופי הלא ספציפי שלה; כל האקסונים באזור האלקטרודה המגרה יופעלו, מה שמקשה על ייחוס אפקט לחיבור אפרנטי מסוים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי החלפת גירוי חשמלי בגירוי מבוסס אופטוגנטיקה. אנו מתארים שיטה לשילוב אופטוגנטיקה עם הקלטות מהדקי טלאים במבחנה . זהו כלי רב עוצמה לחקר ההעברה הסינפטית הבסיסית והפלסטיות הסינפטית של קשרים סינפטיים מדויקים המוגדרים אנטומית, והוא ישים כמעט לכל מסלול במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והטיפול בווקטור נגיפי המקודד חלבון channelrhodopsin להזרקה כירורגית לאזור טרום-סינפטי בעל עניין (קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית) במוח המכרסם ויצירת פרוסות חריפות של אזורי מטרה במורד הזרם (קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית). כמו כן מוצג הליך מפורט לשילוב הקלטות מהדקי טלאים עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית לטווח קצר וארוך. אנו דנים בדוגמאות לניסויים שמשיגים ספציפיות של מסלולים ותאים על ידי שילוב של אופטוגנטיקה ותיוג תאים תלויי Cre. לבסוף, אישור היסטולוגי של האזור הקדם-סינפטי של העניין מתואר יחד עם תיוג ביוציטין של התא הפוסט-סינפטי, כדי לאפשר זיהוי נוסף של המיקום המדויק וסוג התא.

Introduction

הבנת הפיזיולוגיה של הסינפסות וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים היא בסיסית להבנת האופן שבו רשתות מוחיות מתפקדות במוח בריא1, וכיצד הן מתפקדות בהפרעות מוחיות. השימוש בפרוסות מוח חריפות של ex vivo מאפשר הקלטה של הפעילות החשמלית של סינפסות מנוירונים בודדים עם יחס אות לרעש גבוה באמצעות הקלטות של מהדק טלאי שלם. שליטה בפוטנציאל הממברנה ומניפולציה פרמקולוגית פשוטה מאפשרת בידוד של תת-סוגים של קולטנים. ניתן לבצע הקלטות אלה בספציפיות מעודנת כדי לזהות את הנוירון הפוסט-סינפטי, כולל מיקום למינרי ותת-אזורי2, מורפולוגיה תאית3, נוכחות של סמנים מולקולריים4, התחזיות האפקטיביות שלו5, או אפילו אם הוא היה פעיל לאחרונה6.

עם זאת, השגת ספציפיות של תשומות קדם-סינפטיות היא, עם זאת, קצת יותר מאתגרת. השיטה הקונבנציונלית השתמשה באלקטרודות גירוי כדי לעורר את האקסונים הפועלים בלמינה מסוימת. דוגמה לכך היא בהיפוקמפוס, שם גירוי מקומי בשכבה רדיאטום מפעיל סינפסות שמקרינות מ-CA3 לתת-השדה CA17. במקרה זה, הספציפיות הקדם-סינפטית מושגת כאשר קלט CA3 מייצג את הקלט המעורר היחיד הממוקם בתוך רדיאטום שכבה אשר מקרין לתאים פירמידליים CA18. רמה גבוהה זו של ספציפיות קלט הניתנת להשגה עם הפעלה קדם-סינפטית חשמלית קונבנציונלית של אקסונים CA3-CA1 היא, עם זאת, יוצא מן הכלל אשר בא לידי ביטוי במחקר אינטנסיבי כי סינפסה זו היה נתון. באזורים אחרים במוח, אקסונים ממסלולים רבים מתקיימים יחד באותה למינה, לדוגמה, בשכבה 1 של ניאוקורטקס9, ובכך הופכים גירוי קדם-סינפטי ספציפי לקלט לבלתי אפשרי עם אלקטרודות מגרה קונבנציונליות. זה בעייתי מכיוון שלקלטים סינפטיים שונים עשויות להיות תכונות פיזיולוגיות שונות; לכן, הגירוי המשותף שלהם עלול להוביל לאפיון שגוי של הפיזיולוגיה הסינפטית.

הופעתה של האופטוגנטיקה, הקידוד הגנטי של חלבוני ממברנה רגישים לאור (אופסינים) כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), אפשרה הרחבה עצומה של אפשרויות לחקר תחזיות סינפטיות מבודדות בין אזורי מוח10,11. כאן אנו מתארים פתרון הניתן להכללה ובעלות נמוכה לחקר פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות. המבנים האופטוגנטיים מועברים באופן ספציפי מאוד באמצעות וקטורים נגיפיים המאפשרים שליטה מדויקת ביותר באזור העניין הקדם-סינפטי. הקרנות אפרנט יבטאו את הערוץ המופעל על ידי האור ויאפשרו הפעלה של סיבים אלה באזור מטרה. לפיכך, ניתן לחקור מסלולים ארוכי טווח, מפוזרים אנטומית, שלא ניתן להפעילם באופן עצמאי על ידי גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי.

אנו מתארים, כמסלול לדוגמה, התמרה של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) עם וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) המקודדים אופסינים של תעלת קטיון מעוררת. לאחר מכן אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חריפות מקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC), הקלטות של מהדקי טלאי מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של תחזיות mPFC-LEC גלוטמטרגיות (איור 1). אנו מתארים גם את ההערכה ההיסטולוגית של אתר ההזרקה כדי לאשר את המיקום של האזור הקדם-סינפטי של עניין וזיהוי של מורפולוגיה של תאים פוסט-סינפטיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים לבעלי חיים נערכו בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי חיים בבריטניה (1986) וההנחיות הקשורות אליו, כמו גם הנחיות מוסדיות מקומיות.

1. הזרקה ויראלית סטריאוטקסית

הערה: הפרוטוקול הנוכחי דורש ספציפיות אנטומית, אך לא פוסט-סינפטית.

  1. בחר את החיה המתאימה. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בחולדות זכרים מסוג ליסטר עם ברדס (300-350 גרם, כ-3 חודשים).
  2. בחר את המבנה הוויראלי המתאים. ישנם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון (ראו דיון). הפרוטוקול הנוכחי משתמש בנגיף כדי לבטא את הערוץ האופטוגנטי ChETATC 12, כדי להתמר נוירונים מעוררים (AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry; טיטר: 3.3 x 10 13 גנומים ויראליים / mL).
  3. קבע את הקואורדינטות ואת נפח ההזרקה באמצעות אטלס מוח כפי שתואר קודםלכן 35.
  4. הזרקה סטריאוטקסית של התכשיר הנגיפי
    הערה: יש לעקוב אחר כל ההנחיות הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות לשימוש בבעלי חיים ולטיפול בהם. הווקטורים הנגיפיים מוזרקים באופן סטריאוטקסי כפי שתואר קודם לכן13 עם השינויים הבאים.
    1. שמור את התכשיר הנגיפי על הקרח במהלך הרדמה והכנה של החיה.
    2. השרה הרדמה בתא אינדוקציה הרדמה עם 4% איזופלורן. עקוב אחר רמת ההרדמה המצוינת על ידי קצב נשימה סדיר איטי יותר (1 הרץ) והיעדר רפלקסים של דוושות וקרנית (בדיקה על ידי צביטה בהונות ונגיעה קלה בזווית העין, בהתאמה; אין לזהות תגובה).
    3. מתן משכך כאבים טרום ניתוחי כגון meloxicam לפחות 30 דקות לפני ההליך הפולשני.
    4. כאשר החיה מורדמת לחלוטין, השתמש בקוצץ כדי להסיר את הפרווה מהקרקפת. החלף את זרימת האיזופלורן לחרוט האף של המסגרת הסטריאוטקסית והרכיב את החולדה במסגרת. יש למרוח ג'ל עיניים משמן על העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.
    5. הניתוח צריך להתבצע בתנאים אספטיים. השתמש בכפפות ומכשירים סטריליים לאורך כל ההליך. יש למרוח משחת לידוקאין (5% w/w) לפני חיטוי הקרקפת בתמיסת כלורהקסידין 4% w/v, ולאחר מכן לכסות את הגוף בווילון סטרילי. באמצעות אזמל, לבצע חתך אורכי באורך של כ-15 מ"מ על הקרקפת כדי לחשוף ברגמה.
    6. טען מזרק המילטון לתוך משאבת מזרק מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע ניתנת להזזה המותקנת על המסגרת הסטריאוטקסית.
    7. מניחים אליקוט 5 μL של הנגיף בצינור של 0.2 מ"ל ומסתובבים במשך כמה שניות עד שכל הנפח נמצא בתחתית הצינור. פיפטה 2 μL של הכנה ויראלית לתוך המכסה של הצינור.
    8. מלא את המזרק עם הכנה ויראלית על ידי צפייה ראשונה בקצה המחט עם מיקרוסקופ כירורגי, ולאחר מכן באופן ידני למקם את בולוס של הנגיף בקצה המחט ולמשוך את הבוכנה מזרק באמצעות פקדי המשאבה.
    9. הגדר את נפח הזרקת המשאבה ל-300 nL ואת קצב הזרימה ל-100 nL/min. הפעל את המשאבה ואשר זרימה תקינה על ידי התבוננות בטיפת הנגיף בקצה המחט. סופגים את הנגיף על צמר גפן ומנקים בעדינות את המחט עם 70% אתנול.
    10. באמצעות ברגי הכוונון על המסגרת הסטריאוטקסית נווט את קצה המחט לברגמה (הנקודה על הגולגולת שבה נפגשים התפרים הכתריים והסגיטליים) ושים לב למדידות הסטריאוטקסיות שנצפו בשלושת סולמות ורנייה במסגרת. הקואורדינטות ביחס לברגמה של חולדה mPFC הן קדמיות-אחוריות + 3.1 מ"מ, בינוניות ± 0.7 מ"מ, גב - 4.5 מ"מ; להוסיף/להחסיר (כפי שצוין) את המרחקים הללו מקואורדינטות ברגמה, ולאחר מכן לנווט את המחט לקואורדינטות הקדמיות-אחוריות והבינוניות ולהוריד בעדינות את המחט על פני הגולגולת.
      הערה: קואורדינטות mPFC שניתנו לעיל מתאימות לחולדות זכרים עם ברדס ליסטר של 300-350 גרם; שינויים בזן החולדה, הגודל עשויים לדרוש שינויים בקואורדינטות אלה (ראו דיון).
    11. הרימו את המחט מעל משטח הגולגולת וסמנו נקודה זו בעט טוש קבוע בעל קצה דק. צור חור בור בנקודה זו באמצעות מקדחה מיקרו המותקנת על הזרוע הסטריאוטקסית.
    12. יש להחדיר את המחט למוח בקואורדינטציה הגבית-בנית שנקבעה מראש ולהחדיר נפח שנקבע מראש (עבור mPFC: 300 nL). השאירו את המחט באתרה למשך 10 דקות כדי לאפשר את פיזור הבולוס. עם הסרת המחט, הפעל את המשאבה כדי לוודא שהמחט אינה חסומה.
      הערה: הכנס והסר את המחט באיטיות (~ 3 מ"מ לדקה) כדי למזער את הנזק לרקמת המוח ואת הזרימה האחורית של הנגיף לתוך מערכת המחט.
    13. יש לתת 2.5 מ"ל של נתרן כלורי מחומם (0.9% w/v) וגלוקוז (5% w/v) תמיסה תת עורית כדי לשמור על הידרציה.
    14. חזור על שלב 1.4.12. לחצי הכדור השני.
    15. לתפור את החתך בקרקפת ועם השלמת ההליך, לתת 2.5 מ"ל של נתרן כלורי ותמיסת גלוקוז מתאים, מומלץ מוסדית, משכך כאבים לניהול כאב, למשל, buprenorphine או meloxicam. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה כשהוא מחוסר הכרה. הניחו את החולדה בקופסת התאוששות מחוממת עד שהיא תחזור להכרה מלאה. חזרו לכלוב הביתי רק עם בעלי חיים אחרים לאחר שהחלימו לחלוטין.
    16. עקוב אחר ההנחיות המוסדיות לטיפול לאחר הניתוח ונהלי דיור למכרסמים שעברו טרנספקציה ויראלית. המתן לפחות שבועיים עד שהאופסין טרנסג'ן יתבטא כראוי לפני תחילת הניסוי.
      הערה: הזמן הדרוש להתמרה תלוי במרחק ובחוזק של החיבור בין האזורים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים. עבור mPFC ל- LEC, נדרשים 4-6 שבועות.

2. הכנת פרוסות מוח חריפות

הערה: כאן אנו מתארים שיטה פשוטה להכנת פרוסות מוח אשר בידינו מספיקה כדי להשיג פרוסות קליפת המוח, ההיפוקמפוס והתלמית באיכות גבוהה מעכברים וחולדות בוגרים.

  1. הכן את הפתרונות לנתיחה.
    1. מלאו של 250 מ"ל עם ~200 מ"ל של תמיסת חיתוך סוכרוז קרה כקרח (189 מ"מ סוכרוז, 26 מ"מ NaHCO 3, 10 מ"מ D-גלוקוז, 5 מ"מ MgSO 4,3 mM KCl, 1.25 mM NaH 2 PO4, ו-0.2 mM CaCl 2 המיוצרים במים אולטרה-טהורים (UPW) עם התנגדות של 18.2 MΩ ס"מ ב-25 מעלות צלזיוס) או נפח מספיק כדי למלא את תא רקמת הוויברטום. מבעבעים עם קרבוגן (95% O 2, 5% CO2) ושומרים על קרח.
    2. מלאו תא איסוף פרוסות בנוזל מוחי מלאכותי (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-גלוקוז,3 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1.25 mM NaH2 PO 4,ו-1 mM MgSO4 תוצרת UPW) בטמפרטורת החדר, מבעבע בקרבוגן. תא איסוף הפרוסות14 עשוי בהתאמה אישית ממתלה צינורות מיקרוצנטריפוגה המודבק על יריעה של רשת ניילון ומונח לתוך שבה הוא שקוע ב-aCSF (איור 2A).
    3. מלא שפופרת של 50 מ"ל ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט (PB; 75.4 mM Na 2 HPO4.7H 2 O ו-24.6 mM NaH2PO4. ח2או).
      אזהרה: PFA הוא רעיל. יש להשתמש במכסה אדים.
  2. דיסקציה של המוח.
    1. הרדימו את החולדה בתא אינדוקציה באמצעות 5% איזופלורן עד שהנשימה איטית וסדירה (~1 הרץ). כדי להבטיח רמה מספקת של בדיקת הרדמה להיעדר רפלקסים של דוושה וקרנית.
    2. ערפו את החיה באמצעות גיליוטינה.
    3. לנתח במהירות את כל המוח כפי שתואר קודם לכן15 ולהעביר לתמיסת חיתוך סוכרוז. השלם את השלב תוך 90 שניות מרגע עריפת הראש לקבלת איכות פרוסה טובה והקלטה מוצלחת של תאים שלמים.
    4. בעזרת כפית מתכת, הרימו את המוח, השליכו תמיסת חיתוך עודפת והניחו אותה על פיסת נייר סינון על הספסל.
    5. באמצעות אזמל או סכין גילוח, להסיר במהירות את המוח הקטן ולחתוך את המוח במישור הכתר בערך באמצע הדרך לאורכו; החצי האחורי הוא גוש הרקמה LEC. הקפד לכלול כמה רקמה עודפת בנוסף לאזור להיות פרוס עבור השלבים הבאים. החזירו גם את גוש הרקמה הזה וגם את שארית המוח לתמיסת חיתוך הסוכרוז.
    6. מניחים טיפה של דבק ציאנואקרילט על שלב רקמת ויברטום. מורחים אותו לשכבה דקה עם שטח מעט גדול יותר מגוש הרקמה שנוצר בשלב הקודם.
    7. מרימים את גוש הרקמה LEC באמצעות כפית, משליכים תמיסת עודפים ומעבירים למדבקת הדבק כך שהחתך הקורונלי הקדמי נדבק.
    8. התקן את הבמה לתוך תא רקמת ויברטום במהירות לשפוך כמות מספקת של תמיסת חיתוך סוכרוז כדי להטביע את הרקמה; לבעבע את הפתרון הזה עם carbogen. כוון את בלוק רקמת LEC עם משטח הגחון לכיוון הלהב. בעוד שתאורת הסביבה בחדר אינה מספיקה להפעלת האופסין, הימנעו משימוש במקורות אור נוספים שעשויים להימצא בוויברטום.
    9. חותכים פרוסות בעובי 350 מיקרומטר מגחון לגב באמצעות מהירות תנודת להב גבוהה (100 הרץ) ומהירות התקדמות להב איטית (0.06 מ"מ לשנייה). בדרך כלל, ניתן להשיג שבע פרוסות LEC לכל חצי כדור.
    10. מעבירים את הפרוסות לתא איסוף הפרוסות. עם השלמת איסוף הפרוסות, העבירו את תא האיסוף לאמבט מים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני שתחזרו לטמפרטורת החדר. בועה עם קרבוגן ברציפות. פרוסות יהיו בריאות מספיק להקלטה במשך 6 שעות לפחות.
    11. מניחים את שארית המוח ב-PFA למשך 48 שעות לבדיקה לאחר הוק של אתר ההזרקה (ראו סעיף 4).

3. אלקטרופיזיולוגיה וגירוי אופטוגנטי

  1. זיהוי תא יעד.
    1. הכניסו את הפרוסה לתא הקלטה שקוע בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס עם aCSF בקצב של 2 מ"ל/דקה על ידי משאבה פריסטלטית. שיתוק הפרוסה באמצעות עוגן פרוסה.
    2. תחת מטרת ההגדלה הנמוכה (4x) של מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות תאורת אינפרא אדום אלכסונית, נווט לשכבת LEC 5. מדוד את המרחק ממשטח הפיס לשכבה הנדרשת.
      הערה: תאורת אינפרה-אדום אלכסונית הושגה על-ידי מיקום נורית LED אינפרה-אדומה קרובה כ-3 מ"מ מתחת לכיסוי תא ההקלטה בזווית של ~55° למישור הכיסוי (איור 2B). ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית היא טכניקת הדמיה חלופית ונפוצה לאלקטרופיזיולוגיה של פרוסות.
    3. שנה ליעד טבילה במים בהגדלה גבוהה (פי 40) וזהה נוירונים פירמידליים. סמן את המיקום של התא על צג המחשב עם קלטת.
      הערה: לנוירונים הפירמידליים יש מורפולוגיה משולשת בערך עם דנדריטים אפיקליים בולטים המקרינים לעבר פני השטח הפיניאליים של הפרוסה (איור 3A). ניתן להעריך את בריאות התא על ידי היעדר גרעין מעובה ונראה לעין ובדיקה של קרום הפלזמה שאמור להיראות חלק. אין זה סביר כי תיוג פלואורסצנטי ברור של אקסונים על ידי חלבון היתוך אופסין-פלואורופור יהיה גלוי בעת שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. כדי להמחיש תחזיות אקסונאליות, בצע אימונוהיסטוכימיה לאחר הוק באמצעות נוגדן ראשוני כנגד הפלואורופור של האופסין והגבר עם נוגדן משני המצומד לפלואורופור באורך גל זהה או דומה.
  2. היווצרות של מהדק טלאי שלם.
    1. ייצרו מיקרופיפט זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ומלאו בתמיסת הקלטה תוך-תאית מסוננת (120 mM k-gluconate, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0.3 mM NaGTP, 0.2 mM EGTA ו-0.25% ביוציטין המיוצר ב-UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm). הנח את המיקרופיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה על מגבר המדבקה-מהדק על במת הראש של מגבר המדבקה כדי להבטיח שחוט האלקטרודה נמצא במגע עם התמיסה התוך-תאית.
    2. הפעילו לחץ חיובי דרך הפה על ידי ניפוח חזק לתוך פיה (כגון מזרק 1 מ"ל כאשר הבוכנה הוסרה) המחוברת על ידי צינורות ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה ושמרו על הלחץ על ידי סגירת שסתום תלת-כיווני בשורה. הרימו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראותה במיקרוסקופ.
    3. פתח את חלון בדיקת החותם ב- WinLTP16 (או תוכנת רכישה/אוסצילוסקופ אחרת) ועם המגבר במצב מהדק מתח, החל פולס מרובע של 5 mV כדי לקבוע אם התנגדות הפיפטה היא 3-6 MΩ.
    4. להתקרב ולגעת בתא המזוהה עם קצה הפיפטה; זה אמור לגרום לכניסה לקרום התא (איור 3A; פאנל ימני) ולעלייה קטנה בהתנגדות הפיפטה (0.1 MΩ).
    5. לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי על ידי הפעלת יניקה מתונה על השופר; זה אמור לגרום לעלייה עצומה בעמידות הפיפטה (>1000 MΩ). כעת ניתן להשאיר את הלחץ נייטרלי. הפעל לחץ שלילי ברמפה ההולכת וגדלה בהדרגה עד לקרום התא נקרע וכתוצאה מכך לקיבול של תאים שלמים חולפים.
  3. תיעוד אירועים סינפטיים המעוררים באופן אופטיגנטי.
    1. הזן את תצורת המהדק הנוכחי.
      הערה: ברוב המקרים העברה סינפטית ארוכת טווח היא גלוטמטרגית, ולכן רישום בפוטנציאלים של ממברנה קרוב לפוטנציאל ההיפוך של כלוריד יבודד בצורה הטובה ביותר את ההולכה בתיווך קולטן AMPA (AMPAR) וימזער את המדידה של כל עיכוב הזנה קדימה (FFI) המעורר. היפוך כלוריד תלוי בהרכב תמיסת ההקלטה התוך-תאית וב-aCSF וניתן לחשב אותו באמצעות משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ; עבור הפתרונות לעיל, זה היה -61.3 mV. לנוירונים הפירמידליים של LEC בשכבה 5 היה פוטנציאל ממברנה מנוחה ממוצע של -62 mV, ובמידת הצורך נשמרו בפוטנציאל זה על ידי הזרקת זרם קבוע. לחלופין, התאים יכולים להיות מהודקים במתח לפוטנציאל הרצוי. כדי לרשום תחזיות מעכבות ארוכות טווח16 או כדי להקליט FFI, מהדק מתח בפוטנציאל היפוך קטיונים כדי לבודד את מוליכות הכלוריד GABAergic. כאשר נוירונים מהדקי מתח בפוטנציאל הממברנה מעל סף פוטנציאל הפעולה, תמיסה תוך-תאית מבוססת צזיום המכילה חוסמי תעלות נתרן מגודרות מתח משמשת לשיפור מהדק המתח ולמניעת התחלת פוטנציאל פעולה (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 כלוריד,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, 0.25% ביוציטין תוצרת UPW, pH 7.25, 285-300 mOsm).
    2. באמצעות תוכנה לאיסוף נתונים, שלח אותות לוגיקת טרנזיסטור-טרנזיסטור (TTL) למנהל התקן LED כדי להפעיל נורית LED מותקנת בגודל 470 ננומטר. נורית ה-LED המותקנת מופנית לנתיב האור של המיקרוסקופ באמצעות קוביות סינון ואופטיקה מתאימה (איור 2B) כדי להחיל פולסים של אור על הפרוסה דרך המטרה פי 40 כדי לעורר פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים אופטוגנטיים (oEPSPs).
      הערה: פולסים קלים יכולים להיות מיושמים באופן פריסומטי / מעל הדנדריטים, מה שיגרום להפעלת אופסינים באקסונים ובבוטון הקדם-סינפטי, או שהחוקר יכול להזיז את המטרה לאקסונים הרחק מהתא המוקלט כדי למנוע גירוי יתר של בוטון (ראה דיון). משרעת oEPSP מקסימלית תלויה בחוזק ההקרנה הסינפטית, ביעילות הזריקות הנגיפיות ובאופסין המשמש. oEPSPs ניתן לקשר למשרעת הרצויה על ידי עוצמת אור משתנה ו / או משך18; שינוי משך פעימות האור (משך אופייני בין 0.2-5 אלפיות השנייה בתפוקת הספק LED מקסימלית, מה שמביא לצפיפות אור של 4.4 mW/mm19) מעניק אמפליטודות oEPSP עקביות יותר מאשר שינוי תפוקת ההספק של הנורית.
    3. חקרו את תכונות השחרור הקדם-סינפטי (שינוי במתח) על-ידי העברת רכבות של פולסים מרובים של אור עם מרווחים בין-גירויים שונים (איור 3E); יש לנקוט משנה זהירות בעת פירוש העברה מעוררת אופוגנטית (ראו דיון).
    4. לחקור את הפלסטיות לטווח ארוך על ידי התעוררות חוזרת ונשנית של oEPSPs19 או יישום של ליגנדות. נטר את משרעת oEPSP למשך 5-10 דקות כדי להבטיח יציבות לפני אינדוקציה של פלסטיות, ולאחר מכן נטר עד להגעה לאמפליטודה יציבה (בדרך כלל 30-40 דקות).
      הערה: רוב האופסינים הנוכחיים אינם מסוגלים לעורר באופן אמין פוטנציאל פעולה מרובה בתדרים גבוהים, למשל, 100 גירויים המועברים ב-100 הרץ, כפי שמשמש בדרך כלל להשראת LTP.
    5. כדי לאשר oEPSPs הם monosynaptic, לבצע הפעלה over-bouton של המסלול מתמר על ידי מיקום המטרה מעל סוך דנדריטי מגרה בנוכחות 0.5 μM טטרודוטוקסין ו 100 μM aminopyridine. יישום של טטרודוטוקסין יבטל את ההעברה אם התגובות תלויות פוטנציאל פעולה והכללה לאחר מכן של אמינופירידין תשחזר חלקית את ההעברה אם ה- oEPSPs נוצרים באופן מונוסינפטי19,20.
    6. כדי לאפשר לביוציטין למלא את הנוירון, יש להמתין לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, עקוב אחר קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה.
    7. משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מהסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמותם האיטית של טרנזיינטים קיבוליים וזרם ממברנה המעידים על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. שימו לב לכיוון הפרוסה ולמיקום התאים בתוך הפרוסה. מכניסים את הפרוסה ל-PFA בצלחת של 24 בארות ודוגרים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, ואז מעבירים ל-0.1 M PB.
      הערה: ניתן לאחסן פרוסות למשך עד שבוע. אם נדרש אחסון ארוך יותר, שנה את ה- PB באופן קבוע או השתמש ב- PB המכיל נתרן אזיד (0.02%-0.2% של נתרן אזיד).

4. היסטולוגיה

  1. חיתוך אתר הזרקה
    1. לאחר הקיבוע, יש להגן על הרקמה ב-30% סוכרוז (w/v) ב-PB עד שהיא שוקעת (בתחילה היא תצוף בתמיסת סוכרוז), בדרך כלל לילה בטמפרטורת החדר או 24-48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מדיום, לצרף בלוק של רקמה לדיסק הדגימה cryostat. הקפיאו את בלוק הרקמה בעקבות שלבים 4.1.3 עד 4.1.4.
    3. מניחים איזופנטאן במיכל מתאים. לטבול רק את דיסק הדגימה, להבטיח את הרקמה היא מעל רמת isopentane. מורידים את מיכל האיזופנטאן לחנקן נוזלי (או קרח יבש) ומאפשרים לרקמה לקפוא.
    4. לאחר שקפא לחלוטין (כל גוש הרקמה הופך חיוור וקשה), השאירו את בלוק הרקמה בתא הקריוסטאט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לטמפרטורת הבלוק להתאזן.
    5. חותכים חלקים בעובי 40 מיקרומטר בקריסטאט ב-20 מעלות צלזיוס. השתמש במכחול עדין כדי להנחות את החלקים מהלהב. הדבק חלקים קפואים לטמפרטורת החדר, מצופה פולי-L-ליזין, שקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי נגיעה במגלשה לחלקים.
    6. הוסף כ-150 μL של מדיום הרכבה לכל שקופית ומכסה עם מכסה מחליק; הסירו את בועות האוויר על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי. כסו את השקופיות כדי להגן מפני הלבנת תמונות וייבוש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות (או למשך הלילה). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש לבחון את מיקום אתר ההזרקה הנגיפי.
  2. פרוטוקול צביעת ביוציטין
    הערה: ניתן להחיל פרוטוקול זה על חלקים עבים; אין צורך לחתוך מחדש פרוסות.
    1. שטפו את פרוסות המוח בתמיסת מלח אפופית פוספט (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ו-1.8 mM KH2PO4) שש פעמים למשך 10דקות לכל שטיפה. השתמש פיפטה העברה כדי לרוקן את הבארות לאחר כל שלב.
    2. דגירה של הפרוסות ב-3% H2 O2 (w/v) ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כל פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. זה יוצר בועות חמצן.
    3. שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה או עד שלא נראות בועות חמצן נוספות. דגירה של פרוסות המוח בתמיסת קומפלקס HRP (ABC) של 1% (v/v) אבידין-ביוטינילציה ב-PBS המכילה 0.1% (v/v) Triton X-100 בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות.
    4. שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה.
    5. דגירה של כל פרוסה בתמיסת 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) למשך מספר דקות עד שהכתם הביוציטין של מבנים עצביים הופך גלוי לעין (לוקח בערך 5-10 דקות).
      אזהרה: DAB הוא רעיל. יש להשתמש במכסה אדים.
      הערה: זמני הדגירה של DAB יכולים להיות בלתי צפויים, עקוב אחר הרקמה מקרוב ככל שהצבע מתפתח.
    6. עצרו את התגובה על ידי העברת הפרוסות ל-PBS קר (4 מעלות צלזיוס). שטפו את פרוסות המוח עם PBS שש פעמים למשך 10 דקות בכל שטיפה. השתמש במברשת כדי להרכיב את פרוסות המוח על שקופיות זכוכית מצופות פולי-L-ליזין.
    7. הסר את כל עודף PBS עם רקמה נקייה. מכסים כל פרוסה בכ-200 μL של מדיום הרכבה; מכסים בכיסויים ולוחצים בעדינות על הכיסוי כדי לדחוף החוצה בועות אוויר. יש לייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות (או למשך הלילה). באמצעות מיקרוסקופ אור, יש לבחון את המיקום והפרטים המורפולוגיים של התאים.
      הערה: ניתן להמחיש את הביוציטין לחלופין באמצעות סטרפטווידין מצומד פלואורופור; עם זאת, הדמיה עשויה לדרוש כריתה או שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לחקור פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות באמצעות העברה נגיפית של מבנים אופטוגנטיים. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות רבה לחקר כמעט כל קשר ארוך טווח במוח. לדוגמה, אנו מתארים את ההזרקה של AAVs המקודדים אופסין לתוך mPFC של חולדה, הכנת פרוסות חריפות מ-LEC, הקלטות של מה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקור הקרנות סינפטיות ארוכות טווח ספציפיות ביותר באמצעות שילוב של ניתוחים סטריאוטקסיים כדי לספק AAVs המקודדים מבנים אופטוגנטיים, ואלקטרופיזיולוגיה בפרוסות מוח חריפות (איור 1). יחד טכניקות אלה מציעות כלים לאפיון הפיזיולוגיה והפלסטיות של מעגלי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק Wellcome 206401/Z/17/Z. ברצוננו להודות לזפאר בשיר על חונכותו המקצועית ולד"ר קלייר בות' על הסיוע הטכני וההערות על כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubeFisher Scientific Ltd12134102
10 µL pipetteGilsonFD10001
24 well plateSARSTEDT83.3922
3 way luer valveCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrateVector LaboratoriesSK-4105
40x objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopyridineHello BioHB1073
4x objectiveOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Achromatic lensEdmund Optics49363Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifugeBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Borosillicate glass capillaryWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Camera - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Chlorhexidine surgical scrubVetaseptXHG008
ClippersAndis22445AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lensThorLabsACL2520-A
CoverslipsFisher Scientific Ltd10011913
CryostatLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Cyanoacrylate glueRapid Electronics Ltd84-4557
Data acquisition deviceNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucoseSigma-AldrichG8270
Dichroic mirror 500 nm long-passEdmund Optics69899
Dichroic mirror 600 nm long-passEdmund Optics69901
Dichroic mirror cubeThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore324626
Electrode holder with side portHEKA895150
Emission filterChroma59022m
Excitation filterChromaET570/20x
Eye gelDechraLubrithal
Fine paint brushScientific Laboratory SuppliesBRU2052
GuillotineWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Hydrogen peroxide solutionSigma-AldrichH100930% (w/w)
IsofluraneHenry Schein988-3245
IsopentaneSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconateSigma-AldrichG4500
Kinematic fluorescence filter cubeThorLabsDFM1T1
LED driverThorLabsLEDD1B
Lidocaine ointmentTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Micro drillHarvard Apparatus75-1887
Microelectrode pullerSutter instrumentsP-87
Microinjection syringeHamilton7634-01/00
Microinjection syringe needleHamilton7803-05Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12°
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
Mounted blue LEDThorLabsM470L5
Mounted green LEDThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT mediumVWR InternationalRAYLLAMB/OCTOptimal cutting temperature medium
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Patch clamp amplifierMolecular Devices700A
Peristaltic pumpWorld Precision InstrumentsMinistar
Poly-L-lysine coated microscope slidesFisher Scientific Ltd23-769-310
Recording chamberWarner InstrumentsRC-26G
Scalpel bladeSwann Morton#24
Slice anchorWarner InstrumentsSHD-26-GH/15
Stereotaxic frameKopfModel 902
Stereotaxic holder for micro drillHarvard Apparatus75-1874
SucroseSigma-AldrichS0389
Surgical MicroscopeCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Syringe filter for intracellular recording solutionThermo Scientific Nalgene171-0020
Tetrodotoxin citrateHello BioHB1035
Transfer pipettesFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Upright fluorescence microscopeLeicaDM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kitVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Version 2.32Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

References

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174(2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310(2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , Academic Press. (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , Academic Press. (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved