基于显微镜的测定，用于使用SNARE运输研究和分析回收内体

摘要

回收内体是内体管网络的一部分。在这里，我们提出了一种使用GFP-STX13作为细胞器标记来量化回收内体动力学的方法。

摘要

回收内体（REs）是由所有细胞类型中的早期/分选内体产生的管状囊泡细胞器。这些细胞器在黑素体的生物发生中起着关键作用，黑素体是由黑素细胞产生的溶酶体相关细胞器。RE在形成期间将黑素细胞特异性货物输送到过早的黑素体。在Hermansky-Pudlak综合征的几个突变体中观察到的REs的产生阻塞，导致皮肤，头发和眼睛色素减退。因此，研究REs的动力学（参见数量和长度）对于了解这些细胞器在正常和疾病条件下的功能是有用的。在这项研究中，我们的目标是使用常驻SNARE STX13测量RE动力学。

引言

黑色素色素的生物合成发生在黑素体中，黑素体是一种与常规溶酶体共存的黑素细胞特异性溶酶体相关细胞器（LRO）。内吞系统在黑色素体的生物发生中起着关键作用，黑素体是肤色和防止电离辐射的光保护^{所必需的1，2，3}。在此过程中，黑色素合成酶在早期/分选内体上被分选，然后通过称为循环内体（REs）^的管状或囊泡内体运输到过早的黑素体4^{，5，6，7，8，9，10}。这些细胞器的靶向和融合调节全功能色素沉着黑素体的成熟^{7，11，12，13，14}。在Hermansky-Pudlak综合征中观察到，这些细胞器形成或对这些细胞器的货物分拣中的缺陷导致眼皮白化病和其他临床表型^15，16。

在这里，我们描述了一种基于显微镜的简单技术来研究和分析RE。在这种方法中，我们利用了一种跨膜蛋白Qa-SNARE Syntaxin（STX）13，它存在于循环内体¹⁷上，并且在黑素细胞中分选内体和黑素体之间的循环^12，18。此外，删除N端非结构化调节域（即SynN或STX13Δ129）允许SNARE卡在黑素体中，黑素体测量向黑素体的前向运输途径¹²。我们在研究中使用了已知的回收内体标志物Rab GTPase（Rab）^11111111。对野生型黑素细胞中的蛋白质GFP-STX13WT，GFP-STX13Δ129，mCherry-Rab11和TYRP1进行荧光成像，然后定量其相对定位，除了它们靶向黑素体外，还将提供REs的性质和动力学。因此，这是一种简单的技术，可用于可视化和测量黑素细胞中RE的动力学。

研究方案

该协议涉及黑素细胞的接种，然后转染质粒。进一步的步骤包括固定，免疫染色，成像和分析细胞，以测量RE的长度和数量。该协议的详细说明如下。

1. 在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞

1. 用基底膜基质培养基（在完全RPMI培养基中为1:20:20:1:20）涂覆在培养皿（即35毫米培养皿中4- 5个培养皿）中的玻璃盖玻片，并在组织培养罩中干燥15分钟。使用前用 1x PBS 清洗盖玻片一次。
2. 在补充完整的RPMI培养基的培养皿（即35或60毫米培养皿）中维持野生型小鼠黑素细胞（来自C57BL / 6J， a / a， Ink4a-Arf^{-/-小鼠的melan-Ink4a-Arf-1} ，在²⁰ 中描述并在欢迎信托功能基因组学细胞库中提供）。
   1. 用1x PBS洗涤细胞两次，并加入0.5或1mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液用于胰蛋白酶消化细胞。将细胞在37°C孵育2-5分钟，以便从培养皿中分离。
   2. 加入1 - 2mL完整的RPMI培养基，悬浮并将细胞转移到离心管中。
3. 将细胞悬浮液在4°C，376× g 下离心5分钟，然后将沉淀重悬于1x PBS中。
4. 重复离心步骤并将细胞重悬于1mL完整RPMI培养基中。
5. 将细胞接种在基底膜介质包被的盖玻片上，汇合度为50-60%（在含有^4-5 个盖玻片的35mm细胞培养皿上约6×105个细胞）。始终在完整的RPMI培养基中向接种的细胞悬浮液中加入200nM的PMA（加入5μL工作储备40μM phorbol 12-肉豆蔻酸13-乙酸酯）。
6. 播种后，将板在37°C孵育12-24小时。

2. 用STX13质粒转染细胞

1. 使用以下试剂:pEGFP-C1-STX13WT 和 pEGFP-C1-STX13Δ129（如 ¹² 中所述）。mCherry-Rab11是巴黎居里学院Graça Raposo的一份好心礼物（在参考文献¹⁹中描述）。来自ATCC的抗TYLP1抗体（TA99）。
2. 接种12 - 24小时后，使用基于脂质的转染试剂用质粒转染细胞。对于35 mm培养皿，在微量离心管中的250μLOPTI-MEM培养基中取5μL转染试剂，并在250μLOPTI-MEM中取取约200ng每个质粒。
3. 孵育含有DNA和转染试剂的试管5分钟。无需重复移液即可混合（总体积约为500μL）。在室温下孵育30分钟。在室温下每10分钟进行一次手敲管30分钟。
4. 在孵育过程中，用1x PBS洗涤细胞两次，一次用OPTI-MEM洗涤，然后向细胞中加入1mL OPTI-MEM。
5. 孵育30分钟后，通过覆盖培养皿以滴滴方式将转染试剂 - DNA混合物加入细胞中。
6. 将细胞在37°C孵育6小时。用转染试剂吸出 OPTI-MEM 培养基，加入补充了 200 nM PMA 的完整 RPMI 培养基。
7. 将细胞在37°C孵育48小时。

3. 细胞固定

注意:以下程序在组织培养罩外进行。

1. 转染48小时后，用1x PBS洗涤细胞两次，然后用3%甲醛（在1x PBS中新鲜制备）固定细胞30分钟。
2. 固定后，用1x PBS洗涤细胞两次，并将盖玻片储存在1x PBS中直至进一步使用。或者，细胞可以安装在载玻片上（见下文）或储存在4°C。

4. 细胞免疫染色

1. 准备一个潮湿的房间:将石蜡薄膜切成片放在培养皿中的湿润滤纸上，用铝箔覆盖。
2. 制备25μL一抗溶液（0.2%皂苷在1x PBS中，0.1%BSA在1x PBS中，0.02%叠氮化钠在1x PBS中）。以1:200的稀释液加入抗体。将此溶液滴滴滴在潮湿室中的石蜡膜上。
3. 用镊子小心地提起盖玻片，将其倒置在这一滴一抗染色液上，然后盖上潮湿室的盖子。在室温下孵育30分钟。
4. 同样，以1:500的稀释度制备二抗溶液，并将其放在潮湿室盖玻片旁边的石蜡膜上。为了染色细胞核，将DAPI（1:20，000至1:30，000）加入溶液中。
5. 使用镊子，小心地从一抗溶液中取出盖玻片，并将其浸入1x PBS（在玻璃烧杯中）中三次。
6. 轻触薄纸上的盖玻片，以清除盖玻片上多余的PBS。将其放在潮湿室中的二抗染色溶液上，并且由于溶液中存在荧光标记的抗体，因此不要将其暴露在光线下。
7. 在室温下再次孵育盖玻片30分钟。请始终注意盖玻片的侧面，该封面在整个步骤中具有单元格。
8. 孵育后，小心地从二抗溶液中取出盖玻片，然后将其浸入1x PBS中三次。此外，点击薄纸上的盖玻片以除去盖玻片上多余的PBS。
9. 将12μL氟卡蒙-G安装试剂放在载玻片上，并小心地将染色的盖玻片（面向玻璃）放在安装试剂上。将载玻片倒置在薄纸上，然后轻轻按压。

5. 细胞荧光显微镜

1. 使用配备CCD相机的倒置荧光显微镜，使用60倍（油）复消色差物镜或任何其他具有类似配置的显微镜，在明场（BF）和荧光（IF）滤光片下对染色的细胞进行成像。

6. RE定位蛋白与黑素体重叠的定量:

注意:使用斐济软件定量蛋白质之间的Mander重叠系数，遵循以下步骤（可从链接免费下载:https://imagej.net/software/fiji/）。将 TIFF 图像与多个通道一起使用。

1. 打开 原始图像。转到 "图像"选项，选择" 颜色|拆分通道，并使用两个通道进行分析。
2. 在插件选项中打开 JACoP 插件。
3. 为两个通道设置阈值，以便选择所有亮点并消除背景。
4. 转至 分析选项，选择 M1 和 M2 系数 以获取曼德重叠系数。
5. 按 JACoP 插件中的 分析选项 ，查看显示曼德重叠系数的结果。

7. 回收内体管数和长度的定量:

注意:使用斐济软件量化小管的数量和长度，遵循以下步骤。

1. 打开原始图像 转到 图像 选项，选择 颜色|拆分通道 并使用所需的通道进行分析。
2. 再次转到 "图像 "，选择" 键入|转换为 8 位图像。
3. 然后转到 "插件"，选择" 分析|管状。将 西格玛 值设置为 0.1075 。按 确定。
4. 再次转到 "图像 "，选择" 键入|转换为 8 位图像。
5. 转到 图像|调整|阈值 （对所有图像使用相同的阈值。图像应具有大致相等的强度）。
6. 转到 "进程|二进制|转换为 掩码。
7. 转到 "处理"，选择" 二进制" ，然后选择" 骨架化"。
8. 转至 分析，选择 骨架， 然后选择 分析骨架。在 结果和输出| 选择 （a） 计算最大最短路径 | （b） 显示 详细信息| （c） 显示 标记的骨架。按 确定。
   注意:结果将以表格格式打开。"平均分支长度"列显示所选细胞中所有不同小管的长度（设置用于获取以微米为单位的值的比例）。
9. 要获取细胞中的小管数量，请转到 分析，然后选择 分析颗粒 选项。按 确定。
   注意:在获得的结果中，计数列显示该特定细胞中的小管数量。
10. 保存数据并进行分析。

结果

^STX13Δ129突变体定位到黑素体的定量分析
STX13在小鼠野生型黑素细胞中的免疫荧光显微镜显示，GFP-STX13WT定位为囊泡和管状结构，GFP-STX13Δ129定位为细胞表面外的环状结构（图1A）。此外，细胞内环状GFP-STX13Δ129显示出与黑素体蛋白TYRP1（图1A）和明场成像黑素体（数据未显示）的共定位

讨论

回收内体是一组内吞细胞器，它们介导所有细胞类型中货物到细胞表面的回收^21，22，^23，24，25。在黑色素细胞等特殊细胞类型中，这些细胞器部分地将其运输路线转移到黑素体以进行生物发生^3，16，26。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022