Le test basé sur la microscopie pour étudier et analyser les endosomes de recyclage à l’aide du trafic SNARE

Résumé

Les endosomes de recyclage font partie du réseau tubulaire endosomal. Nous présentons ici une méthode pour quantifier la dynamique du recyclage des endosomes en utilisant GFP-STX13 comme marqueur d’organite.

Résumé

Les endosomes de recyclage (RE) sont des organites tubulaires-vésiculaires générés à partir d’endosomes précoces/triés dans tous les types de cellules. Ces organites jouent un rôle clé dans la biogenèse des mélanosomes, un organite lié aux lysosomes produit par les mélanocytes. Les ER délivrent la cargaison spécifique aux mélanocytes aux mélanosomes prématurés pendant leur formation. Le blocage dans la génération d’EI, observé chez plusieurs mutants du syndrome de Hermansky-Pudlak, entraîne une hypopigmentation de la peau, des cheveux et des yeux. Par conséquent, l’étude de la dynamique (se référer au nombre et à la longueur) des ER est utile pour comprendre la fonction de ces organites dans des conditions normales et pathologiques. Dans cette étude, nous visons à mesurer la dynamique des ER à l’aide d’un SNARE STX13 résident.

Introduction

La biosynthèse des pigments de mélanine se produit dans les mélanosomes, un organite spécifique des lysosomes (LRO) spécifique aux mélanocytes qui coexiste avec les lysosomes conventionnels. Le système endocytaire joue un rôle clé dans la biogenèse des mélanosomes, nécessaires à la couleur de la peau et à la photoprotection contre les rayonnements ionisants1,2,3. Au cours de ce processus, les enzymes de synthèse de la mélanine sont triées sur des endosomes précoces / triés, puis transportées vers des mélanosomes prématurés par le biais d’endosomes tubulaires ou vésiculaires appelés endosomes de recyclage (URE)^{4,5,6,7,8,9,10}. Le ciblage et la fusion de ces organites régulent la maturation des mélanosomes pigmentés entièrement fonctionnels7,11,12,13,14. Des défauts dans la formation de ces organites ou le tri de la cargaison vers ces organites provoquent un albinisme oculo-cutané et d’autres phénotypes cliniques, observés dans le syndrome de Hermansky-Pudlak15,16.

Nous décrivons ici une technique simple basée sur la microscopie pour étudier et analyser les ER. Dans cette méthode, nous avons tiré parti d’une protéine transmembranaire, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 qui réside sur le recyclage des ^endosomes17 et les cycles entre le tri des endosomes et des mélanosomes dans les mélanocytes12,18. De plus, la suppression du domaine réglementaire non structuré N-terminal (à savoir SynN ou ^STX13Δ129) permet au SNARE de rester coincé dans les mélanosomes, ce qui mesure la voie de trafic vers le ^{mélanosome12}. Nous avons utilisé un marqueur endosomamal de recyclage connu Rab GTPase (Rab)11 dans nos ^études14,19. L’imagerie par fluorescence des protéines GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 et TYRP1 dans les mélanocytes de type sauvage, suivie de la quantification de leur localisation relative, fournira la nature et la dynamique des ERE en plus de leur ciblage sur les mélanosomes. Il s’agit donc d’une technique simple qui peut être utilisée pour visualiser et mesurer la dynamique des ER dans les mélanocytes.

Protocole

Le protocole implique l’ensemencement des mélanocytes suivi d’une transfection des plasmides. D’autres étapes comprennent la fixation, l’immunocoloration, l’imagerie et l’analyse des cellules pour mesurer la longueur et le nombre d’EI. La description détaillée du protocole est donnée ci-dessous.

1. Ensemencement de mélanocytes de souris sur des couvertures prétraitées

1. Enduire les couvercles de verre dans une boîte de Petri (c’est-à-dire 4 à 5 dans un plat de 35 mm) avec un milieu de matrice de membrane basale (1:20 en milieu RPMI complet: RPMI + 10% de FBS inactivé par la chaleur + 1x Glutamine + 1x Mélange antibiotique) et sécher dans la hotte de culture tissulaire pendant 15 min. Lavez les couvercles une fois avec 1x PBS avant utilisation.
2. Maintenir les mélanocytes de souris de type sauvage (souris melan-Ink4a-Arf-1 de C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^-/- , décrites dans ²⁰ et disponibles sur The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) dans une boîte de Petri (c.-à-d. boîte de 35 ou 60 mm) complétée par un milieu RPMI complet.
   1. Lavez les cellules deux fois avec 1x PBS et ajoutez 0,5 ou 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25%) pour les cellules trypsinisantes. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 à 5 min pour le détachement de la boîte de Pétri.
   2. Ajouter 1 à 2 mL de milieu RPMI complet, suspendre puis transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse.
3. Centrifugez la suspension de la cellule à 4 °C, 376 x g pendant 5 min, puis remettez la pastille en suspension dans 1x PBS.
4. Répétez l’étape de centrifugation et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de milieu RPMI complet.
5. Ensemencez les cellules sur les couvertures à revêtement moyen de la membrane basale à une confluence de 50 à 60% (environ 6 x ¹⁰⁵ cellules sur une boîte de culture cellulaire de 35 mm contenant 4 à 5 couvertures). Toujours ajouter 200 nM de PMA (ajouter 5 μL de stock de travail 40 μM phorbol 12-myristate 13-acétate) à la suspension cellulaire plaquée dans un milieu RPMI complet.
6. Après l’ensemencement, incuber la plaque à 37 °C pendant 12 à 24 h.

2. Transfection des cellules avec les plasmides STX13

1. Utilisez les réactifs suivants : pEGFP-C1-STX13WT et pEGFP-C1-STX13Δ129 (décrits en ¹²). mCherry-Rab11, était un cadeau aimable de Graça Raposo, Institut Curie, Paris (décrit dans la ^{référence19}). Anticorps anti-TYRP1 de l’ATCC (TA99).
2. Après 12 à 24 h d’ensemencement, transfecter les cellules avec des plasmides à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides. Pour une parabole de 35 mm, prendre 5 μL du réactif de transfection dans 250 μL de milieu OPTI-MEM dans un tube de microcentrifugation et prélever environ 200 ng de chaque plasmide dans 250 μL d’OPTI-MEM.
3. Incuber les tubes contenant de l’ADN et le réactif de transfection pendant 5 min. Mélanger sans pipetage répété (le volume total sera d’environ 500 μL). Incuber pendant 30 min à température ambiante. Tapotez le tube à la main toutes les 10 minutes pendant 30 minutes à RT.
4. Pendant l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, une fois avec OPTI-MEM, puis ajoutez 1 mL d’OPTI-MEM aux cellules.
5. Après 30 min d’incubation, ajoutez le mélange réactif-ADN de transfection aux cellules de manière goutte à goutte en recouvrant le plat.
6. Incuber les cellules à 37 °C pendant 6 h. Aspirer le milieu OPTI-MEM avec un réactif de transfection et ajouter un milieu RPMI complet complété par 200 nM de PMA.
7. Incuber les cellules à 37 °C pendant 48 h.

3. Fixation des cellules

REMARQUE: La procédure suivante est effectuée à l’extérieur de la hotte de culture tissulaire.

1. Après 48 h de transfection, laver les cellules deux fois avec 1x PBS puis fixer les cellules avec 3% de formaldéhyde (fraîchement préparé dans 1x PBS) pendant 30 min.
2. Après la fixation, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS et stockez les couvercles dans 1x PBS jusqu’à une utilisation ultérieure. Alternativement, les cellules peuvent être montées sur des lames de verre (voir ci-dessous) ou stockées à 4 °C.

4. Immunocoloration des cellules

1. Préparez une chambre humide: placez le film de paraffine coupé sur du papier filtre humide dans une boîte de Pétri, recouverte de papier d’aluminium.
2. Préparer 25 μL de solution d’anticorps primaires (0,2 % de saponine dans 1x PBS, 0,1% de BSA dans 1x PBS et 0,02% d’azoture de sodium dans 1x PBS). Ajouter l’anticorps à une dilution de 1:200. Ajouter cette solution sous forme de goutte sur un film de paraffine dans la chambre humide.
3. Soulevez délicatement le couvercle avec une pince, inversez-le sur cette goutte de solution de coloration d’anticorps primaires, puis couvrez le couvercle de la chambre humide. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
4. De même, préparez la solution d’anticorps secondaire à une dilution de 1:500 et placez-la sur un film de paraffine à côté du couvercle dans la chambre humide. Pour colorer le noyau, ajouter DAPI (1:20 000 à 1:30 000) à la solution.
5. À l’aide d’une pince, ramassez soigneusement le couvercle de la solution d’anticorps primaire et trempez-le trois fois dans 1x PBS (dans un bécher en verre).
6. Appuyez sur le couvercle sur le papier de soie pour enlever l’excès de PBS sur le couvercle. Placez-le sur une solution secondaire de coloration des anticorps dans la chambre humide et ne l’exposez pas à la lumière en raison de la présence d’anticorps marqués par fluorescence dans la solution.
7. Incuber à nouveau le couvercle pendant 30 minutes à température ambiante. Veuillez toujours noter le côté du couvercle qui contient les cellules tout au long de ces étapes.
8. Après l’incubation, ramassez soigneusement le couvercle de la solution d’anticorps secondaire, puis trempez-le trois fois dans 1x PBS. De plus, appuyez sur le couvercle sur le papier de soie pour enlever l’excès de PBS sur le couvercle.
9. Placez 12 μL de réactif de montage Fluoromount-G sur une glissière en verre et placez soigneusement le couvercle taché (orienté vers le verre) sur le réactif de montage. Inverser la lame de verre sur du papier de soie, puis appuyer doucement.

5. Microscopie à fluorescence des cellules

1. Imagez les cellules colorées sous des filtres à champ lumineux (BF) et à fluorescence (IF) à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’une caméra CCD utilisant un objectif apochromatique 60x (huile) ou tout autre microscope avec une configuration similaire.

6. Quantification du chevauchement entre les protéines localisées re et les mélanosomes :

NOTE: Les étapes suivantes sont suivies pour la quantification du coefficient de chevauchement de Mander entre les protéines à l’aide du logiciel Fidji (téléchargeable gratuitement à partir du lien: https://imagej.net/software/fiji/). Utilisez l’image TIFF avec plusieurs canaux.

1. Ouvrez l’image brute. Accédez à l’option Image, sélectionnez Couleur | Divisez les canaux et utilisez les deux canaux pour l’analyse.
2. Ouvrez le plugin JACoP dans l’option Plugin.
3. Définissez le seuil pour les deux canaux de manière à ce que tous les points lumineux soient sélectionnés et que l’arrière-plan soit éliminé.
4. Accédez à l’option Analyse, sélectionnez les coefficients M1 et M2 pour obtenir le coefficient de chevauchement de Mander.
5. Appuyez sur l’option Analyser dans le plug-in JACoP et voyez le résultat qui affiche le coefficient de chevauchement de Mander.

7. Quantification du nombre tubulaire et de la longueur des endosomes de recyclage:

REMARQUE: Les étapes suivantes sont suivies pour la quantification du nombre et de la longueur des tubules à l’aide du logiciel Fidji.

1. Ouvrez l’option Aller à l’image brute, sélectionnez Couleur | Divisez les canaux et utilisez le canal souhaité pour l’analyse.
2. Accédez à nouveau à Image , sélectionnez Type | Convertir en image 8 bits.
3. Ensuite, allez dans Plugins, sélectionnez Analyser | Tubérence. Définissez la valeur sigma à 0,1075 . Appuyez sur OK.
4. Accédez à nouveau à Image , sélectionnez Type | Convertir en image 8 bits.
5. Aller à image | Ajuster | Seuil (Utilisez les mêmes valeurs de seuil pour toutes les images. Les images doivent avoir une intensité approximativement égale).
6. Aller à processus | | binaire Convertir en masque.
7. Accédez à Processus, sélectionnez Binaire, puis Squelette.
8. Allez dans Analyser, sélectionnez Squelette et choisissez Analyser le squelette. Dans les | de résultat et de sortie , sélectionnez (a) Calculer le chemin le plus court | (b) afficher des informations détaillées | (c) afficher le squelette étiqueté. Appuyez sur OK.
   REMARQUE: Le résultat s’ouvrira dans le format tabulaire. La colonne Longueur moyenne des branches indique la longueur de tous les différents tubules de la cellule sélectionnée (définir l’échelle pour obtenir des valeurs en micromètres).
9. Pour obtenir le nombre de tubules dans la cellule, accédez à Analyser, puis sélectionnez Analyser l’option Particule . Appuyez sur OK.
   REMARQUE: Dans les résultats obtenus, la colonne de comptage indique le nombre de tubules dans cette cellule particulière.
10. Enregistrez les données et analysez-les.

Résultats

Quantification de la localisation du mutant STX13Δ129 dans les mélanosomes
La microscopie par immunofluorescence de STX13 dans des mélanocytes de type sauvage de souris a montré que GFP-STX13WT était localisé sous forme de structures vésiculeuses et tubulaires et que GFP-STX13Δ129 était localisé sous forme de structures en forme d’anneau en plus de la surface cellulaire (Figure 1A). De plus, le...

Discussion

Les endosomes de recyclage sont une cohorte d’organites endocytaires, et ils interviennent dans le recyclage de la cargaison à la surface cellulaire dans tous les types de cellules21,22,23,24,25. Dans les types cellulaires spécialisés tels que les mélanocytes, ces organites détournent en partie leur voie de trafic vers les mélanosomes pour leur biogen?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022