המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

Summary

מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.

Abstract

מיחזור אנדוזומים (REs) הם אברונים צינוריים-ארסיים שנוצרו מאנדוזומים מוקדמים /מיון בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים. REs לספק את המטען ספציפי מלנוציט למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. חסימה בדור של REs, נצפתה במספר מוטציות של תסמונת הרמנסקי-Pudlak, גורמת hypopigmentation של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה (מתייחס למספר ולאורך) של REs שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות. במחקר זה, אנו שואפים למדוד את הדינמיקה RE באמצעות תושב SNARE STX13.

Introduction

ביוסינטזה של פיגמנטים מלנין מתרחשת מלנוזומים, אברון ספציפי מלנוציטים (LRO) כי קיים יחד עם ליזוזומים קונבנציונליים. המערכת האנדוציטית ממלאת תפקיד מרכזי בביוגנזה של מלנוזומים, הנדרשת לצבע עור והגנה פוטו-הגנתית מפני קרינה מייננת1,2,3. במהלך תהליך זה, אנזימי סינתזה מלנין ממוינים על אנדוזומים מוקדמים / מיון ולאחר מכן מועברים מלנוזומים מוקדמים באמצעות אנדוזומים צינוריים או אופניים הנקראים אנדוזומים מיחזור (REs)4,5,6,7,8,9,10. פילוח והיתוך של אברונים אלה לווסת את ההתבגרות של מלנומוזומים פיגמנטיים פונקציונליים לחלוטין7,11,12,13,14. פגמים בהיווצרות של אברונים אלה או מיון מטען לאברונים אלה גורמים לבקנות oculocutaneous ופנוטיפים קליניים אחרים, שנצפו תסמונת הרמנסקי-Pudlak15,16.

כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופיה כדי ללמוד ולנתח את REs. בשיטה זו, ניצלנו חלבון transmembrane, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 התב"ע המונה על מיחזור ^{אנדוזומים17} ומחזורים בין מיון אנדוזומים ומלנוזומים במלנוציטים12,18. יתר על כן, מחיקה של N-terminal לא מובנה דומיין רגולטורי (כלומר SynN או ^STX13Δ129) מאפשרת SNARE להיתקע melanosomes, אשר מודד את מסלול הסחר קדימה לכיוון ^melanosome12. השתמשנו בסמן אנדוסומאלי ידוע מיחזור Rab GTPase (Rab)11 במחקרים ^{שלנו14,19}. הדמיית פלואורסצנטיות של החלבונים GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ו- TYRP1 במלנוציטים מסוג בר ואחריו כימות הלוקליזציה היחסית שלהם תספק את הטבע והדינמיקה של REs בנוסף למיקודם למלנוזומים. לכן, זוהי טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לדמיין ולמדוד את הדינמיקה של REs במלנוציטים.

Protocol

הפרוטוקול כרוך זריעת מלנוציטים ואחריו טרנספקטו של plasmids. צעדים נוספים כוללים קיבעון, חיסונים, הדמיה וניתוח של התאים כדי למדוד את האורך והמספר של REs. התיאור המפורט של הפרוטוקול ניתן להלן.

1. זריעת מלנוציטים של עכברים על כיסויים שטופלו מראש

1. מצפים את כיסויי הזכוכית בצלחת פטרי (כלומר, 4 - 5 בצלחת 35 מ"מ) עם מטריצת ממברנה במרתף בינונית (1:20 במדיום RPMI מלא: RPMI + 10% חום מומת FBS + 1x גלוטמין + תערובת אנטיביוטיקה 1x) ולייבש אותו במכסה המנוע תרבית הרקמות במשך 15 דקות. יש לשטוף את כיסויי הכיסוי פעם אחת עם 1x PBS לפני השימוש.
2. שמור על מלנוציטים מסוג עכבר בר (melan-Ink4a-Arf-1 מ- C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^-/- עכברים, המתוארים ^ב-20 וזמינים בבנק תא הגנומיקה הפונקציונלי של Welcome Trust) בצלחת פטרי (כלומר, צלחת 35 או 60 מ"מ) בתוספת מדיום RPMI מלא.
   1. לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולהוסיף 0.5 או 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) פתרון עבור תאים טריפסינים. לדגור על התאים ב 37 °C (5 °F) במשך 2 - 5 דקות עבור הניתוק מן צלחת פטרי.
   2. הוסף 1 - 2 מ"ל של מדיום RPMI מלא, להשעות ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה.
3. צנטריפוגה השעיית התא ב 4 °C (5 °F), 376 x g במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend הכדור ב 1x PBS.
4. חזור על שלב הצנטריפוגה והגדל מחדש את התאים ב- 1 מ"ל של מדיום RPMI מלא.
5. זרע את התאים על קרום המרתף כיסויים בציפוי בינוני ב 50-60% conהשפעה (כ 6 x ¹⁰⁵ תאים על צלחת תרבית תאים 35 מ"מ המכיל 4 - 5 כיסויים). תמיד להוסיף 200 ננומטר של PMA (להוסיף 5 μL של מלאי עובד 40 μM phorbol 12-myristate 13-אצטט) להשעיית תא מצופה במדיום RPMI מלא.
6. לאחר זריעה, לדגור על הצלחת ב 37 °C (50 °F) במשך 12-24 שעות.

2. טרנספקטציה של תאים עם פלסמידים STX13

1. השתמש ריאגנטים הבאים: pEGFP-C1-STX13WT ו pEGFP-C1-STX13Δ129 (מתואר ^ב12). mCherry-Rab11, הייתה מתנה חביבה מגראסה רפוסו, מכון קירי, פריז (מתואר ^{בהפניה19}). נוגדן נגד TYRP1 מ-ATCC (TA99).
2. לאחר 12 - 24 שעות של זריעה, לבצע חלוקה של התאים עם plasmids באמצעות ריאגנט transfection מבוסס שומנים בדם. עבור צלחת 35 מ"מ, לקחת 5 μL של ריאגנט transfection ב 250 μL של OPTI-MEM בינוני בצינור microcentrifuge ולקחת כ 200 ננוגרם של כל plasmid ב 250 μL של OPTI-MEM.
3. לדגור על הצינורות המכילים DNA ואת ריאגנט transfection במשך 5 דקות. לערבב ללא pipetting חוזר (נפח כולל יהיה כ 500 μL). דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בצע הקשה ידנית של הצינור כל 10 דקות במשך 30 דקות ב RT.
4. במהלך הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS, פעם אחת עם OPTI-MEM ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של OPTI-MEM לתאים.
5. לאחר 30 דקות של דגירה, להוסיף את תערובת ריאגנט-DNA transfection לתאים בצורה טיפה חכם על ידי כיסוי המנה.
6. לדגור על התאים ב 37 °C (6 °F) במשך 6 שעות. שאפו את המדיום OPTI-MEM עם ריאגנט טרנס-זיהום והוסיפו מדיום RPMI מלא בתוספת 200 ננומטר של PMA.
7. לדגור על התאים ב 37 °C (55 °F) עבור 48 שעות.

3. קיבעון התאים

הערה: ההליך הבא מבוצע מחוץ למכסה המנוע של תרבית הרקמות.

1. לאחר 48 שעות של transfection, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולאחר מכן לתקן את התאים עם 3% פורמלדהיד (מוכן טרי 1x PBS) במשך 30 דקות.
2. לאחר קיבעון, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS ולאחסן את כיסויים ב 1x PBS עד לשימוש נוסף. לחלופין, תאים יכולים להיות מותקנים על שקופיות זכוכית (ראה להלן) או מאוחסנים ב 4 °C (70 °F).

4. חיסונים של התאים

1. מכינים תא לח: מניחים חתיכת סרט פרפין חתוכה על נייר סינון לח בצלחת פטרי, מכוסה בנייר אלומיניום.
2. הכן 25 μL של פתרון נוגדנים ראשוני (0.2% סאפונין ב 1x PBS, 0.1% BSA ב 1x PBS ו 0.02% נתרן אזיד ב 1x PBS). הוסף נוגדן בדילול של 1: 200. הוסף פתרון זה כטיפה על סרט פרפין בחדר לח.
3. הרימו בזהירות את כיסוי המכסה במלקחיים, הפוך אותו על טיפה זו של תמיסה מכתימה נוגדנים ראשונית ולאחר מכן לכסות את המכסה של התא לח. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
4. באופן דומה, להכין את פתרון הנוגדנים המשני בדילול של 1:500 ולהניח אותו על סרט פרפין ליד כיסוי בתא לח. להכתמת הגרעין, הוסף DAPI (1:20,000 עד 1:30,000) לפתרון.
5. בעזרת מלקחיים, הרימו בזהירות את כיסוי הכיסוי מתמיסת הנוגדנים העיקרית וטובלים אותו שלוש פעמים ב-1x PBS (בכוס זכוכית).
6. הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי. מניחים אותו על תמיסת כתמי נוגדנים משנית בתא הלח ולא חושפים אותו לאור בשל נוכחותם של נוגדנים מתויגים פלואורסצנטית בתמיסה.
7. לדגור על כיסוי שוב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אנא שימו לב תמיד לצד כיסוי הכולל את התאים לאורך שלבים אלה.
8. לאחר הדגירה, בזהירות להרים את כיסוי מפתרון הנוגדנים המשני ולאחר מכן לטבול אותו שלוש פעמים ב 1x PBS. יתר על כן, הקש על כיסוי על נייר טישו כדי להסיר את PBS עודף על כיסוי.
9. מניחים 12 μL של ריאגנט הרכבה פלואורומאונט-G על מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את כיסויי הצבע (הפונים לכיוון הזכוכית) על ריאגנט הרכבה. הפוך את שקופית הזכוכית על נייר טישו ולאחר מכן לחץ בעדינות.

5. מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של התאים

1. צלם את התאים המוכתמים תחת מסנני שדה בהיר (BF) ופלואורסצנטיות (IF) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במצלמת CCD באמצעות מטרה אפיכרומטית 60x (שמן) או כל מיקרוסקופ אחר עם תצורה דומה.

6. כימות חפיפה בין החלבונים המותאמים לשפות רה ומלנוזומים:

הערה: השלבים הבאים מתבצעים לכימות מקדם החפיפה של מנדר בין החלבונים באמצעות תוכנת פיג'י (להורדה חופשית מהקישור: https://imagej.net/software/fiji/). השתמש בתמונת TIFF עם ערוצים מרובים.

1. פתח את התמונה הגולמית. עבור אל האפשרות תמונה, בחר צבע | פצל ערוצים והשתמש בשני הערוצים לניתוח.
2. פתח את תוסף JACoP באפשרות תוסף.
3. הגדר את הסף עבור שני הערוצים כך שכל הנקודות הבהירות נבחרו והרקע יבוטל.
4. עבור אל האפשרות ניתוח, בחר מקדמי M1 ו- M2 לקבלת מקדם החפיפה של מנדר.
5. לחץ על האפשרות נתח בתוסף JACoP וראה את התוצאה המציגה את מקדם החפיפה של מנדר.

7. כימות המספר והאורך הצינוריים של אנדוזומים:

הערה: השלבים הבאים מתבצעים לכימות המספר והאורך של הצינורות באמצעות תוכנת פיג'י.

1. פתחו את האפשרות 'עבור לתמונה' של התמונה, בחרו 'צבע |' פצל ערוצים והשתמש בערוץ הרצוי לניתוח.
2. עבור שוב לתמונה , בחר הקלד | המר לתמונת 8 סיביות.
3. לאחר מכן עבור אל תוספים, בחר ניתוח | צינורות. הגדר את ערך סיגמא ב- 0.1075 . לחץ על בסדר.
4. עבור שוב לתמונה , בחר הקלד | המר לתמונת 8 סיביות.
5. עבור אל | תמונה כוונון | Threshold (השתמש באותם ערכי סף עבור כל התמונות). תמונות צריכות להיות בעוצמה שווה בקירב).
6. עבור אל עיבוד | | בינארי המר למסיכה.
7. עבור אל תהליך, בחר בינארי ולאחר מכן בחר שלד.
8. עבור אל ניתוח, בחר שלד ובחר ניתוח שלד. בתוצאה ובפלט | בחר (א) חשב את הנתיב הקצר ביותר | (ב) להציג מידע מפורט | (ג) שלד תצוגה שכותרתו. לחץ על בסדר.
   הערה: התוצאה תיפתח בתבנית המנוולת בכרטיסיות. העמודה של אורך הענף הממוצע מציגה את אורך כל הצינורות השונים בתא שנבחר (הגדר קנה מידה לקבלת ערכים במיקרומטרים).
9. לקבלת מספר הצינורות בתא, עבור אל ניתוח ובחר באפשרות נתח חלקיקים . לחץ על בסדר.
   הערה: בתוצאות שהושגו, עמודת הספירה מציגה את מספר הצינורות בתא מסוים זה.
10. שמור את הנתונים וניתח.

תוצאות

כימות של לוקליזציה מוטנטית STX13Δ129 למלנוזומים
מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של STX13 במלנוציטים מסוג בר עכברים הראתה GFP-STX13WT מקומי כמבנים ריסקוליים וצינוריים ו- GFP-STX13Δ129 המותאמים לשפות מקומיים כמבנים דמויי טבעת בנוסף למשטח התא (איור 1A).

Discussion

מיחזור אנדוזומים הם קבוצה של אברונים אנדוציטיים, והם מתווכים את מיחזור המטען למשטח התא בכל סוגי התאים21,22,23,24,25. בסוגי תאים מיוחדים כגון מלנוציטים, אברונים אלה מסיטים חלקית את נתיב הסחר שלהם לכיוון המל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022