El ensayo basado en microscopía para estudiar y analizar los endosomas de reciclaje utilizando el tráfico de SNARE

Resumen

Los endosomas de reciclaje forman parte de la red tubular endosomal. Aquí presentamos un método para cuantificar la dinámica del reciclaje de endosomas utilizando GFP-STX13 como marcador de orgánulos.

Resumen

Los endosomas de reciclaje (TE) son orgánulos tubulares-vesiculares generados a partir de endosomas tempranos / clasificadores en todos los tipos de células. Estos orgánulos juegan un papel clave en la biogénesis de los melanosomas, un orgánulo relacionado con los lisosomas producido por los melanocitos. Los TE entregan la carga específica de melanocitos a los melanosomas prematuros durante su formación. El bloqueo en la generación de TE, observado en varios mutantes del síndrome de Hermansky-Pudlak, resulta en hipopigmentación de la piel, el cabello y los ojos. Por lo tanto, estudiar la dinámica (consulte el número y la longitud) de los TE es útil para comprender la función de estos orgánulos en condiciones normales y de enfermedad. En este estudio, nuestro objetivo es medir la dinámica de RE utilizando un SNARE STX13 residente.

Introducción

La biosíntesis de pigmentos de melanina ocurre en los melanosomas, un orgánulo relacionado con lisosomas específicos de melocitos (LRO) que coexiste con los lisosomas convencionales. El sistema endocítico juega un papel clave en la biogénesis de los melanosomas, necesarios para el color de la piel y la fotoprotección frente a las radiaciones ionizantes1,2,3. Durante este proceso, las enzimas sintetizadoras de melanina se clasifican en endosomas tempranos y luego se transportan a melanosomas prematuros a través de endosomas tubulares o vesiculares llamados endosomas de reciclaje (TE)4,5,6,7,8,9,10. La focalización y fusión de estos orgánulos regulan la maduración de melanosomas pigmentados completamente funcionales7,11,12,13,14. Los defectos en la formación de estos orgánulos o la clasificación de carga a estos orgánulos causan albinismo oculocutáneo y otros fenotipos clínicos, observados en el síndrome de Hermansky-Pudlak15,16.

Aquí describimos una técnica simple basada en microscopía para estudiar y analizar los TE. En este método, hemos aprovechado una proteína transmembrana, la sintaxina Qa-SNARE (STX)13 que reside en el reciclaje de ^endosomas17 y ciclos entre clasificación de endosomas y melanosomas en melanocitos12,18. Además, la eliminación del dominio regulador no estructurado N-terminal (es decir, SynN o ^STX13Δ129) permite que la SNARE se atasque en los melanosomas, lo que mide la ruta de tráfico hacia el melanosoma12. Hemos utilizado un conocido marcador endosomal de reciclaje Rab GTPasa (Rab)11 en nuestros ^{estudios14,19}. Las imágenes de fluorescencia de las proteínas GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 y TYRP1 en melanocitos de tipo silvestre seguidas de la cuantificación de su localización relativa proporcionarán la naturaleza y la dinámica de los ER, además de su orientación a los melanosomas. Por lo tanto, esta es una técnica simple que se puede utilizar para visualizar y medir la dinámica de los TE en los melanocitos.

Protocolo

El protocolo consiste en la siembra de melanocitos seguida de la transfección de los plásmidos. Otros pasos incluyen fijación, inmunotinción, imágenes y análisis de las células para medir la longitud y el número de ER. La descripción detallada del protocolo se da a continuación.

1. Siembra de melanocitos de ratón en fundas pretratadas

1. Cubra las cubiertas de vidrio en una placa de Petri (es decir, 4 - 5 en una placa de 35 mm) con medio de matriz de membrana basal (1:20 en medio RPMI completo: RPMI + FBS inactivado al calor al 10% + 1x Glutamina + 1x Mezcla de antibióticos) y séquelo en la campana de cultivo de tejidos durante 15 min. Lave las fundas una vez con 1x PBS antes de usar.
2. Mantener los melanocitos de ratón de tipo salvaje (melan-Ink4a-Arf-1 de ratones C57BL/6J, a /a, Ink4a-Arf^-/- , descritos ^en20 y disponibles en The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) en una placa de Petri (es decir, plato de 35 o 60 mm) complementada con medio RPMI completo.
   1. Lave las células dos veces con 1x PBS y agregue 0.5 o 1 ml de solución de tripsina-EDTA (0.25%) para las células tripsinizantes. Incubar las células a 37 °C durante 2 - 5 min para el desprendimiento de la placa de Petri.
   2. Agregue 1 - 2 ml de medio RPMI completo, suspenda y luego transfiera las células a un tubo de centrífuga.
3. Centrifugar la suspensión celular a 4 °C, 376 x g durante 5 min y luego volver a suspender el pellet en 1x PBS.
4. Repita el paso de centrifugación y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio RPMI completo.
5. Sembrar las células en la membrana basal con cubiertas de recubrimiento medio al 50-60% de confluencia (aproximadamente 6 x ¹⁰⁵ células en una placa de cultivo celular de 35 mm que contiene 4 - 5 fundas). Añadir siempre 200 nM de PMA (añadir 5 μL de material de trabajo 40 μM de forbol 12-miristato 13-acetato) a la suspensión celular chapada en medio RPMI completo.
6. Después de la siembra, incubar la placa a 37 ° C durante 12-24 h.

2. Transfección de células con los plásmidos STX13

1. Utilice los siguientes reactivos: pEGFP-C1-STX13WT y pEGFP-C1-STX13Δ129 (descritos ^en12). mCherry-Rab11, fue un amable regalo de Graça Raposo, Institut Curie, París (descrito en la ^referencia19). Anticuerpo anti-TYRP1 de ATCC (TA99).
2. Después de 12 a 24 h de siembra, transfectar las células con plásmidos utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos. Para un plato de 35 mm, tome 5 μL del reactivo de transfección en 250 μL de medio OPTI-MEM en un tubo de microcentrífuga y tome aproximadamente 200 ng de cada plásmido en 250 μL de OPTI-MEM.
3. Incubar los tubos que contienen ADN y el reactivo de transfección durante 5 min. Mezclar sin pipetear repetidamente (el volumen total será de aproximadamente 500 μL). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Realice golpeteos manuales del tubo cada 10 minutos durante 30 minutos en RT.
4. Durante la incubación, lave las células dos veces con 1x PBS, una vez con OPTI-MEM y luego agregue 1 ml de OPTI-MEM a las células.
5. Después de 30 minutos de incubación, agregue la mezcla de reactivo de transfección y ADN a las células de manera superficial cubriendo el plato.
6. Incubar las células a 37 °C durante 6 h. Aspire el medio OPTI-MEM con reactivo de transfección y agregue medio RPMI completo suplementado con 200 nM de PMA.
7. Incubar las células a 37 °C durante 48 h.

3. Fijación de las células

NOTA: El siguiente procedimiento se realiza fuera de la campana de cultivo de tejidos.

1. Después de 48 h de transfección, lave las células dos veces con 1x PBS y luego fije las células con 3% de formaldehído (recién preparado en 1x PBS) durante 30 min.
2. Después de la fijación, lave las células dos veces con 1x PBS y guarde las fundas en 1x PBS hasta su uso posterior. Alternativamente, las celdas pueden montarse en portaobjetos de vidrio (ver más abajo) o almacenarse a 4 °C.

4. Inmunotinción de las células

1. Prepare una cámara húmeda: coloque la pieza cortada con película de parafina sobre papel de filtro húmedo en una placa de Petri, cubierta con papel de aluminio.
2. Preparar 25 μL de solución primaria de anticuerpos (saponina al 0,2% en 1x PBS, 0,1% BSA en 1x PBS y 0,02% azida de sodio en 1x PBS). Añadir anticuerpos a una dilución de 1:200. Agregue esta solución como una gota en una película de parafina en la cámara húmeda.
3. Levante con cuidado el cobertor con fórceps, invierta sobre esta gota de solución de tinción de anticuerpos primarios y luego cubra la tapa de la cámara húmeda. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Del mismo modo, prepare la solución secundaria de anticuerpos a una dilución de 1:500 y colóquela en una película de parafina junto a la cubierta en la cámara húmeda. Para teñir el núcleo, agregue DAPI (1:20.000 a 1:30.000) a la solución.
5. Usando fórceps, recoja cuidadosamente el cobertor de la solución de anticuerpos primarios y sumérjalo tres veces en 1x PBS (en un vaso de precipitados de vidrio).
6. Toque el trozo de cubierta en papel de seda para eliminar el exceso de PBS en el lape de cubierta. Colóquelo en una solución secundaria de tinción de anticuerpos en la cámara húmeda y no lo exponga a la luz debido a la presencia de anticuerpos marcados fluorescentemente en la solución.
7. Incubar el coverslip de nuevo durante 30 min a temperatura ambiente. Por favor, siempre mantenga una nota en el lado de la cubierta que tiene las celdas a lo largo de estos pasos.
8. Después de la incubación, recoja cuidadosamente el cubrehojas de la solución secundaria de anticuerpos y luego sumérjalo tres veces en 1x PBS. Además, toque el trozo de cubierta en papel de seda para eliminar el exceso de PBS en el lape de cubierta.
9. Coloque 12 μL de reactivo de montaje Fluoromount-G en un portaobjetos de vidrio y coloque cuidadosamente la cubierta teñida (mirando hacia el vidrio) en el reactivo de montaje. Invierta el portaobjetos de vidrio sobre papel de seda y luego presione suavemente.

5. Microscopía de fluorescencia de las células

1. Tome una imagen de las células teñidas bajo filtros de campo brillante (BF) y fluorescencia (IF) utilizando un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una cámara CCD utilizando un objetivo apocromático 60x (aceite) o cualquier otro microscopio con una configuración similar.

6. Cuantificación de la superposición entre las proteínas localizadas RE y los melanosomas:

NOTA: Se siguen los siguientes pasos para la cuantificación del coeficiente de superposición de Mander entre las proteínas utilizando el software de Fiji (descargable gratuitamente desde el enlace: https://imagej.net/software/fiji/). Utilice la imagen TIFF con varios canales.

1. Abra la imagen sin procesar. Vaya a la opción Imagen, seleccione Color | Divida los canales y utilice los dos canales para el análisis.
2. Abra el complemento JACoP en la opción Complemento.
3. Establezca el umbral para ambos canales de modo que se seleccionen todos los puntos brillantes y se elimine el fondo.
4. Vaya a la opción Análisis, seleccione los coeficientes M1 y M2 para obtener el coeficiente de superposición de Mander.
5. Presione la opción Analizar en el complemento JACoP y vea el resultado que muestra el coeficiente de superposición de Mander.

7. Cuantificación del número y la longitud tubular de los endosomas de reciclaje:

NOTA: Se siguen los siguientes pasos para la cuantificación del número y la longitud de los túbulos utilizando el software de Fiji.

1. Abra la imagen sin procesar Ir a la opción Imagen, seleccione Color | Divida los canales y utilice el canal deseado para el análisis.
2. Vaya a Imagen de nuevo, seleccione Tipo | Convertir a imagen de 8 bits.
3. Luego vaya a Plugins, seleccione Analizar | Tubeidad. Establezca el valor sigma en 0.1075 . Pulse Ok.
4. Vaya a Imagen de nuevo, seleccione Tipo | Convertir a imagen de 8 bits.
5. Ir a imagen | Ajustar | Umbral (Utilice los mismos valores de umbral para todas las imágenes. Las imágenes deben tener aproximadamente la misma intensidad).
6. Ir a procesar | | binaria Convertir en máscara.
7. Vaya a Procesar, seleccione Binario y luego seleccione Esqueletizar.
8. Vaya a Analizar, seleccione Esqueleto y elija Analizar esqueleto. En la | de resultados y salidas , seleccione ( a) Calcule la ruta más corta | (b) muestre información detallada | (c) muestre el esqueleto etiquetado. Pulse Ok.
   NOTA: El resultado se abrirá en el formato tabulado. La columna de Longitud media de rama muestra la longitud de todos los diferentes túbulos de la celda seleccionada (escala establecida para obtener valores en micrómetros).
9. Para obtener el número de túbulos en la celda, vaya a Analizar y seleccione la opción Analizar partícula . Pulse Ok.
   NOTA: En los resultados obtenidos, la columna de recuento muestra el número de túbulos en esa célula en particular.
10. Guarde los datos y analice.

Resultados

Cuantificación de la localización mutante ^STX13Δ129 a los melanosomas
La microscopía de inmunofluorescencia de STX13 en melanocitos de tipo salvaje de ratón mostró GFP-STX13WT localizado como estructuras vesiculares y tubulares y GFP-STX13Δ129 localizado como estructuras en forma de anillo además de la superficie celular (Figura 1A). Además, GFP-STX13Δ129 en forma de anillo intracelula...

Discusión

Los endosomas de reciclaje son una cohorte de orgánulos endocíticos, y median el reciclaje de la carga a la superficie celular en todos los tipos de células21,22,23,24,25. En tipos celulares especializados como los melanocitos, estos orgánulos desvían parcialmente su ruta de tráfico hacia los melanosomas para su biogénesis3,16,26...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022