SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석

요약

재활용 내분은 내피 관 네트워크의 일부입니다. 여기서는 GFP-STX13을 세포구마커로 사용하여 재활용 내종의 역학을 정량화하는 방법을 제시합니다.

초록

재활용 내분 (REs)은 모든 세포 유형의 초기 /정렬 내분비에서 생성 된 관 형 혈관 세포기관입니다. 이 세포기관은 멜라노좀의 생물 발생에 중요한 역할을, 멜라닌 세포에 의해 생성 된 리소솜 관련 세포기관. REs는 멜라닌세포 특이적 화물을 형성 하는 동안 조기 멜라노솜에 전달합니다. 헤르만스키-푸들락 증후군의 여러 돌연변이체에서 관찰되는 REs의 생성에 막힘은 피부, 모발 및 눈의 저색소침착을 초래합니다. 따라서, REs의 역학(수 및 길이 참조)을 연구하는 것은 정상 및 질병 조건에서 이러한 세포기관의 기능을 이해하는 데 유용하다. 이 연구에서는 상주 SNARE STX13을 사용하여 RE 역학을 측정하는 것을 목표로합니다.

서문

멜라닌 안료의 생합성은 멜라노솜, 멜라노세포 특이리소성 세포질(LRO)에서 발생하며, 이는 기존의 리소좀과 공존한다. 내세포 시스템은 멜라노솜의 생물 발생에 중요한 역할을하며, 피부 색및 이온화 방사선에 대한 포토보호에 요구된다^1,2,3. 이 과정에서 멜라닌 합성 효소는 초기/선별 내분모에 분류된 다음, 내분비(REs)^{4,5,6,7,8,9,10}이라고 불리는 관 또는 생구 내분모를 통해 조기 멜라노좀으로 이송된다. 이러한 세포기관의 표적화 및 융합은 완전 기능성 색소멜라노솜^{7,11,12,13,14}의 성숙을 조절한다. 이러한 세포기관 또는 화물 선별의 형성에 결함이 있는 것은 허만스키-푸들락 증후군^15,16에서 관찰된 오큘로쿠탈 백색증 및 그밖 임상 표현형을 일으키는 원인이 됩니다.

여기에서 우리는 REs를 연구하고 분석하기 위하여 간단한 현미경 기지를 둔 기술을 기술합니다. 이 방법으로, 우리는 멜라노세포^12,18에서 내모와 멜라노솜을 분류하는 사이 내모성 및 멜라노솜을 분류하는 것 사이 내모성 ¹⁷ 및 주기에 상주하는 막 단백질, Qa-SNARE Syntaxin (STX)¹³을 이용했습니다. 또한, N단비정형 규제 도메인(즉 SynN 또는 STX13Δ129)을 삭제하면 SNARE가 멜라노솜에 갇히게 되어 멜라노솜¹²를 향한 전방 인신매매 경로를 측정할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 알려진 재활용 내피 마커 Rab GTPase (Rab)11을 사용했습니다^14,19. 단백질 GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab129 및 TYRP1의 형광 이미징은 야생형 멜라노사이클의 양량화에 이어 상대적 국소화의 정량화에 따라 멜라노솜에 대한 표적화 이외에 REs의 특성과 역학을 제공할 것이다. 따라서, 이것은 멜라닌세포에서 REs의 역학을 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술이다.

프로토콜

프로토콜은 플라스미드의 질산순환 에 이어 멜라닌세포의 파종을 포함한다. 추가 단계는 REs의 길이 및 수를 측정하기 위하여 세포의 고정, 면역 염색, 화상 진찰 및 분석을 포함합니다. 프로토콜에 대한 자세한 설명은 아래에 있습니다.

1. 미리 처리 된 커버립에 마우스 멜라닌 세포의 파종

1. 유리 커버를 페트리 접시(즉, 35mm 접시에 4-5)에 지하 막 매트릭스 배지(완전 RPMI 배지1:20: RPMI + 10% 열 비활성화 FBS + 1x 글루타민 + 1x 항생제 믹스)로 코팅하고 조직 배양 후드에서 15분 동안 건조시킵니다. 사용하기 전에 1x PBS로 커버립을 한 번 씻으시면 됩니다.
2. 페트리 디쉬(예: 35 mm 또는 60mm 접시)에서 야생형 마우스 멜라닌세포(C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^/-- 마우스)를 유지관리합니다.
   1. 1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 트립신-EDTA(0.25%) 용액의 0.5 또는 1mL을 트립시화 세포를 추가합니다. 페트리 접시로부터 분리를 위해 세포를 37°C에서 2-5분 동안 배양한다.
   2. 완전한 RPMI 배지의 1 - 2 mL을 추가한 다음 세포를 원심분리기 튜브로 옮기십시오.
3. 세포 현탁액을 4°C, 376 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 1x PBS로 펠릿을 다시 분리합니다.
4. 원심분리 단계를 반복하고 완전한 RPMI 배지의 1mL에서 세포를 다시 분리한다.
5. 지하 막 중간 코팅 커버립의 세포를 50-60% 수렴성(4-5 커버립을 함유한 ^35mm 세포 배양 접시에 약 6 x 105 셀). 항상 완전한 RPMI 매체에서 도금 된 셀 서스펜션에 PMA 200 nM (작업 재고 40 μM phorbol 12-myristate 13-acetate의 5 μL을 추가)를 추가하십시오.
6. 파종 후, 플레이트를 12-24h에 37°C로 배양한다.

2. STX13 플라스미드로 세포의 침입

1. pEGFP-C1-STX13WT 및 pEGFP-C1-STX13Δ129(ⁱⁿ¹²에 설명)를 사용합니다. mCherry-Rab11은 파리 인스티투트 큐리(참조¹⁹)의 그라샤 라포소(Graça Raposo)의 친절한 선물이었습니다. ATCC (TA99)로부터 항 TYRP1 항체.
2. 12 -24 h의 파종 후, 지질 계 의 형질 전환 시약을 사용하여 플라스미드로 세포를 트랜스펙트합니다. 35mm 접시의 경우, 마이크로센트심분리기 튜브에서 OPTI-MEM 배지의 250 μL에서 5 μL의 트랜스펙트 시약을 취하고 OPTI-MEM의 250 μL에서 각 플라스미드의 약 200 ng를 복용하십시오.
3. DNA와 트랜스페트 시약을 포함하는 튜브를 5분 동안 배양합니다. 반복 된 파이펫팅없이 혼합 (총 부피는 약 500 μL될 것입니다). 실온에서 30분 동안 배양하십시오. RT에서 30분 동안 10분마다 튜브를 손도청을 수행합니다.
4. 인큐베이션 하는 동안, 1 x PBS와 함께 두 번 세포를 세척, 한 번 OPTI-MEM와 함께 다음 세포에 OPTI-MEM의 1 mL를 추가.
5. 30분 동안 배양을 후, 접시를 덮음으로써 세포에 트랜스펙트 시약-DNA 믹스를 첨가한다.
6. 세포를 37°C에서 6시간 동안 배양한다. TRANSFection 시약으로 OPTI-MEM 배지를 흡인하고 PMA 200 nM으로 보충된 완전한 RPMI 배지를 추가합니다.
7. 세포를 37°C에서 48h로 배양한다.

3. 셀 고정

참고: 다음 절차는 조직 배양 후드 외부에서 수행됩니다.

1. 48h의 트랜스펙트 후, 1x PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 30 분 동안 3 % 포름 알데히드 (1 x PBS로 갓 준비)로 세포를 고정합니다.
2. 고정 후, 1x PBS로 셀을 두 번 씻고 추가 사용까지 1x PBS에 커버립을 보관하십시오. 또는, 셀은 유리 슬라이드 (아래 참조)에 장착하거나 4 ° C에 저장 될 수 있습니다.

4. 세포의 면역 염색

1. 습한 챔버 준비: 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에 촉촉한 필터 용지에 파라핀 필름 컷 피스를 배치합니다.
2. 1차 항체 용액 25μL(1x PBS에서 0.2%, PBS에서 0.1%, PBS1x에서 0.02%, PBS에서 0.02% 나트륨 아지드)를 준비한다. 1:200의 희석시 항체를 추가합니다. 습한 챔버의 파라핀 필름에 드롭으로이 솔루션을 추가합니다.
3. 조심스럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올리고, 1 차적인 항체 염색 용액의 이 방울에 그것을 반전한 다음 습한 챔버의 뚜껑을 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
4. 마찬가지로, 1:500의 희석시 이차 항체 용액을 준비하고 습한 챔버의 커버슬립 옆에 있는 파라핀 필름에 놓는다. 핵 염색을 위해, 용액에 DAPI(1:20,000 ~ 1:30,000)를 추가한다.
5. 집게를 사용하여, 조심스럽게 1 차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1 x PBS (유리 비커에서)에 세 번 찍어.
6. 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거합니다. 습한 챔버에 이차 항체 염색 용액에 배치하고 용액에 형광 태그 항체의 존재로 인해 빛에 노출하지 않습니다.
7. 실온에서 30분 동안 커버슬립을 다시 배양합니다. 항상 이러한 단계 전체에 걸쳐 세포가 있는 커버슬립의 측면을 주의하십시오.
8. 인큐베이션 후, 조심스럽게 이차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1 x PBS에 세 번 찍어. 또한, 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거한다.
9. 플루오로마운트-G 장착 시약 12μL을 유리 슬라이드에 놓고 스테인드 커버슬립(유리쪽으로 향)을 장착 시약위에 조심스럽게 놓습니다. 티슈 페이퍼의 유리 슬라이드를 반전한 다음 부드럽게 누릅니다.

5. 세포의 형광 현미경 검사

1. 60x(오일) 정색 목표 또는 유사한 구성을 가진 다른 현미경을 사용하여 CCD 카메라를 장착한 반전형 형광 현미경을 사용하여 밝은 필드(BF) 및 형광(IF) 필터 하에서 염색된 세포를 이미지화한다.

6. RE 국소화 된 단백질과 멜라노솜 사이의 중첩의 정량화 :

참고: 다음 단계는 피지 소프트웨어를 사용하여 단백질 사이의 Mander의 중복 계수의 정량화를 위해 다음과 같습니다 (링크에서 자유롭게 다운로드 할 수 있습니다: https://imagej.net/software/fiji/). 여러 채널의 TIFF 이미지를 사용합니다.

1. 원시 이미지를 엽니다. 이미지 옵션으로 이동하여 색상 | 선택합니다. 채널을 분할하고 분석을 위해 두 채널을 사용합니다.
2. 플러그인 옵션에 JACoP 플러그인 을 엽니다.
3. 모든 밝은 반점이 선택되고 배경이 제거될 수 있도록 두 채널모두에 대한 임계값을 설정합니다.
4. 분석 옵션으로 이동하여 M1 및 M2 계수를 선택하여 Mander의 중복 계수를 얻습니다.
5. JACoP 플러그인에서 분석 옵션을 누르고 맨더의 중복 계수를 표시하는 결과를 확인합니다.

7. 재활용 내성자의 관 수와 길이의 정량화:

참고: 다음 단계는 피지 소프트웨어를 사용하여 튜블러의 수와 길이의 정량화를 위해 다음과 같습니다.

1. 원시 이미지 이미지 로 이동 옵션을 열고 색상 | 채널을 분할 하고 분석을 위해 원하는 채널을 사용합니다.
2. 다시 이미지로 이동하여 | 유형 선택 8비트 이미지로 변환합니다.
3. 그런 다음 플러그인으로 이동하여 분석 | 선택합니다. 튜브. 시그마 값을 0.1075로 설정합니다. 확인을 누르고.
4. 다시 이미지로 이동하여 | 유형 선택 8비트 이미지로 변환합니다.
5. 이미지 | 조정 | 임계값(모든 이미지에 대해 동일한 임계값을 사용합니다. 이미지는 대략 동일한 강도를 가져야 합니다).
6. 프로세스 | 바이너리 | 마스크로 변환합니다.
7. 프로세스로 이동하여 바이너리를 선택한 다음 스켈레톤화를 선택합니다.
8. 분석으로 이동하여 스켈레톤을 선택하고 스켈레톤 분석을 선택합니다. 결과 및 출력 | 선택(a)| 가장 짧은 경로를 계산하면 |(c) 표시 표시 골격에 대한 자세한 정보를 보여 준다. 확인을 누르고.
   참고: 결과는 표고된 형식으로 열립니다. 평균 분기 길이의 열은 선택한 셀의 모든 다른 튜블러의 길이를 보여 주며(마이크로미터에서 값을 얻기 위한 설정 된 배율).
9. 셀의 튜블 수를 얻기 위해 분석으로 이동하여 파티클 분석 옵션을 선택합니다. 확인을 누르고.
   참고: 얻은 결과에서 카운트 열에는 해당 셀의 튜벌레 수가 표시됩니다.
10. 데이터를 저장하고 분석합니다.

결과

^STX13Δ129 돌연변이 국소화의 정량화
마우스 야생형 멜라노사이클로 STX13의 면역형 현미경검사는 GFP-STX13WT를 세포 표면 이외에 링형 구조로 국소화한 결과 및 관구조 및 GFP-STX13Δ129를 나타냈다(도 1A). 또한, 세포내 고리 같은 GFP-STX13Δ129는 멜라노이트 단백질 TYRP1(도 1A) 및 밝은 필드 이미지 ...

토론

재활용 내시경은 내세포 소기관의 코호트이며, 모든 세포 유형^{21,22,23,24,25}에서 화물의 재활용을 세포 표면으로 중재한다. 멜라닌 세포와 같은 전문적인 세포 모형에서, 이 세포기관은 부분적으로 그들의 생물 발생을 위한 melanosomes를 향해 그들의 인신 매매 경로를 전환

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022