Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking

Zusammenfassung

Recycling-Endosomen sind Teil des endosomalen tubulären Netzwerks. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Dynamik von Recycling-Endosomen mit GFP-STX13 als Organellenmarker vor.

Zusammenfassung

Recycling-Endosomen (REs) sind röhrenförmig-vesikuläre Organellen, die aus frühen/sortierenden Endosomen in allen Zelltypen erzeugt werden. Diese Organellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Biogenese von Melanosomen, einer Lysosom-verwandten Organelle, die von Melanozyten produziert wird. REs liefern die Melanozyten-spezifische Fracht während ihrer Bildung an vorzeitige Melanosomen. Eine Blockade bei der Erzeugung von REs, die bei mehreren Mutanten des Hermansky-Pudlak-Syndroms beobachtet wird, führt zu einer Hypopigmentierung von Haut, Haaren und Auge. Daher ist das Studium der Dynamik (siehe Anzahl und Länge) von REs nützlich, um die Funktion dieser Organellen unter normalen und Krankheitsbedingungen zu verstehen. In dieser Studie wollen wir die RE-Dynamik mit einem residenten SNARE STX13 messen.

Einleitung

Die Biosynthese von Melaninpigmenten erfolgt in Melanosomen, einer melanozytenspezifischen Lysosomen-verwandten Organelle (LRO), die mit herkömmlichen Lysosomen koexistiert. Das endozytäre System spielt eine Schlüsselrolle bei der Biogenese von Melanosomen, die für die Hautfarbe und den Strahlenschutz gegen ionisierende Strahlung erforderlich ^ist1,2,3. Während dieses Prozesses werden die melaninsynthetisierenden Enzyme auf frühen / sortierenden Endosomen sortiert und dann durch tubuläre oder vesikuläre Endosomen, die recycling-Endosomen (REs) genannt werden, zu vorzeitigen Melanosomen transportiert 4,5,6,7,8,9,10. Das Targeting und die Fusion dieser Organellen regulieren die Reifung voll funktionsfähiger pigmentierter Melanosomen7,11,12,13,14. Defekte bei der Bildung dieser Organellen oder der Ladungssortierung zu diesen Organellen verursachen okulokutanen Albinismus und andere klinische Phänotypen, die beim Hermansky-Pudlak-Syndrom beobachtet ^wurden15,16.

Hier beschreiben wir eine einfache mikroskopiebasierte Technik, um die REs zu untersuchen und zu analysieren. Bei dieser Methode haben wir ein Transmembranprotein, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13, genutzt, das sich auf Recycling-Endosomen17 und Zyklen zwischen sortierenden Endosomen und Melanosomen in Melanozyten ^{befindet12,18}. Darüber hinaus ermöglicht die Deletion der N-terminalen unstrukturierten regulatorischen Domäne (nämlich SynN oder ^STX13Δ129), dass die SNARE in Melanosomen stecken bleibt, was den Vorwärtstransportweg zum Melanosom ^misst12. Wir haben in unseren Studien einen bekannten recyclingenden endosomalen Marker Rab GTPase (Rab)11 ^{verwendet14,19}. Die Fluoreszenzbildgebung der Proteine GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 und TYRP1 in Wildtyp-Melanozyten mit anschließender Quantifizierung ihrer relativen Lokalisation wird die Art und Dynamik von REs zusätzlich zu ihrem Targeting auf Melanosomen liefern. Somit ist dies eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um die Dynamik von REs in Melanozyten zu visualisieren und zu messen.

Protokoll

Das Protokoll beinhaltet die Aussaat von Melanozyten, gefolgt von einer Transfektion der Plasmide. Weitere Schritte umfassen Fixierung, Immunfärbung, Bildgebung und Analyse der Zellen, um die Länge und Anzahl der REs zu messen. Die detaillierte Beschreibung des Protokolls ist unten angegeben.

1. Aussaat von Mausmelozyten auf vorbehandelten Deckgläsern

1. Beschichten Sie die Glasdeckgläser in einer Petrischale (d.h. 4 - 5 in einer 35 mm Schale) mit Basalmembranmatrixmedium (1:20 in vollständigem RPMI-Medium: RPMI + 10% wärmeinaktiviertes FBS + 1x Glutamin + 1x Antibiotika-Mix) und trocknen Sie es in der Gewebekulturhaube für 15 min. Waschen Sie die Deckgläser vor Gebrauch einmal mit 1x PBS.
2. Pflegen Sie die Wildtyp-Mausmelozyten (melan-Ink4a-Arf-1 von C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^-/- Mäuse, beschrieben ⁱⁿ²⁰ und erhältlich bei The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) in einer Petrischale (d.h. 35 oder 60 mm Schale), ergänzt mit einem vollständigen RPMI-Medium.
   1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und fügen Sie 0,5 oder 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%) Lösung für trypsinisierende Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2 - 5 min für die Loslösung von der Petrischale.
   2. Fügen Sie 1 - 2 ml vollständiges RPMI-Medium hinzu, suspendieren Sie die Zellen und übertragen Sie sie dann in ein Zentrifugenröhrchen.
3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 4 °C, 376 x g für 5 min und resuspenieren Sie das Pellet dann in 1x PBS.
4. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml vollständigem RPMI-Medium.
5. Säen Sie die Zellen auf der Basalmembran mittelbeschichtete Deckgläser mit 50-60% Konfluenz (ca. 6 x ¹⁰⁵ Zellen auf einer 35 mm Zellkulturschale mit 4 - 5 Deckgläsern). Fügen Sie der plattierten Zellsuspension immer 200 nM PMA (addieren Sie 5 μL Arbeitsmaterial 40 μM Phorbol 12-Myristat 13-Acetat hinzu) in einem vollständigen RPMI-Medium hinzu.
6. Nach der Aussaat die Platte bei 37 °C für 12-24 h inkubieren.

2. Transfektion von Zellen mit den STX13-Plasmiden

1. Verwenden Sie die folgenden Reagenzien: pEGFP-C1-STX13WT und pEGFP-C1-STX13Δ129 (beschrieben ⁱⁿ¹²). mCherry-Rab11, war ein freundliches Geschenk von Graça Raposo, Institut Curie, Paris (beschrieben in ^Referenz19). Anti-TYRP1-Antikörper aus ATCC (TA99).
2. Nach 12 - 24 h Aussaat transfizieren Sie die Zellen mit Plasmiden unter Verwendung eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes. Nehmen Sie für eine 35-mm-Schale 5 μL des Transfektionsreagenzes in 250 μL OPTI-MEM-Medium in einem Mikrozentrifugenröhrchen und nehmen Sie etwa 200 ng jedes Plasmids in 250 μL OPTI-MEM.
3. Inkubieren Sie die DNA-haltigen Röhrchen und das Transfektionsreagenz für 5 min. Mischen Sie ohne wiederholtes Pipettieren (Gesamtvolumen beträgt ca. 500 μL). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Führen Sie das Handklopfen des Rohres alle 10 Minuten für 30 Minuten bei RT durch.
4. Waschen Sie die Zellen während der Inkubation zweimal mit 1x PBS, einmal mit OPTI-MEM und geben Sie dann 1 ml OPTI-MEM zu den Zellen.
5. Nach 30 Minuten Inkubation die Transfektionsreagenzien-DNA-Mischung tropfenweise zu den Zellen geben, indem Sie die Schale abdecken.
6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 6 h. Aspirieren Sie das OPTI-MEM-Medium mit einem Transfektionsreagenz und fügen Sie ein vollständiges RPMI-Medium hinzu, das mit 200 nM PMA ergänzt wird.
7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 48 h.

3. Fixierung der Zellen

HINWEIS: Das folgende Verfahren wird außerhalb der Gewebekulturhaube durchgeführt.

1. Nach 48 h Transfektion die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen und dann die Zellen mit 3% Formaldehyd (frisch in 1x PBS zubereitet) für 30 min fixieren.
2. Nach der Fixierung die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen und die Deckgläser bis zur weiteren Verwendung in 1x PBS aufbewahren. Alternativ können Zellen auf Glasobjektträgern montiert (siehe unten) oder bei 4 °C gelagert werden.

4. Immunfärbung der Zellen

1. Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor: Legen Sie das paraffinfilmgeschnittene Stück auf feuchtes Filterpapier in eine Petrischale, die mit Aluminiumfolie bedeckt ist.
2. Herstellung von 25 μL primärer Antikörperlösung (0,2% Saponin in 1x PBS, 0,1% BSA in 1x PBS und 0,02% Natriumazid in 1x PBS). Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 hinzufügen. Fügen Sie diese Lösung als Tropfen auf einen Paraffinfilm in der Feuchtkammer hinzu.
3. Heben Sie den Deckstab vorsichtig mit einer Pinzette an, drehen Sie ihn auf diesem Tropfen primärer Antikörperfärbelösung um und bedecken Sie dann den Deckel der Feuchtkammer. Bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
4. In ähnlicher Weise die sekundäre Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:500 vorbereiten und auf Paraffinfilm neben dem Deckglas in der Feuchtkammer legen. Um den Kern zu färben, fügen Sie DAPI (1:20.000 bis 1:30.000) zur Lösung hinzu.
5. Nehmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig den Deckglas aus der primären Antikörperlösung auf und tauchen Sie ihn dreimal in 1x PBS (in ein Glasbecherglas).
6. Tippen Sie auf das Deckglas auf Seidenpapier, um das überschüssige PBS auf dem Deckglas zu entfernen. Legen Sie es auf sekundäre Antikörperfärbelösung in der Feuchtkammer und setzen Sie es aufgrund des Vorhandenseins fluoreszierend markierter Antikörper in der Lösung keinem Licht aus.
7. Den Deckglas erneut für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Bitte beachten Sie immer die Seite des Deckglases, die die Zellen in diesen Schritten enthält.
8. Nehmen Sie nach der Inkubation vorsichtig den Deckglas von der sekundären Antikörperlösung auf und tauchen Sie ihn dann dreimal in 1x PBS. Tippen Sie außerdem auf das Deckglas auf Seidenpapier, um das überschüssige PBS auf dem Deckglas zu entfernen.
9. Legen Sie 12 μL Fluoromount-G Montagereagenz auf einen Glasobjektträger und legen Sie vorsichtig den bunten Deckglas (mit Blick auf das Glas) auf das Montagereagenz. Drehen Sie den Glasträger auf Seidenpapier um und drücken Sie ihn dann vorsichtig an.

5. Fluoreszenzmikroskopie der Zellen

1. Stellen Sie die gefärbten Zellen unter Hellfeld- (BF) und Fluoreszenzfiltern (IF) mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop ab, das mit einer CCD-Kamera mit einem apochromatischen 60-fachen (Öl) Objektiv oder einem anderen Mikroskop mit ähnlicher Konfiguration ausgestattet ist.

6. Quantifizierung der Überlappung zwischen den RE-lokalisierten Proteinen und Melanosomen:

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die Quantifizierung des Mander-Überlappungskoeffizienten zwischen den Proteinen unter Verwendung der Fidschi-Software befolgt (frei herunterladbar unter dem Link: https://imagej.net/software/fiji/). Verwenden Sie das TIFF-Bild mit mehreren Kanälen.

1. Öffnen Sie das Raw-Bild. Gehen Sie zur Option Bild, wählen Sie Farbe | Teilen Sie Kanäle auf und verwenden Sie die beiden Kanäle für die Analyse.
2. Öffnen Sie das JACoP-Plugin in der Plugin-Option.
3. Stellen Sie den Schwellenwert für beide Kanäle so ein, dass alle hellen Flecken ausgewählt sind und der Hintergrund eliminiert wird.
4. Gehen Sie zur Option Analyse und wählen Sie M1- und M2-Koeffizienten aus, um den Mander-Überlappungskoeffizienten zu erhalten.
5. Drücken Sie die Option Analysieren im JACoP-Plugin und sehen Sie das Ergebnis, das Manders Überlappungskoeffizienten anzeigt.

7. Quantifizierung der röhrenförmigen Anzahl und Länge von Recycling-Endosomen:

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für die Quantifizierung der Anzahl und Länge der Tubuli mit Fidschi-Software befolgt.

1. Öffnen Sie das Raw-Bild Gehen Sie zur Option Bild, wählen Sie Farbe | Teilen Sie Kanäle auf und verwenden Sie den gewünschten Kanal für die Analyse.
2. Gehen Sie erneut zu Bild , wählen Sie Typ | In 8-Bit-Bild konvertieren.
3. Gehen Sie dann zu Plugins, wählen Sie Analysieren | Tubeness. Setzen Sie den Sigma-Wert auf 0,1075 . Drücken Sie OK.
4. Gehen Sie erneut zu Bild , wählen Sie Typ | In 8-Bit-Bild konvertieren.
5. Zum Bild | | anpassen Schwellenwert (Verwenden Sie für alle Bilder dieselben Schwellenwerte. Bilder sollten ungefähr die gleiche Intensität haben).
6. Gehe zu Prozess| Binäre | In Maske konvertieren .
7. Wechseln Sie zu Verarbeiten, wählen Sie Binär und dann Skelettieren aus.
8. Gehen Sie zu Analysieren, wählen Sie Skelett und dann Skelett analysieren. Wählen Sie in Ergebnis und Ausgabe | (a) Den größten kürzesten Pfad berechnen | (b) detaillierte Informationen anzeigen | (c) beschriftetes Skelett anzeigen. Drücken Sie OK.
   HINWEIS: Das Ergebnis wird im tabellarischen Format geöffnet. Die Spalte Durchschnittliche Zweiglänge zeigt die Länge aller verschiedenen Tubuli in der ausgewählten Zelle an (Skala für das Abrufen von Werten in Mikrometern festlegen).
9. Um die Anzahl der Tubuli in der Zelle zu erhalten, gehen Sie zu Analysieren, und wählen Sie die Option Partikel analysieren aus. Drücken Sie OK.
   HINWEIS: In den erhaltenen Ergebnissen zeigt die Zählspalte die Anzahl der Tubuli in dieser bestimmten Zelle an.
10. Speichern Sie die Daten und analysieren Sie sie.

Ergebnisse

Quantifizierung der STX13Δ129-Mutantenlokalisation an den Melanosomen
Die Immunfluoreszenzmikroskopie von STX13 in Maus-Wildtyp-Melanozyten zeigte GFP-STX13WT lokalisiert als vesikuläre und röhrenförmige Strukturen und GFP-STX13Δ129 lokalisiert als ringförmige Strukturen zusätzlich zur Zelloberfläche (Abbildung 1A). Darüber hinaus zeigte das intrazelluläre ringförmige GFP-STX13Δ129 eine Koloka...

Diskussion

Recycling-Endosomen sind eine Kohorte endozytärer Organellen und vermitteln das Recycling von Fracht an die Zelloberfläche in allen Zelltypen21,22,23,24,25. In spezialisierten Zelltypen wie Melanozyten lenken diese Organellen ihren Transportweg teilweise auf die Melanosomen für ihre Biogenese um3,16,26.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022