O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE

Resumo

Os endosários de reciclagem fazem parte da rede tubular endosomal. Aqui apresentamos um método para quantificar a dinâmica da reciclagem de endósmos usando GFP-STX13 como marcador de organela.

Resumo

Endosomos de reciclagem (REs) são organelas tubulares-vesiculares geradas a partir de endossóis precoces/de triagem em todos os tipos de células. Essas organelas desempenham um papel fundamental na biogênese dos melanósimos, uma organela relacionada ao lysosome produzida por melanócitos. Os REs fornecem a carga específica de melanócitos para melanomas prematuros durante sua formação. O bloqueio na geração de REs, observado em vários mutantes da síndrome de Hermansky-Pudlak, resulta em hipopigmentação da pele, cabelo e olho. Portanto, estudar a dinâmica (referem-se ao número e comprimento) das REs é útil para entender a função dessas organelas em condições normais e da doença. Neste estudo, pretendemos medir a dinâmica RE utilizando um SNARE STX13 residente.

Introdução

A biossíntese de pigmentos de melanina ocorre em melanósias, uma organela lysosome específica de melanócito (LRO) que coexiste com lysososomes convencionais. O sistema endocítico desempenha um papel fundamental na biogênese dos melanomas, necessário para a cor da pele e fotoproteção contra radiação ionizante1,2,3. Durante esse processo, as enzimas sintetizadoras de melanina são classificadas em endosários precoces/de triagem e depois transportadas para melanomas prematuros através de endosários tubulares ou vesiculares chamados endosários de reciclagem (REs)^....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

O protocolo envolve a semeadura de melanócitos seguidos pela transfecção dos plasmídeos. Outras etapas incluem fixação, imunostaining, imagem e análise das células para medir o comprimento e o número de REs. A descrição detalhada do protocolo é dada abaixo.

1. Semeadura de melanócitos de rato em tampas pré-tratadas

1. Cubra as tampas de vidro em uma placa de Petri (ou seja, 4 - 5 em uma placa de 35 mm) com meio de matriz de membrana de porão (1:20 em meio RPMI completo: RPMI + 10% de calor inativado FBS + 1x Glutamina + 1x Mistura de antibiótico) e seque-o na capa de cultura tecidual por 15 min. Lave as tampas uma ve....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Quantificação da localização mutante STX13Δ129 para os melanomas
A microscopia de imunofluorescência de STX13 em melanócitos do tipo selvagem do rato mostrou GFP-STX13WT localizado como estruturas vesiculares e tubulares e GFP-STX13Δ129 localizado como estruturas semelhantes a anéis, além da superfície celular (Figura 1A). Além disso, o anel intracelular GFP-STX13Δ129 mostrou colocalização .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Os endossóis de reciclagem são uma coorte de organelas endocíticas, e mediam a reciclagem de carga para a superfície celular em todos os tipos de células21,22,23,24,25. Em tipos de células especializadas, como os melanócitos, essas organelas desviam parcialmente sua rota de tráfico em direção aos melanomas para sua biogênese3,16,26.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022