Анализ на основе микроскопии для изучения и анализа эндосом рециркуляции с использованием snARE Trafficking

Резюме

Рециркулирующие эндосомы являются частью эндосомальной трубчатой сети. Здесь мы представляем метод количественной оценки динамики рециркуляции эндосом с использованием GFP-STX13 в качестве маркера органелл.

Аннотация

Рециркулирующие эндосомы (ПВ) представляют собой трубчато-везикулярные органеллы, образующиеся из ранних/сортирующих эндосом во всех типах клеток. Эти органеллы играют ключевую роль в биогенезе меланосом, органелл, связанных с лизосомами, продуцируемых меланоцитами. РЭ доставляют меланоцит-специфический груз к преждевременным меланосомам во время их формирования. Закупорка в генерации РЭ, наблюдаемая у нескольких мутантов синдрома Германского-Пудлака, приводит к гипопигментации кожи, волос и глаз. Поэтому изучение динамики (см. количество и длину) РЭ полезно для понимания функции этих органелл в нормальных и болезненных условиях. В этом исследовании мы стремимся измерить динамику RE с помощью резидентного SNARE STX13.

Введение

Биосинтез пигментов меланина происходит в меланосомах, меланоцит-специфических лизосомных органеллах (LRO), которые сосуществуют с обычными лизосомами. Эндоцитарная система играет ключевую роль в биогенезе меланосом, необходимых для окрашивания кожи и фотозащиты от ионизирующего ^{излучения1,2,3}. Во время этого процесса ферменты, синтезирующие меланин, сортируются на ранних/сортирующих эндосомах, а затем транспортируются в преждевременные меланосомы через трубчатые или везикулярные эндосомы, называемые рециркулирующими эндосомами (ES)

протокол

Протокол включает в себя посев меланоцитов с последующей трансфекцией плазмид. Дальнейшие шаги включают фиксацию, иммуноокрашивание, визуализацию и анализ клеток для измерения длины и количества ПВ. Подробное описание протокола приведено ниже.

1. Посев меланоцитов мышей на предварительно обработанные покровы

1. Покрыть стеклянные крышки в чашке Петри (т.е. 4 - 5 в чашке 35 мм) матричной средой базальной мембраны (1:20 в полной среде RPMI: RPMI + 10% инактивированной теплом FBS + 1x глутаминовой + 1x антибиотической смесью) и высушить ее в тканевой культуральной вытяжке в течение 15 мин. Вымойте крышки один раз с 1x P....

Результаты

Количественная оценка мутантной локализации STX13Δ129 в меланосомах
Иммунофлуоресцентная микроскопия STX13 в меланоцитах мышиного дикого типа показала, что GFP-STX13WT локализован как везикулярные и трубчатые структуры, а GFP-STX13Δ129 локализован как кольце.......

Обсуждение

Рециркулирующие эндосомы представляют собой когорту эндоцитарных органелл, и они опосредуют рециркуляцию груза на клеточную поверхность во всех типах клеток21,22,23,24,25. В специализированных типах к.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol-12-myristate-13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022