Анализ на основе микроскопии для изучения и анализа эндосом рециркуляции с использованием snARE Trafficking

Резюме

Рециркулирующие эндосомы являются частью эндосомальной трубчатой сети. Здесь мы представляем метод количественной оценки динамики рециркуляции эндосом с использованием GFP-STX13 в качестве маркера органелл.

Аннотация

Рециркулирующие эндосомы (ПВ) представляют собой трубчато-везикулярные органеллы, образующиеся из ранних/сортирующих эндосом во всех типах клеток. Эти органеллы играют ключевую роль в биогенезе меланосом, органелл, связанных с лизосомами, продуцируемых меланоцитами. РЭ доставляют меланоцит-специфический груз к преждевременным меланосомам во время их формирования. Закупорка в генерации РЭ, наблюдаемая у нескольких мутантов синдрома Германского-Пудлака, приводит к гипопигментации кожи, волос и глаз. Поэтому изучение динамики (см. количество и длину) РЭ полезно для понимания функции этих органелл в нормальных и болезненных условиях. В этом исследовании мы стремимся измерить динамику RE с помощью резидентного SNARE STX13.

Введение

Биосинтез пигментов меланина происходит в меланосомах, меланоцит-специфических лизосомных органеллах (LRO), которые сосуществуют с обычными лизосомами. Эндоцитарная система играет ключевую роль в биогенезе меланосом, необходимых для окрашивания кожи и фотозащиты от ионизирующего ^{излучения1,2,3}. Во время этого процесса ферменты, синтезирующие меланин, сортируются на ранних/сортирующих эндосомах, а затем транспортируются в преждевременные меланосомы через трубчатые или везикулярные эндосомы, называемые рециркулирующими эндосомами (ES)4,5,6,7,8,9,10. Нацеливание и слияние этих органелл регулируют созревание полнофункциональных пигментированных меланосом7,11,12,13,14. Дефекты образования этих органелл или сортировки груза к этим органеллам вызывают глазокожный альбинизм и другие клинические фенотипы, наблюдаемые при синдроме Германского-Пудлака15,16.

Здесь мы описываем простую технику на основе микроскопии для изучения и анализа РН. В этом методе мы использовали трансмембранный белок Qa-SNARE Syntaxin (STX)13, который находится на рециркуляции ^{эндосом17} и циклах между сортировкой эндосом и меланосом в меланоцитах12,18. Кроме того, удаление N-концевого неструктурированного регуляторного домена (а именно SynN или ^STX13Δ129) позволяет SNARE застревать в меланосомах, что измеряет путь прямого трафика к меланосоме12. Мы использовали известный эндосомальный маркер переработки Rab GTPase (Rab)11 в наших ^{исследованиях14,19}. Флуоресцентная визуализация белков GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 и TYRP1 в меланоцитах дикого типа с последующей количественной оценкой их относительной локализации обеспечит характер и динамику РН в дополнение к их нацеливанию на меланосомы. Таким образом, это простая методика, которую можно использовать для визуализации и измерения динамики ПВ в меланоцитах.

протокол

Протокол включает в себя посев меланоцитов с последующей трансфекцией плазмид. Дальнейшие шаги включают фиксацию, иммуноокрашивание, визуализацию и анализ клеток для измерения длины и количества ПВ. Подробное описание протокола приведено ниже.

1. Посев меланоцитов мышей на предварительно обработанные покровы

1. Покрыть стеклянные крышки в чашке Петри (т.е. 4 - 5 в чашке 35 мм) матричной средой базальной мембраны (1:20 в полной среде RPMI: RPMI + 10% инактивированной теплом FBS + 1x глутаминовой + 1x антибиотической смесью) и высушить ее в тканевой культуральной вытяжке в течение 15 мин. Вымойте крышки один раз с 1x PBS перед использованием.
2. Поддерживайте меланоциты мышей дикого типа (melan-Ink4a-Arf-1 от C57BL/6J, a/a, Ink4a-Arf^-/- мышей, описанных в ²⁰ и доступных в The Welcome Trust Functional Genomics Cell Bank) в чашке Петри (т.е. 35 или 60 мм чашке), дополненной полной средой RPMI.
   1. Дважды промыть клетки 1x PBS и добавить 0,5 или 1 мл раствора Trypsin-EDTA (0,25%) для трипсинизации клеток. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 2 - 5 мин для отделения от чашки Петри.
   2. Добавьте 1 - 2 мл полной среды RPMI, суспендируйте, а затем переложите ячейки в центрифужную трубку.
3. Центрифугируют клеточную суспензию при 4 °C, 376 х г в течение 5 мин, а затем повторно суспендируют гранулу в 1x PBS.
4. Повторите стадию центрифугирования и повторно суспендируйте ячейки в 1 мл полной среды RPMI.
5. Засевайте клетки на основную мембрану со средним покрытием покровных пластинок при 50-60% слиянии (приблизительно 6 х ¹⁰⁵ клеток на чашке для культивирования клеток толщиной 35 мм, содержащей 4 - 5 обложек). Всегда добавляйте 200 нМ PMA (добавьте 5 мкл рабочего материала 40 мкМ форбола 12-миристата 13-ацетата) к покрытой клеточной суспензии в полной среде RPMI.
6. После посева инкубируют пластину при 37 °С в течение 12-24 ч.

2. Трансфекция клеток плазмидами STX13

1. Используйте следующие реагенты: pEGFP-C1-STX13WT и pEGFP-C1-STX13Δ129 (описано в ¹²). mCherry-Rab11, был добрым подарком от Граса Рапосо, Институт Кюри, Париж (описано в ^{ссылке19}). Анти-TYRP1 антитело от ATCC (TA99).
2. После 12 - 24 ч посева трансфектируют клетки плазмидами с помощью трансфекционного реагента на основе липидов. Для чашки диаметром 35 мм возьмите 5 мкл трансфекционного реагента в 250 мкл среды OPTI-MEM в микроцентрифужной трубке и возьмите примерно 200 нг каждой плазмиды в 250 мкл OPTI-MEM.
3. Инкубируют пробирки, содержащие ДНК и трансфекционный реагент, в течение 5 мин. Перемешать без повторного пипетирования (общий объем составит около 500 мкл). Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Выполняйте ручное постукивание по трубке каждые 10 мин в течение 30 мин на RT.
4. Во время инкубации промывайте клетки дважды 1x PBS, один раз OPTI-MEM, а затем добавляйте 1 мл OPTI-MEM в клетки.
5. После 30 мин инкубации добавьте смесь трансфекционного реагента и ДНК к клеткам по каплям, накрыв блюдо.
6. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 6 ч. Аспирировать среду OPTI-MEM трансфекционным реагентом и добавить полную среду RPMI, дополненную 200 нМ PMA.
7. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 48 ч.

3. Фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура выполняется вне вытяжки культуры тканей.

1. После 48 ч трансфекции дважды промыть клетки 1x PBS, а затем зафиксировать клетки 3% формальдегидом (свежеприготовленным в 1x PBS) в течение 30 мин.
2. После фиксации дважды промыть ячейки 1x PBS и хранить крышки в 1x PBS до дальнейшего использования. Альтернативно, ячейки могут быть установлены на стеклянных слайдах (см. Ниже) или храниться при 4 °C.

4. Иммуноокрашивание клеток

1. Подготовьте влажную камеру: поместите нарезанный кусок парафиновой пленки на влажную фильтровальную бумагу в чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой.
2. Готовят 25 мкл раствора первичных антител (0,2% сапонина в 1x PBS, 0,1% BSA в 1x PBS и 0,02% азида натрия в 1x PBS). Добавляют антитела в разведении 1:200. Добавьте этот раствор в виде капли на парафиновую пленку во влажную камеру.
3. Осторожно приподнимите крышку щипцами, переверните ее на этой капле раствора для окрашивания первичных антител и затем накройте крышку влажной камеры. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Аналогично готовят раствор вторичного антитела в разведении 1:500 и помещают его на парафиновую пленку рядом с крышкой во влажной камере. Для окрашивания ядра добавьте в раствор DAPI (от 1:20 000 до 1:30 000).
5. Используя щипцы, осторожно подберите крышку из раствора первичного антитела и трижды окуните его в 1x PBS (в стеклянный стакан).
6. Коснитесь крышки на папиросной бумаге, чтобы удалить лишний PBS на обложке. Поместите его на раствор для окрашивания вторичных антител во влажной камере и не подвергайте его воздействию света из-за наличия флуоресцентно помеченных антител в растворе.
7. Снова высиживать крышку в течение 30 мин при комнатной температуре. Пожалуйста, всегда держите за заметку сторону крышки, которая имеет ячейки на протяжении всех этих шагов.
8. После инкубации осторожно подберите крышку из раствора вторичного антитела, а затем трижды окуните ее в 1x PBS. Кроме того, нажмите на крышку на папиросной бумаге, чтобы удалить избыток PBS на крышке.
9. Поместите 12 мкл монтажного реагента Fluoromount-G на стеклянную горку и аккуратно поместите витражную крышку (обращенную к стеклу) на монтажный реагент. Переверните стеклянный слайд на папиросной бумаге, а затем аккуратно надавите.

5. Флуоресцентная микроскопия клеток

1. Визуализируйте окрашенные ячейки под фильтрами Bright-field (BF) и флуоресцентными (IF) с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой с использованием 60-кратного (масляного) апохроматического объектива или любого другого микроскопа с аналогичной конфигурацией.

6. Количественная оценка перекрытия между локализованными белками RE и меланосомами:

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки коэффициента перекрытия Мандера между белками с помощью программного обеспечения Фиджи (свободно загружаемого по ссылке: https://imagej.net/software/fiji/). Используйте изображение TIFF с несколькими каналами.

1. Откройте необработанное изображение. Перейдите к параметру «Изображение», выберите «Цветной | Разделите каналы и используйте два канала для анализа.
2. Откройте плагин JACoP в опции Плагин.
3. Установите пороговое значение для обоих каналов таким образом, чтобы все яркие пятна были выбраны, а фон был удален.
4. Перейдите в опцию Анализ, выберите коэффициенты M1 и M2 для получения коэффициента перекрытия Мандера.
5. Нажмите кнопку Анализ в подключаемом модуле JACoP и увидите результат, отображающий коэффициент перекрытия Мандера.

7. Количественная оценка трубчатого количества и длины эндосом рециркуляции:

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки количества и длины канальцев с использованием программного обеспечения Фиджи выполняются следующие шаги.

1. Откройте необработанное изображение Перейдите к параметру «Изображение», выберите «Цветной | Разделите каналы и используйте нужный канал для анализа.
2. Снова перейдите к изображению , выберите Тип | Преобразование в 8-битное изображение.
3. Затем перейдите в раздел Плагины, выберите Анализировать | Трубчатость. Установите значение сигмы равным 0,1075. Нажмите Ok.
4. Снова перейдите к изображению , выберите Введите | Преобразование в 8-битное изображение.
5. Перейти к | изображений Отрегулируйте | Threshold (Используйте одинаковые пороговые значения для всех изображений. Изображения должны иметь примерно одинаковую интенсивность).
6. Перейти к процессуальной | Двоичные | Преобразовать в маску.
7. Перейдите в раздел Обработка, выберите Двоичный файл , а затем выберите Скелетонизировать.
8. Перейдите в раздел Анализ, выберите Скелет и выберите Анализ скелета. В | результата и вывода выберите (а) Рассчитать наибольший кратчайший путь | (б) показать подробную информацию | (в) отобразить помеченный скелет. Нажмите Ok.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результат откроется в табличном формате. Столбец Средняя длина ветви показывает длину всех различных канальцев в выбранной ячейке (задайте шкалу для получения значений в микрометрах).
9. Для получения количества канальцев в ячейке перейдите в раздел Анализ и выберите опцию Анализировать частицы . Нажмите Ok.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В полученных результатах столбец счетчика показывает количество канальцев в этой конкретной ячейке.
10. Сохраняйте данные и анализируйте.

Результаты

Количественная оценка мутантной локализации STX13Δ129 в меланосомах
Иммунофлуоресцентная микроскопия STX13 в меланоцитах мышиного дикого типа показала, что GFP-STX13WT локализован как везикулярные и трубчатые структуры, а GFP-STX13Δ129 локализован как кольце...

Обсуждение

Рециркулирующие эндосомы представляют собой когорту эндоцитарных органелл, и они опосредуют рециркуляцию груза на клеточную поверхность во всех типах клеток21,22,23,24,25. В специализированных типах к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TYRP1 antibody (TA99)	ATCC	HB-8704
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668-500
Matrigel matrix	BD Biosciences	356231
OPTI-MEM	ThermoFisher Scientific	022600-050
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P8139
RPMI Medium 1640	ThermoFisher Scientific	31800-022