细胞膜亲和色谱柱鉴定与固定化托肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物

摘要

该协议描述了用含有功能性跨膜滋养肌球蛋白激酶受体B蛋白的固定化细胞膜片段制备细胞膜亲和色谱（CMAC）柱。还解释了使用CMAC色谱柱鉴定与这些受体相互作用并存在于复杂天然混合物中的特化植物代谢物。

摘要

由植物，真菌，细菌和海洋无脊椎动物合成的化学物质一直是新药命中和先导物的丰富来源。他汀类药物、青霉素、紫杉醇、雷帕霉素或青蒿素等药物，通常用于医疗实践，已首先从天然产物中鉴定和分离出来。然而，从天然来源鉴定和分离具有生物活性的特化代谢物是一个具有挑战性且耗时的过程。传统上，在提取生物质之后，从复杂的混合物中分离和纯化单个代谢物。随后，在功能测定中测试分离的分子以验证其生物活性。在这里，我们介绍了使用细胞膜亲和色谱（CMAC）色谱柱直接从复杂混合物中鉴定生物活性化合物。CMAC色谱柱允许鉴定与嵌入其天然磷脂双层环境中的固定化功能性跨膜蛋白（TMP）相互作用的化合物。这是一种靶向的方法，需要知道TMP，其活性打算用新发现的小分子候选药物进行调节。在该协议中，我们提出了一种用固定化肌球蛋白激酶受体B（TrkB）制备CMAC柱的方法，该方法已成为许多神经系统疾病药物发现的可行靶标。在本文中，我们提供了一个详细的方案，使用过表达TrkB受体的神经母细胞瘤细胞系将CMAC柱与固定的TrkB受体组装在一起。我们进一步介绍了研究色谱柱功能及其在鉴定与TrkB受体相互作用的专用植物代谢物中的应用的方法。

引言

植物混合物富含药理活性化合物¹，可作为鉴定新药命中和先导联^2，3，^4，5的良好来源。从天然产物中发现新药是一种富有成效的方法，许多目前批准的药物来自自然界中首先鉴定的化合物。天然化合物的化学多样性很难与人造化学合成分子库相匹配。许多天然化合物与人类蛋白质靶标相互作用并调节人类蛋白质靶标，并且可以被认为是进化优化的类药物分子⁶。这些天然化合物特别适合于药物先导物鉴定，以用于神经系统疾病⁶。目前FDA批准的两种用于治疗阿尔茨海默病（AD）的药物来自天然生物碱，即:加兰他敏和卡巴拉汀（毒扁豆碱的衍生物）⁶。L-DOPA 是目前帕金森病最常用的处方药，首先从蚕豆（Vicia faba L.）中鉴定出来。⁷.高臼和赖脲，多巴胺能受体激动剂是来自寄生真菌Claviceps purpurea⁸的天然麦角生物碱的衍生物。利血平，一种从印度蛇根（Rauvolfia serpentina （L.） Benth. ex Kurz）分离出来的生物碱，是最早的抗精神病药物之一⁹.最近，失调的免疫反应和全身炎症已经与许多神经系统疾病的发展有关，例如重度抑郁症或神经退行性疾病¹⁰。已发现植物性饮食与其他生活方式干预相结合可以改善老年人的认知和功能能力^{11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21}.已经发现属于三萜烯和多酚的某些亲电分子在体外和体内模型¹²中调节炎症反应。例如，含有α，β不饱和羰基（例如姜黄素，肉桂醛）或异硫氰酸酯基团（例如萝卜硫素）的天然化合物会干扰Toll样受体-4（TLR4）二聚化，从而抑制小鼠白细胞介素-3依赖性pro-B细胞系中促炎细胞因子的下游合成^12，22.流行病学证据强烈指出，存在于复杂食物基质中的膳食植物化学物质也可能构成新药先导物的可行来源⁶。

鉴定植物提取物（包括植物性食物）中存在的生物活性分子的主要障碍之一是所研究样品的复杂性。传统上，单个化合物被分离，纯化，然后测试生物活性。这种方法通常导致鉴定最丰富和最有特征的化合物。没有明确分子靶点的表型药物发现方法依赖于复杂混合物的生物引导分馏²³。在这种方法中，将提取物分馏成不太复杂的亚级分，随后在表型测定中进行测试。活性化合物的分离和纯化由测定中验证的生物活性指导。对特定药物靶标的特性的了解可以显着加快复杂混合物中存在的药理活性化合物的鉴定。这些方法通常基于分子靶标的固定化，例如酶，在固体表面上，如磁珠²³。固定的靶标随后用于筛选实验，从而分离出与靶标相互作用的化合物。虽然这种方法已被广泛用于鉴定靶向胞质蛋白的化合物，但它在鉴定与跨膜蛋白（TMP）相互作用的化学物质方面不太常见²³。TMP固定化的另一个挑战源于蛋白质的活性取决于其与细胞膜磷脂和双层中其他分子（如胆固醇^23，24）的相互作用。在试图固定跨膜靶标时，重要的是要保留蛋白质与其天然磷脂双层环境之间的这些微妙相互作用。

在细胞膜亲和色谱（CMAC）中，细胞膜片段，而不是纯化的蛋白质，被固定在人工膜（IAM）固定相颗粒²³上。通过将磷脂酰胆碱类似物共价键合到二氧化硅上来制备IAM固定相。最近开发了新型的IAM固定相类，其中游离胺和硅醇基团是端封的（IAM.个人电脑。DD2 粒子）。在CMAC色谱柱制备过程中，细胞膜片段通过吸附固定在IAM颗粒的表面上。

迄今为止，CMAC色谱柱已被用于固定不同类别的TMP，包括离子通道（例如烟碱受体），GPCRs（例如，阿片受体），蛋白质转运蛋白（例如，p-糖蛋白）等^。固定化的蛋白质靶标已用于表征药效学（例如，解离常数，Kd）或确定与靶标相互作用的小分子配体的结合动力学（k_开 和k_关），以及鉴定复杂基质中存在的潜在新药先导物的过程²⁴.在这里，我们介绍了具有固定化对肌球蛋白激酶受体B（TrkB）的CMAC柱的制备，该受体已成为许多神经系统疾病的药物发现的可行靶标。

先前的研究表明，脑源性神经营养因子（BDNF）/ TrkB通路的激活与某些神经系统疾病的改善有关，例如AD或重性抑郁障碍^{25，26，27，28}。据报道，在AD中，BDNF水平及其受体TrkB表达降低，类似的减少损害了AD²⁹动物模型中的海马功能。据报道，AD患者的血清和大脑中BDNF水平降低^30，31，32。发现Tau过表达或高磷酸化可下调原代神经元和AD动物模型中的BDNF表达^33，34，35。此外，据报道，BDNF对β-淀粉样蛋白诱导 的体外 和 体内³⁶的神经毒性具有保护作用。直接将BDNF施用于大鼠大脑被证明可以增加认知受损动物的学习和记忆^力37。BDNF / TrkB成为改善神经和精神疾病的有效目标，包括AD^28，38。靶向BDNF / TrkB信号通路以开发AD中的疗法可能会增强我们对疾病的理解³⁹。不幸的是，BDNF本身不能用作治疗，因为它的药代动力学性质差和不良副作用⁴⁰。TrkB / BDNF途径的小分子激活剂已被探索为潜在的TrkB配体^41，42，43。在测试的小分子激动剂中，7，8-二羟基黄酮（7，8-DHF）已被证明可以激活BDNF / TrkB途径^{41，44，45，46}。7，8-DHF（R13;4-氧代-2-苯基-4H-铬-7，8-二基双（甲基氨基甲酸酯））的衍生物目前正在考虑作为AD⁴⁷的可能药物。最近，研究表明，几种抗抑郁药通过直接与TrkB结合并促进BDNF信号传导起作用，进一步强调了追求TrkB作为治疗各种神经系统疾病的有效靶点的重要性⁴⁸。

该协议描述了组装功能TrkB柱和TrkB-NULL阴性对照柱的过程。使用已知的天然产物小分子配体:7，8-DHF来表征色谱柱。此外，我们描述了筛选复杂基质的过程，以植物提取物为例，用于鉴定与TrkB相互作用的化合物。

研究方案

1. SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的细胞培养（TrkB和TrkB-NULL（亲本）细胞系）

注意:细胞系（SH-SY5Y细胞系（TrkB，BR6）和SH-SY5Y亲本细胞系（TrkB NULL））^49，50 是从Kerafast购买的。培养的细胞被用作跨膜受体的来源，以固定用于制备CMAC柱。以下步骤描述了如何获得细胞膜片段和组装功能性CMAC柱。

1. 通过在37°C的潮湿气氛中在150mm细胞培养皿中混合450mLRPI培养基，5mL青霉素/链霉素溶液和0.3mg / mL遗传素（G418）在150mm细胞培养皿中制备细胞培养基中培养_细胞。

2. 细胞采集

1. 使用显微镜确认细胞汇合度（80%-90%），在细胞传代后3-4天后达到。
2. 从细胞上方抽吸细胞培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x，pH 7.4）洗涤细胞两次。去除PBS并加入2毫升低浓度胰蛋白酶（0.25%）以分离细胞。
3. 轻轻旋转板以用胰蛋白酶溶液均匀覆盖所有细胞，并将细胞在37°C下在具有5%CO 2的潮湿气氛中孵育约₂分钟。向分离的细胞中加入8 mL细胞培养基，并将分离的细胞转移到50 mL锥形管中并将其置于冰上。
4. 使用血细胞计数器估计细胞数量（约 3 x 10^{7 个} 细胞）。通过上下移液混合细胞悬浮液，以获得混合物中的均匀细胞密度。将10μL细胞悬浮液置于盖玻片下，并使用40x物镜在显微镜下计数细胞。

3. 细胞均质化

1. 准备以下蛋白酶抑制剂的储备溶液:苯甲脒（200 mM），苯基甲基磺酰氟（PMSF，10 mM）和含有4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF），抑肽酶，最佳蛋白酶和leupeptin的市售蛋白酶抑制剂鸡尾酒（100倍浓度）。
   注意:PMSF只能在通风橱内处理。
   1. 通过将120mg苯甲脒溶解在5mL超纯去离子水中来制备苯甲脒储备溶液（200mM）。储存在4°C并在一天内使用。每次使用前新鲜制备溶液（推荐）。
   2. 通过将0.017g PMSF溶解在10mL乙醇中来制备PMSF储备溶液（10mM）。储存在 - 20°C。
   3. 通过将市售的蛋白酶抑制剂混合物溶解在1mL超纯去离子水中来制备蛋白酶抑制剂混合物（100x）。充分混合并等分试样200-300μL鸡尾酒，并在使用前储存在-20°C。
2. 通过将55.114mg ATP二钠盐水合物溶解在1mL去离子超纯水中来制备ATP储备溶液（100mM）。充分混合并等分100μL混合物，并在使用前储存在-20°C。
3. 通过将3.03g三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl，50mM），2.9g氯化钠（NaCl，100mM），0.22g无水氯化钙（CaCl₂，3mM），0.2g氯化镁六水合物（MgCl_2，2mM）和0.19氯化钾（KCl，5mM）溶解在500mL超纯去离子水中制备缓冲液。
4. 通过将步骤3.3中制备的17.3mL缓冲液与0.3mL（3mM）苯甲脒储备溶液，0.2mL（0.1mM）PMSF储备溶液，0.2mL蛋白酶抑制剂鸡尾酒混合物，20μL（100μM）ATP储备溶液，2mL（10%）甘油和0.029g（5mM）EDTA混合来制备均质缓冲液（表1）。使用盐酸溶液将pH调节至7.4。
5. 在4°C下在步骤2.3中收获的细胞在400× g下旋转5分钟。除去上清液，用10mL冰冷的PBS（1x，pH 7.4）洗涤剩余的细胞沉淀。在4°C下以400× g再次旋转细胞5分钟。
6. 弃去上清液，并用步骤3.4中制备的20mL均质缓冲液替换。将锥形管放在冰上。
7. 将细胞悬浮液转移到40 mL Dounce均质机组织研磨机中，并将其放在冰上。在冰上手动均质化悬浮液，使用40个上下杵行程。将均质化的细胞悬浮液转移到50 mL锥形管中。
8. 将匀浆在4°C下以400× g离心7分钟。弃去沉淀并将上清液转移到新的锥形管中，并在4°C下以47900× g离心30分钟。保存细胞膜沉淀并丢弃上清液。

4. 细胞膜增溶

1. 通过将步骤3.3中制备的8.7mL缓冲溶液与0.1mL（0.1mM）PMSF储备溶液，0.15mL（3mM）苯甲脒储备溶液，0.1mL蛋白酶抑制剂混合物，10μL（100μM）ATP储备溶液，1mL（10%）甘油和0.2g（2%）胆酸钠混合来制备增溶缓冲液（表2）。
2. 将增溶缓冲液与步骤3.8中获得的细胞膜片段一起转移到锥形管中，并重悬于沉淀中。将得到的混合物在4°C下以150rpm旋转18小时。
   注意:此时，可以暂停实验以进行过夜细胞膜沉淀增溶。

5. IAM上的细胞膜固定。个人电脑。DD2 颗粒

1. 18小时后，将增溶混合物在4°C下以47900× g离心30分钟。
2. 保留上清液并丢弃沉淀。加入100毫克的IAM。个人电脑。DD2颗粒，向上清液中，在4°C下以150rpm涡旋并旋转所得悬浮液混合物1小时。
3. 为了便于在IAM上固定细胞膜碎片。个人电脑。DD2颗粒进入透析步骤，如下所述。
   1. 通过加入24g三盐酸（50mM），23.4gNaCl（100mM），0.06gCaCl₂ （0.1mM），5.85gEDTA（5mM）和0.07gPMSF（0.1mM; 表 3）。
      注意:PMSF不溶于水，因此首先将其溶解在小体积的乙醇中，然后与缓冲液一起缓慢加入烧杯中。
   2. 用盐酸溶液调节pH值至7.4。将缓冲液在4°C下放置至少1小时，然后再进行透析步骤。
   3. 通过切割10厘米纤维素膜透析管（10 K MWCO，35毫米）并转移含有IAM的悬浮液来制备透析管。个人电脑。DD2颗粒和细胞膜片段进入透析管。使用透析管夹关闭透析管的两端。
   4. 放置含有IAM的透析管。个人电脑。DD2固定相在透析缓冲液中，并在4°C下透析24小时，同时轻轻搅拌。
   5. 24小时后，将透析管置于新鲜制备的透析缓冲液中，并继续透析24小时。

6. 中药柱填料

1. 准备将用于洗涤IAM的醋酸铵缓冲液（10 mM，pH 7.4）。个人电脑。DD2颗粒和柱状物表征实验，将0.7708克乙酸铵溶于1升超纯去离子水中。用盐酸溶液调节pH值至7.4。
2. 透析48小时后，从透析缓冲液中取出透析管，并将透析管的内容物转移到15mL锥形管中。
3. 将混合物在4°C下以400× g离心5分钟。弃去上清液，用10mL乙酸铵缓冲液洗涤剩余的沉淀三次，每次洗涤后在4°C下以400× g离心混合物5分钟。
4. 第三次洗涤后，将剩余的沉淀重悬于1mL乙酸铵缓冲液中。将其充分混合，并使用所得浆料包装5/20玻璃柱以产生CMAC色谱柱。
5. 要包装色谱柱，首先将预先用乙酸铵缓冲液浸泡的底部过滤器放入过滤器支架中。将过滤器支架安装在玻璃柱中，并拧紧色谱柱盖以固定支架的位置。将色谱柱垂直放在手指夹中，并将其固定在实验室支架中。在柱子下方放置一个烧杯。
6. 使用单通道移液器将步骤6.4中获得的少量浆料转移到玻璃柱中。缓慢倒入材料，将移液器尖端靠在玻璃柱壁上。在倒入另一体积的浆料之前，让填料沉降。
7. 为了加快包装过程，在每个步骤之间使用微量移液管从固定床上方取出缓冲液。重复这些步骤，直到1 mL浆料被包装。
8. 放置顶部滤波器并拧紧适配器单元，使固定相位上方没有剩余的缓冲器，如图 1所示。使用适配器锁固定适配器单元的位置。
9. 将色谱柱连接到高效液相色谱（HPLC）泵，将流速设置为0.2 mL / min，然后用乙酸铵缓冲液洗涤色谱柱过夜。色谱柱现在已准备好进行表征步骤。将色谱柱储存在4°C直至使用。
   注意:对于较长的储存时间（柱不使用超过一周），在乙酸铵缓冲液中用0.05%叠氮化钠溶液运行色谱柱并储存在4°C。
   注意:叠氮化钠口服或通过皮肤吸收时毒性很大;它只能在通风橱下处理。使用叠氮化钠时，确保穿戴实验室外套，安全眼镜和手套（首选丁腈）。

7. CMAC色谱柱表征

1. 共聚焦显微镜和BDNF结合
   1. 准备 IAM。新浪网.DD2固定相颗粒具有固定化的细胞膜片段，通过遵循步骤1至步骤6.4中的说明从过表达TrkB和SH-SY5Y TrkB-NULL细胞的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中分离获得。
   2. 对于在抗体染色之前将与BDNF一起孵育的样品，通过将10μgBDNF溶解在100μL超纯去离子水中来制备BDNF储备溶液。将溶液储存在-20°C。
      1. 在单独的1.5 mL微量离心管中转移，100 μL等分试样的IAM。个人电脑。DD2柱包装材料，具有固定化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞过表达TrkB和100μL等分试样的IAM。个人电脑。DD2柱填料，具有固定化的SH-SY5Y TrkB-NULL细胞悬浮在乙酸铵缓冲液中。
      2. 向每个试管中加入390μL乙酸铵缓冲液，10μLBDNF储备溶液和0.5μLATP储备溶液（在步骤3.2中制备）并在室温下摇孵1小时。
   3. 对于在抗体染色之前不会与BDNF一起孵育的样品，转移100μL等分试样的IAM。个人电脑。DD2柱包装材料具有固定化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，过表达TrkB悬浮在乙酸铵中，进入1.5mL微量离心管。
   4. 向每个试管中加入400μL乙酸铵缓冲液和0.5μLATP储备溶液（在步骤3.2中制备），并在室温下摇动孵育1小时。
   5. 在4°C下以10，000× g 旋转步骤7.1.2和7.1.4制备的样品1分钟并弃去上清液。
   6. 用500μL乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀10分钟，并在4°C下以10，000× g 再次旋转1分钟，并弃去上清液。
   7. 向每个沉淀物中加入220μL乙酸铵缓冲液，25μL10%正常山羊血清和5μL原代抗BDNF抗体。在冷室（4°C）中摇孵过夜。
   8. 孵育步骤完成后，将混合物在4°C下以10，000× g 旋转1分钟并弃去上清液。
   9. 用含有1%温和洗涤剂（例如，胆酸钠）的乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀3次10分钟，并在4°C下以10，000× g 旋转混合物1分钟并丢弃上清液。
   10. 通过混合900μL乙酸铵缓冲液，100μL10%正常山羊血清和1μL荧光团偶联二抗（1:1，000稀释）制备二抗溶液。向步骤7.1.9中获得的每个沉淀中加入300μL二抗溶液。并在4°C下振荡孵育过夜。
   11. 将混合物在4°C下以10，000× g 旋转1分钟，并弃去上清液。
   12. 用含有1%温和洗涤剂（例如，胆酸钠）的乙酸铵缓冲液洗涤所得沉淀3次10分钟，并在4°C下以10，000× g 旋转混合物1分钟，弃去上清液。
   13. 将所得沉淀重悬于50μL乙酸铵缓冲液中。将20μL每种混合物放在载玻片上，并用盖玻片盖住。
   14. 对 IAM 进行映像。个人电脑。DD2颗粒与固定化的细胞膜片段使用共聚焦激光扫描显微镜，其激发在488nm处，在520nm处发射，使用固态激光系统产生。使用数值孔径为0.75、宽径为0.35mm的20倍物镜。
2. 使用 7，8-DHF 作为标记配体的额叶亲和色谱
   1. 使用二极管阵列检测器和/或质谱仪将CMAC色谱柱连接到HPLC系统。
   2. 在含有5%甲醇的乙酸铵缓冲液中制备500 mL 1 mM 7，8-DHF溶液。
   3. 在室温下以0.4 mL/min的流速泵送标记配体（1 mM）恒定浓度通过CMAC色谱柱。使用二极管阵列检测（DAD）（波长254nm）检测器或质谱仪（使用单离子监测模式;负电离模式下使用m / z 253）监测洗脱曲线。
   4. 运行完成后，通过将乙酸铵缓冲液通过色谱柱进行过夜洗涤。
   5. 重复步骤 7.2.2。- 7.2.4.使用不同浓度的标记配体（750 nM，500 nM，300 nM），每次运行后洗涤色谱柱过夜。使用额叶亲和色谱法计算配体 K_d，如其他地方详细回顾的那样。^24，51
3. 亚洲积雪草（L.）Urb的位移研究。（积雪草）提取物
   1. 在含有5%甲醇和0.2%利古柯菌水提取物（10mg / mL）的乙酸铵缓冲液中制备500mL 500 nM 7，8-DHF溶液。
   2. 泵恒定浓度的标记配体（500 nM）与提取物在室温下以0.4 mL / min流速通过色谱柱。使用DAD检测器（波长254nm）或质谱仪（使用单离子监测模式;负电离模式下的m / z 253）监测洗脱曲线。
   3. 运行完成后，通过将乙酸铵缓冲液通过色谱柱进行过夜洗涤。
   4. 绘制500 nM 7，8-DHF的洗脱曲线和用积雪草提取物运行溶液后获得的洗脱曲线，以检查标记配体位移。

8. 缺少峰色谱法来鉴定积雪草提取物中潜在的 TrkB 结合剂

1. 在CMAC柱上分馏雷度可乐提取物
   1. 将CMAC TrkB和TrkB-NULL色谱柱分别连接到HPLC系统，并在每个色谱柱上注入50μL水性积雪草提取物（10mg / mL）。在室温下以0.4 mL/min流速泵送含有5%甲醇的醋酸铵缓冲液（10 mM，pH 7.4）通过色谱柱。
   2. 从CMAC TrkB和TrkB-NULL列中分别收集馏分，如下所示:0-5分钟，5-10分钟，10-15分钟，15-20分钟，20-25分钟，25-30分钟，30-35分钟，35-40分钟，40-45分钟，45-50分钟，50-55分钟，55-60分钟。
   3. 冷冻并冻干获得的级分。在进行超高效液相色谱和质谱分析之前，在50μL甲醇中重悬冻干级分。
2. 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析积雪草CMAC组分
   1. 分析在点8.1.3中获得的所有分数。使用质谱仪与UPLC系统耦合（UPLC-MS^E 分析模式）。使用C18色谱柱（2.1 x 50 mm，1.7 μm）和C18 VanGuard预柱（2.1 mm x 5 mm，1.7 μm）分析馏分。
   2. 使用以下梯度溶液以0.3 mL / min的流速洗脱柱，流动相A（含0.1%甲酸的水）和B（乙腈与0.1%甲酸）:0.0分钟99%A 1%B，1.5分钟84%A 16%B，5.0分钟80%A 20%B，7.0分钟75%A 25%B， 10.0分钟65%A 35%B，20.0-24.0分钟1%A 99%B，25.0-29.0分钟99%A 1%B。
   3. 将每个样品的进样体积设置为3 μL.在分辨率正离子和负离子模式下执行MS^E ，低能量为4V，高能量为20-35 V。
   4. 在正电离模式下使用以下ESI源条件:毛细管电压1.5 kV，采样锥40 V，源偏移80，源温度100°C，脱溶温度350°C，锥体气流量38.0 L/h，脱溶剂气体400 L/h。
   5. 在负电离模式下使用以下ESI源条件:毛细管电压1.45 kV，采样锥40 V，源偏移80，源温度110°C，脱溶温度300°C，锥体气流量50.0 L/h，脱溶剂气体流量652 L/h。

结果

按照该方案，组装了两个CMAC色谱柱:一个具有固定化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞膜片段，具有过度表达的TrkB，另一个具有SH-SY5Y TrkB-NULL细胞膜片段。正确组装的CMAC柱如图 1 所示，细胞膜碎片固定所涉及的步骤如图 2所示。

自从在IAM上固定TrkB受体以来。个人电脑。以前没有尝试过DD2色谱固定相，使用标记配体的抗体染色和额亲和色谱?...

讨论

鉴定存在于特化代谢物的复杂混合物中的活性化合物²³是一项非常具有挑战性的任务。传统上，分离单个化合物，并在不同的测定中测试其活性。这种方法既耗时又昂贵，并且经常导致分离和鉴定最丰富和最有特征的化合物²³。目前使用的高通量筛选测定法严重依赖于筛选具有已知靶点的组合化学文库，并且不是设计用于鉴定和分离复杂混合物中存在的生物活性...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon C2 DUVb	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA