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Résumé

Le protocole décrit la préparation de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire (CMAC) avec des fragments de membrane cellulaire immobilisés contenant des protéines fonctionnelles du récepteur B de la tropomyosine kinase transmembranaire. L’utilisation des colonnes CMAC dans l’identification des métabolites végétaux spécialisés interagissant avec ces récepteurs et présents dans des mélanges naturels complexes est également expliquée.

Résumé

Les produits chimiques synthétisés par les plantes, les champignons, les bactéries et les invertébrés marins ont été une riche source de nouveaux médicaments et de pistes. Des médicaments tels que les statines, la pénicilline, le paclitaxel, la rapamycine ou l’artémisinine, couramment utilisés dans la pratique médicale, ont d’abord été identifiés et isolés à partir de produits naturels. Cependant, l’identification et l’isolement des métabolites spécialisés biologiquement actifs à partir de sources naturelles est un processus difficile et long. Traditionnellement, les métabolites individuels sont isolés et purifiés à partir de mélanges complexes, après l’extraction de la biomasse. Par la suite, les molécules isolées sont testées dans des tests fonctionnels pour vérifier leur activité biologique. Nous présentons ici l’utilisation de colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC) pour identifier les composés biologiquement actifs directement à partir de mélanges complexes. Les colonnes CMAC permettent d’identifier les composés interagissant avec les protéines transmembranaires fonctionnelles (TMP) immobilisées intégrées dans leur environnement bicouche phospholipidique natif. Il s’agit d’une approche ciblée, qui nécessite de connaître le TMP dont on entend moduler l’activité avec le candidat médicament à petite molécule nouvellement identifié. Dans ce protocole, nous présentons une approche pour préparer des colonnes CMAC avec le récepteur B immobilisé de la tropomyosine kinase (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour assembler la colonne CMAC avec des récepteurs TrkB immobilisés en utilisant des lignées cellulaires de neuroblastome surexprimant les récepteurs TrkB. Nous présentons en outre l’approche pour étudier la fonctionnalité de la colonne et son utilisation dans l’identification de métabolites végétaux spécialisés interagissant avec les récepteurs TrkB.

Introduction

Les mélanges botaniques sont riches en composés pharmacologiquement actifs1, servant de bonne source pour l’identification de nouveaux médicaments et conduit 2,3,4,5. La découverte de nouveaux médicaments à partir de produits naturels a été une approche fructueuse et de nombreux médicaments actuellement approuvés proviennent de composés identifiés pour la première fois dans la nature. La diversité chimique des composés naturels est difficile à égaler par des bibliothèques artificielles de molécules synthétisées chimiquement. De nombreux composés naturels interagissent avec et modulent des cibles protéiques humaines et peuvent être considérés comme des molécules semblables à des médicaments optimisées sur le plan de l’évolution6. Ces composés naturels sont particulièrement bien adaptés à l’identification des plombs médicamenteux à utiliser dans les troubles neurologiques6. Deux des médicaments actuellement approuvés par la FDA pour la prise en charge de la maladie d’Alzheimer (MA) sont dérivés d’alcaloïdes naturels, à savoir: la galantamine et la rivastigmine (un dérivé de la physostigmine)6. La L-DOPA, actuellement le médicament le plus couramment prescrit pour la maladie de Parkinson, a été identifiée pour la première fois à partir de la fève (Vicia faba L.) 7. Pergolide et lisuride, agonistes des récepteurs dopaminergiques sont les dérivés des alcaloïdes naturels de l’ergot du champignon parasite Claviceps purpurea8. La réserpine, un alcaloïde isolé de la racine de serpent indienne (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) a été l’un des premiers médicaments antipsychotiques9. Récemment, la réponse immunitaire dérégulée et l’inflammation systémique ont été liées au développement de nombreuses affections neurologiques, telles que les troubles dépressifs majeurs ou les maladies neurodégénératives10. Un régime à base de plantes ainsi que d’autres interventions sur le mode de vie ont été trouvés pour améliorer les capacités cognitives et fonctionnelles chez lespersonnes âgées 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Certaines molécules électrophiles appartenant aux triterpènes et aux polyphénols ont été trouvées pour moduler les réponses inflammatoires dans les modèles in vitro et in vivo 12. Par exemple, les composés naturels contenant du α β carbonyle insaturé (p. ex., curcumine, cinnamaldéhyde) ou du groupe isothiocyanate (p. ex., sulforaphane) interfèrent avec la dimérisation du récepteur 4 de type Toll (TLR4) inhibant la synthèse en aval de cytokines pro-inflammatoires dans une lignée cellulaire pro-B dépendante de l’interleukine-3 murine12,22 . Les données épidémiologiques indiquent clairement que les composés phytochimiques alimentaires, présents dans les matrices alimentaires complexes, peuvent également constituer une source viable de nouveaux médicaments6.

L’un des principaux obstacles à l’identification des molécules biologiquement actives présentes dans les extraits de plantes, y compris les aliments à base de plantes, est la complexité des échantillons étudiés. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés, purifiés et ensuite testés pour leur activité biologique. Cette approche conduit généralement à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés. Les approches phénotypiques de découverte de médicaments sans cible moléculaire définie reposent sur le fractionnement bioguidé de mélanges complexes23. Dans cette approche, un extrait est fractionné en sous-fractions moins complexes qui sont ensuite testées dans des essais phénotypiques. L’isolement et la purification des composés actifs sont guidés par l’activité biologique vérifiée dans le test. La connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifiée peut accélérer considérablement l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans les mélanges complexes. Ces approches sont généralement basées sur l’immobilisation de la cible moléculaire, par exemple, une enzyme, sur une surface solide, comme les billes magnétiques23. Les cibles immobilisées sont ensuite utilisées dans les expériences de criblage, ce qui permet d’isoler les composés interagissant avec la cible. Bien que cette approche ait été largement utilisée dans l’identification de composés ciblant les protéines cytosoliques, elle a été moins couramment appliquée dans l’identification des produits chimiques interagissant avec les protéines transmembranaires (TMP)23. Un défi supplémentaire dans l’immobilisation des TMP provient du fait que l’activité de la protéine dépend de son interaction avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres molécules dans la bicouche telles que le cholestérol23,24. Il est important de préserver ces interactions subtiles entre les protéines et leur environnement bicouche phospholipidique natif lorsque l’on tente d’immobiliser la cible transmembranaire.

Dans la chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC), les fragments de membrane cellulaire, et non les protéines purifiées, sont immobilisés sur les particules de phase stationnaire de la membrane artificielle (IAM)23. Les phases stationnaires IAM sont préparées en liant de manière covalente des analogues de la phosphatidylcholine sur de la silice. Récemment, de nouvelles classes de phases stationnaires IAM ont été développées dans lesquelles les groupes amine et silanol libres sont plafonnés (IAM. PC. Particules DD2). Au cours de la préparation des colonnes CMAC, des fragments de membrane cellulaire sont immobilisés à la surface des particules IAM par adsorption.

Les colonnes de l’ACMC ont été utilisées à ce jour pour immobiliser différentes classes de TMP, y compris les canaux ioniques (p. ex., les récepteurs nicotiniques), les RCPG (p. ex., les récepteurs opioïdes), les transporteurs de protéines (p. ex., p-glycoprotéine), etc.24. Les cibles protéiques immobilisées ont été utilisées dans la caractérisation de la pharmacodynamique (p. ex., constante de dissociation, Kd) ou dans la détermination de la cinétique de liaison (kon et koff) de ligands de petites molécules interagissant avec la cible ainsi que dans le processus d’identification de nouveaux médicaments potentiels présents dans des matrices complexes24 . Nous présentons ici la préparation de colonnes CMAC avec le récepteur immobilisé de la tropomyosine kinase B (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux.

Des études antérieures ont montré que l’activation de la voie du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) / TrkB est associée à l’amélioration de certaines affections neurologiques, telles que la MA ou le trouble dépressif majeur 25,26,27,28. Il a été rapporté que les niveaux de BDNF et son expression de récepteur TrkB diminuent dans la MA, et des réductions similaires altèrent la fonction hippocampique dans les modèles animaux de AD29. Une diminution des taux de BDNF a été rapportée dans le sérum et le cerveau des patients atteints de MA 30,31,32. La surexpression de Tau ou l’hyperphosphorylation régulent à la baisse l’expression du BDNF dans les neurones primaires et les modèles animaux AD 33,34,35. De plus, le BDNF aurait des effets protecteurs sur la neurotoxicité induite par la β-amyloïde in vitro et in vivo36. Il a été démontré que l’administration directe de BDNF dans le cerveau du rat augmentait l’apprentissage et la mémoire chez les animaux atteints de troubles cognitifs37. BdNF /TrkB est apparu comme une cible valide pour améliorer les troubles neurologiques et psychiatriques, y compris AD28,38. Le ciblage de la voie de signalisation BDNF/TrkB pour le développement de thérapies dans la MA améliorera potentiellement notre compréhension de la maladie39. Malheureusement, le BDNF lui-même ne peut pas être utilisé comme traitement en raison de ses mauvaises propriétés pharmacocinétiques et de ses effets secondaires indésirables40. Les activateurs de petites molécules des voies TrkB/BDNF ont été explorés en tant que ligands TrkB potentiels 41,42,43. Parmi les agonistes de petites molécules testés, la 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF), il a été démontré qu’il active la voie BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un dérivé du 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phényl-4H-chromene-7,8-diyl bis(méthylcarbamate)) est actuellement à l’étude comme médicament possible pour AD47. Récemment, il a été démontré que plusieurs antidépresseurs agissent en se liant directement au TrkB et en favorisant la signalisation du BDNF, soulignant davantage l’importance de poursuivre le TrkB comme cible valide pour traiter divers troubles neurologiques48.

Le protocole décrit le processus d’assemblage de la colonne TrkB fonctionnelle et de la colonne de contrôle négatif TrkB-NULL. Les colonnes sont caractérisées à l’aide d’un ligand de petite molécule de produit naturel connu: le 7,8-DHF. En outre, nous décrivons le processus de criblage de matrices complexes, en utilisant l’extrait de plante comme exemple, pour l’identification des composés interagissant avec TrkB.

Protocole

1. Culture cellulaire de cellules de neuroblastome SH-SY5Y (lignées cellulaires TrkB et TrkB-NULL (parentales))

REMARQUE: Lignées cellulaires (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) et SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL)))49,50 ont été achetées auprès de Kerafast. Les cellules cultivées sont utilisées comme source des récepteurs transmembranaires à immobiliser pour la préparation des colonnes CMAC. Les étapes suivantes décrivent comment obtenir des fragments de membrane cellulaire et assembler des colonnes CMAC fonctionnelles.

  1. Cultiver les cellules dans un milieu de culture cellulaire préparé en mélangeant 450 mL de milieu RPMI, 50 mL de FBS, 5 mL de solution de pénicilline/streptomycine et 0,3 mg/mL de généticine (G418) dans une boîte de culture cellulaire de 150 mm à 37 °C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO2.

2. Récolte cellulaire

  1. Confirmer la confluence cellulaire (80% -90%) à l’aide d’un microscope, atteint après 3-4 jours après le passage cellulaire.
  2. Aspirer le milieu de culture cellulaire au-dessus des cellules et laver les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 1x, pH 7,4). Retirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine faiblement concentrée (0,25 %) pour détacher les cellules.
  3. Faites tourbillonner doucement la plaque pour recouvrir uniformément toutes les cellules avec une solution de trypsine et incuber les cellules pendant environ 2 min à 37 °C dans une atmosphère humide avec 5% de CO2. Ajouter 8 mL de milieu de culture cellulaire aux cellules qui se détachent et transférer les cellules détachées dans un tube conique de 50 mL et le placer sur de la glace.
  4. Utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre de cellules (environ 3 x 107 cellules). Mélanger la suspension cellulaire en pipetant de haut en bas pour obtenir une densité cellulaire uniforme dans le mélange. Placez 10 μL de suspension cellulaire sous le couvercle et comptez les cellules au microscope à l’aide d’un objectif 40x.

3. Homogénéisation cellulaire

  1. Préparer des solutions mères des inhibiteurs de la protéase suivants : benzamidine (200 mM), fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, 10 mM) et cocktail d’inhibiteurs de protéase disponibles dans le commerce (concentration de 100x) contenant du chlorhydrate de fluorure de 4-(2-aminoéthyl)benzènesulfonyle (AEBSF), de l’aprotinine, de la bestatine et de la leupeptine.
    ATTENTION : Le PMSF ne doit être manipulé qu’à l’intérieur de la hotte.
    1. Préparer la solution mère de benzamidine (200 mM) en dissolvant 120 mg de benzamidine dans 5 mL d’eau désionisée ultrapure. Conserver à 4 °C et utiliser dans la journée. Préparer fraîchement la solution avant chaque utilisation (recommandé).
    2. Préparer la solution mère de PMSF (10 mM) en dissolvant 0,017 g de PMSF dans 10 mL d’éthanol. Conserver à - 20 °C.
    3. Préparer un cocktail d’inhibiteurs de protéase (100x) en dissolvant le mélange d’inhibiteurs de protéase disponible dans le commerce dans 1 mL d’eau désionisée ultrapure. Bien mélanger et aliquoter 200-300 μL du cocktail et conserver à - 20 °C avant utilisation.
  2. Préparer la solution mère d’ATP (100 mM) en dissolvant 55,114 mg d’hydrate de sel disodique d’ATP dans 1 mL d’eau ultrapure désionisée. Bien mélanger et aliquoter 100 μL du mélange et conserver à - 20 °C avant utilisation.
  3. Préparer le tampon en dissolvant 3,03 g de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g de chlorure de sodium (NaCl, 100 mM), 0,22 g de chlorure de calcium anhydre (CaCl2, 3 mM), 0,2 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2, 2 mM) et 0,19 de chlorure de potassium (KCl, 5 mM) dans 500 mL d’eau désionisée ultrapure.
  4. Préparer le tampon d’homogénéisation en mélangeant 17,3 mL du tampon préparé à l’étape 3.3 avec 0,3 mL (3 mM) de solution mère de benzamidine, 0,2 mL (0,1 mM) de solution mère pmSF, 0,2 mL de mélange cocktail inhibiteur de protéase, 20 μL (100 μM) de solution mère d’ATP, 2 mL (10 %) de glycérol et 0,029 g (5 mM) d’EDTA (tableau 1). Ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique.
  5. Faire tourner les cellules récoltées à l’étape 2.3 à 4 °C pendant 5 min à 400 x g. Retirez le surnageant et lavez la pastille de cellule restante avec 10 mL de PBS glacé (1x, pH 7,4). Faites tourner à nouveau les cellules à 4 °C pendant 5 min à 400 x g.
  6. Jeter le surnageant et le remplacer par 20 mL de tampon d’homogénéisation préparé à l’étape 3.4. Placez le tube conique sur de la glace.
  7. Transférer la suspension cellulaire dans un broyeur de tissu homogénéisateur Dounce de 40 mL et la placer sur de la glace. Homogénéisez la suspension manuellement, sur glace, à l’aide de 40 coups de pilon de haut en bas. Transférer la suspension cellulaire homogénéisée dans un tube conique de 50 mL.
  8. Centrifuger l’homogénat à 4 °C pendant 7 min à 400 x g. Jeter la pastille et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique et le centrifuger à 4 °C pendant 30 min à 47900 x g. Conservez la pastille de membrane cellulaire et jetez le surnageant.

4. Solubilisation de la membrane cellulaire

  1. Préparer le tampon de solubilisation en mélangeant 8,7 mL de la solution tampon obtenue à l’étape 3.3 avec 0,1 mL (0,1 mM) de solution mère PMSF, 0,15 mL (3 mM) de solution mère de benzamidine, 0,1 mL de cocktail d’inhibiteurs de protéase, 10 μL (100 μM) de solution mère d’ATP, 1 mL (10 %) de glycérol et 0,2 g (2 %) de cholate de sodium (tableau 2).
  2. Transférer le tampon de solubilisation dans le tube conique avec des fragments de membrane cellulaire obtenus à l’étape 3.8 et remettre la pastille en suspension. Faire pivoter le mélange obtenu à 150 tr/min à 4 °C pendant 18 h.
    REMARQUE: À ce stade, l’expérience peut être suspendue pour la solubilisation de pastille de membrane cellulaire pendant la nuit.

5. Immobilisation de la membrane cellulaire sur IAM. PC. Particules de DD2

  1. Après 18 h, centrifuger le mélange de solubilisation à 4 °C pendant 30 min à 47900 x g.
  2. Conservez le surnageant et jetez la pastille. Ajouter 100 mg d’IAM. PC. Particules DD2, au surnageant, vortex et rotation du mélange de suspension résultant à 150 tr/min à 4 °C pendant 1 h.
  3. Faciliter l’immobilisation des fragments de membrane cellulaire sur l’IAM. PC. Les particules de DD2 passent à l’étape de dialyse comme indiqué ci-dessous.
    1. Préparer le tampon de dialyse dans 4 L d’eau désionisée ultrapure en ajoutant 24 g de tris-HCl (50 mM), 23,4 g de NaCl (100 mM), 0,06 g de CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g d’EDTA (5 mM) et 0,07 g de PMSF (0,1 mM; Tableau 3).
      REMARQUE: PmSF n’est pas soluble dans l’eau, donc dissolvez-le d’abord dans un petit volume d’éthanol, puis ajoutez-le lentement dans le bécher avec le tampon.
    2. Ajuster le pH à 7,4 avec une solution d’acide chlorhydrique. Placer le tampon à 4 °C pendant au moins 1 h avant de passer à l’étape de dialyse.
    3. Préparer le tube de dialyse en coupant 10 cm de tube de dialyse à membrane de cellulose (10 K MWCO, 35 mm) et transférer la suspension contenant de l’IAM. PC. Particules DD2 et fragments de membrane cellulaire dans le tube de dialyse. Utilisez des clips de tube de dialyse pour fermer les deux extrémités du tube de dialyse.
    4. Placez le tube de dialyse contenant l’IAM. PC. DD2 phase stationnaire dans le tampon de dialyse et dialyze à 4 °C pendant 24 h en remuant doucement.
    5. Après 24 h, placez le tube de dialyse dans le tampon de dialyse fraîchement préparé et poursuivez la dialyse pendant encore 24 heures.

6. Emballage des colonnes de l’ACMC

  1. Préparer un tampon d’acétate d’ammonium (10 mM, pH 7,4) qui sera utilisé pour laver l’IAM. PC. Particules DD2 et dans des expériences de caractérisation en colonne en dissolvant 0,7708 g d’acétate d’ammonium dans 1 L d’eau désionisée ultrapure. Ajuster le pH à 7,4 avec une solution d’acide chlorhydrique.
  2. Après 48 h de dialyse, retirez le tube de dialyse du tampon de dialyse et transférez le contenu du tube de dialyse dans un tube conique de 15 mL.
  3. Centrifuger le mélange à 4 °C pendant 5 min à 400 x g. Jeter le surnageant et laver la pastille restante trois fois avec 10 mL de tampon d’acétate d’ammonium, en centrifugant le mélange à 4 °C pendant 5 min à 400 x g, après chaque lavage.
  4. Après le troisième lavage, remettre en suspension la pastille restante dans 1 mL de tampon d’acétate d’ammonium. Mélangez-le soigneusement et utilisez la boue résultante pour emballer la colonne de verre 5/20 afin d’obtenir la colonne de chromatographie CMAC.
  5. Pour emballer la colonne, placez d’abord un filtre inférieur préalablement imbibé d’un tampon d’acétate d’ammonium dans le porte-filtre. Placez le porte-filtre dans la colonne de verre et vissez le capuchon de la colonne pour sécuriser la position du support. Placez la colonne verticalement dans une pince à doigts et fixez-la dans le support de laboratoire. Placez un bécher sous la colonne.
  6. À l’aide d’un pipetteur à canal unique, transférez un petit volume de la boue obtenue à l’étape 6.4 dans la colonne de verre. Versez le matériau lentement, en tenant la pointe de la pipette contre la paroi de la colonne de verre. Laissez le matériau d’emballage se déposer avant de verser un autre volume de boue.
  7. Pour accélérer le processus d’emballage, retirez le tampon au-dessus du lit fixe à l’aide d’une micropipette entre chaque étape. Répétez ces étapes jusqu’à ce que 1 mL de la boue soit emballé.
  8. Placez un filtre supérieur et vissez l’adaptateur de sorte qu’il ne reste plus de tampon au-dessus de la phase stationnaire, comme illustré à la figure 1. Fixez la position de l’adaptateur à l’aide du verrou de l’adaptateur.
  9. Connectez la colonne à une pompe de chromatographie liquide à haute performance (CLHP), réglez le débit à 0,2 mL/min et lavez la colonne pendant la nuit avec un tampon d’acétate d’ammonium. La colonne est maintenant prête pour l’étape de caractérisation. Conserver la colonne à 4 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE: Pour un stockage plus long (colonne non utilisée pendant plus d’une semaine), faites fonctionner la colonne avec une solution d’azoture de sodium à 0,05% dans un tampon d’acétate d’ammonium et conservez-la à 4 ° C.
    ATTENTION: L’azoture de sodium est très toxique lorsqu’il est ingéré par voie orale ou absorbé par la peau; il ne doit être manipulé que sous la hotte. Assurez-vous de porter une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants (nitrile de préférence) lorsque vous travaillez avec de l’azoture de sodium.

7. Caractérisation des colonnes de l’ACMC

  1. Microscopie confocale et liaison BDNF
    1. Préparez l’IAM. Pcc. Particules de phase stationnaire DD2 avec des fragments de membrane cellulaire immobilisés obtenus séparément des cellules de neuroblastome SH-SY5Y surexprimant les cellules TrkB et SH-SY5Y TrkB-NULL en suivant les instructions de l’étape 1 à l’étape 6.4.
    2. Pour les échantillons qui seront incubés avec du BDNF avant la coloration des anticorps, préparer la solution mère de BDNF en dissolvant 10 μg de BDNF dans 100 μL d’eau désionisée ultrapure. Conserver la solution à -20 °C.
      1. Transfert dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 mL, aliquote de 100 μL d’IAM. PC. Matériau d’emballage de colonne DD2 avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y immobilisées surexprimant TrkB et aliquote de 100 μL d’IAM. PC. Matériau d’emballage de colonne DD2 avec des cellules SH-SY5Y TrkB-NULL immobilisées en suspension dans un tampon d’acétate d’ammonium.
      2. Ajouter 390 μL de tampon d’acétate d’ammonium, 10 μL de solution mère de BDNF et 0,5 μL de solution mère d’ATP (préparée à l’étape 3.2) dans chaque tube et incuber pendant 1 h à température ambiante avec basculement.
    3. Pour les échantillons qui ne seront pas incubés avec du BDNF avant la coloration des anticorps, transférer 100 μL aliquote d’IAM. PC. Matériau d’emballage de colonne DD2 avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y immobilisées surexprimant TrkB en suspension dans de l’acétate d’ammonium dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
    4. Ajouter 400 μL de tampon d’acétate d’ammonium et 0,5 μL de solution mère d’ATP (préparée à l’étape 3.2) dans chaque tube et incuber pendant 1 h à température ambiante avec basculement.
    5. Faire tourner les échantillons préparés aux étapes 7.1.2 et 7.1.4 à 4 °C pendant 1 min à 10 000 x g et jeter le surnageant.
    6. Laver les pastilles obtenues avec 500 μL de tampon d’acétate d’ammonium pendant 10 min et tourner à nouveau à 4 °C pendant 1 min à 10 000 x g et jeter le surnageant.
    7. À chacune des pastilles, ajouter 220 μL de tampon d’acétate d’ammonium, 25 μL de sérum de chèvre normal à 10 % et 5 μL d’anticorps anti-BDNF primaire. Incuber dans une chambre froide (4 °C) pendant la nuit avec bercement.
    8. À la fin de l’étape d’incubation, faire tourner le mélange pendant 1 min à 10 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
    9. Laver la pastille obtenue 3 fois avec un tampon d’acétate d’ammonium contenant 1 % de détergent doux (p. ex. cholate de sodium) pendant 10 min et filer les mélanges pendant 1 min à 10 000 x g à 4 °C et jeter le surnageant.
    10. Préparer une solution d’anticorps secondaire en mélangeant 900 μL de tampon d’acétate d’ammonium, 100 μL de sérum de chèvre normal à 10 % et 1 μL d’anticorps secondaire conjugué au fluorophore (dilution 1:1 000). Ajouter 300 μL de solution d’anticorps secondaires à chacune des pastilles obtenues à l’étape 7.1.9. et incuber toute la nuit à 4 °C avec bercement.
    11. Faire tourner le mélange à 10 000 x g pendant 1 min à 4 °C et jeter le surnageant.
    12. Lavez la pastille obtenue 3 fois avec un tampon d’acétate d’ammonium contenant 1 % de détergent doux (p. ex. cholate de sodium) pendant 10 min et faites tourner le mélange pendant 1 min à 10 000 x g à 4 °C et jetez le surnageant.
    13. Remettre en suspension les pastilles résultantes dans 50 μL de tampon d’acétate d’ammonium. Placer 20 μL de chacun des mélanges sur une lame et recouvrir d’un couvercle.
    14. Imagez l’IAM. PC. Particules DD2 avec les fragments de membrane cellulaire immobilisés à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal avec excitation à 488 nm et émission à 520 nm générée à l’aide d’un système laser à l’état solide. Utilisez un objectif 20x avec un NA de 0,75 et un WD de 0,35 mm.
  2. Chromatographie d’affinité frontale utilisant le 7,8-DHF comme ligand marqueur
    1. Connectez une colonne CMAC à un système HPLC à l’aide d’un détecteur à réseau de diodes et/ou d’un spectromètre de masse.
    2. Préparer 500 mL de solution de 1 mM de 7,8-DHF dans un tampon d’acétate d’ammonium contenant 5 % de méthanol.
    3. Pomper la concentration constante du ligand marqueur (1 mM) à travers la colonne CMAC à un débit de 0,4 mL/min à température ambiante. Surveillez le profil d’élution à l’aide d’un détecteur de détection de réseau de diodes (DAD) (longueur d’onde 254 nm) ou d’un spectromètre de masse (utilisez le mode de surveillance des ions simples; m /z 253 en mode d’ionisation négative).
    4. Une fois l’exécution terminée, effectuez un lavage de nuit en faisant passer un tampon d’acétate d’ammonium à travers la colonne.
    5. Répétez les étapes 7.2.2. - 7.2.4. en utilisant différentes concentrations du ligand marqueur (750 nM, 500 nM, 300 nM), en lavant les colonnes pendant la nuit après chaque course. Utilisez la chromatographie d’affinité frontale pour calculer le ligand Kd, comme examiné en détail, ailleurs. 24,51
  3. Études de déplacement avec Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extrait
    1. Préparer 500 mL de solution de 500 nM de 7,8-DHF dans un tampon d’acétate d’ammonium contenant 5 % de méthanol et 0,2 % d’extrait aqueux de gotu kola (10 mg/mL).
    2. Pomper la concentration constante du ligand marqueur (500 nM) avec l’extrait à travers la colonne à un débit de 0,4 mL/min à température ambiante. Surveillez le profil d’élution à l’aide d’un détecteur DAD (longueur d’onde 254 nm) ou d’un spectromètre de masse (utilisez le mode de surveillance ionique unique; m/z 253 en mode d’ionisation négative).
    3. Une fois l’exécution terminée, effectuez un lavage de nuit en faisant passer un tampon d’acétate d’ammonium à travers la colonne.
    4. Tracer les profils d’élution pour 500 nM 7,8-DHF et celui obtenu après avoir exécuté la solution avec de l’extrait de gotu kola pour inspecter le déplacement du ligand marqueur.

8. Approche de chromatographie de pointe manquante pour identifier les liants TrkB potentiels à partir de l’extrait de gotu kola

  1. Fractionnement de l’extrait de gotu kola sur les colonnes CMAC
    1. Connectez séparément les colonnes CMAC TrkB et TrkB-NULL à un système HPLC et injectez 50 μL d’extrait aqueux de gotu kola (10 mg/mL) sur chacune des colonnes. Tampon d’acétate d’ammonium de la pompe (10 mM, pH 7,4) contenant 5 % de méthanol à travers la colonne à un débit de 0,4 mL/min à température ambiante.
    2. Collectez les fractions séparément des colonnes CMAC TrkB et TrkB-NULL comme suit : 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Congeler et lyophiliser les fractions obtenues. Remettre en suspension des fractions lyophilisées dans 50 μL de méthanol avant de procéder à la chromatographie liquide ultra-performante et à l’analyse par spectrométrie de masse.
  2. Analyse par chromatographie liquide ultra-performante par spectrométrie de masse quadrupolaire à temps de vol (UPLC-QTOF-MS) des fractions CMAC de gotu kola
    1. Analyser toutes les fractions obtenues au point 8.1.3. à l’aide d’un spectromètre de masse couplé à un système UPLC (mode d’analyse UPLC-MSE ). Analysez les fractions à l’aide d’une colonne C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) avec une précolonne C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Éluer la colonne à l’aide des solutions de gradient suivantes à un débit de 0,3 mL/min avec la phase mobile A (eau avec 0,1 % d’acide formique) et B (acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique) : 0,0 min 99 % A 1 % B, 1,5 min 84 % A 16 % B, 5,0 min 80 % A 20 % B, 7,0 min 75 % A 25 % B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
    3. Réglez le volume d’injection pour chaque échantillon à 3 μL. Effectuez MSE en mode ion positif et négatif de résolution, avec une énergie de collision à 4V pour une faible énergie et à 20-35 V pour une énergie élevée.
    4. Utilisez les conditions de source ESI suivantes en mode d’ionisation positive : tension capillaire 1,5 kV, cône d’échantillonnage 40 V, décalage de la source 80, température de la source 100 °C, température de désolvation 350 °C, débit de gaz conique 38,0 L/h, gaz de désolvation 400 L/h.
    5. Utilisez les conditions de source ESI suivantes en mode d’ionisation négative : tension capillaire 1,45 kV, cône d’échantillonnage 40 V, décalage de la source 80, température de la source 110 °C, température de désolvation 300 °C, débit de gaz conique 50,0 L/h, débit de gaz de solvatation 652 L/h.

Résultats

Suivant le protocole, deux colonnes chromatographiques du CMAC ont été assemblées : l’une avec les fragments de membrane cellulaire du neuroblastome SH-SY5Y immobilisés avec TrkB surexprimé et l’autre avec des fragments de membrane cellulaire SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonne CMAC correctement assemblée est présentée à la figure 1 et les étapes impliquées dans l’immobilisation des fragments de membrane cellulaire sont présentées à la figure 2.

Discussion

L’identification des composés actifs présents dans les mélanges complexes de métabolites spécialisés est une tâche très difficile23. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés et leur activité est testée dans différents essais. Cette approche est longue et coûteuse et conduit souvent à l’isolement et à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés23. Les essais de criblage à haut débit actuellement utili...

Déclarations de divulgation

Lukasz Ciesla collabore avec Regis Technologies, le fournisseur de l’IAM. PC. Particules DD2.

Remerciements

Z.C.A. a été soutenu par le Conseil de la recherche scientifique et technologique de Turquie (TUBITAK) 2219 - Programme international de bourses de recherche postdoctorale. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Center for Complementarary and Integrative Medicine des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution 1R41AT011716-01. Ce travail a également été partiellement soutenu par l’American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, la subvention Regis Technologies à L.C. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Dihydroxyflavone hydrateSigma-AldrichD5446-10 mg≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-AldrichA2383-1 g
Ammonium acetateVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
BDNF antibodyInvitrogenPA5-15198-400 μLPrimary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μgRecombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chlorideVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Cholic acid sodium saltAlfa AesarJ62050-100 g
Dounce homogenizerVWR71000-51640 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EthanolSigma-Aldrich493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442-500 mLsterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solutionSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrateVWR AnalyticalBDH9244-500 mL
MethanolSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbNikonConfocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)Life Technologies50197Z
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Potassium chlorideVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Protease inhibitor cocktailVWR Life Science AmbresoM221-1 mLProteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLwith L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell lineKerafastECP005
Snake skin dialysis tubingThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium chlorideBDH VWR AnalyticalBDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 columnGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4049-500 mL0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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