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要約

プロトコールは、機能的な膜貫通型トロポミオシンキナーゼ受容体Bタンパク質を含む固定化細胞膜断片を用いた細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの調製を記載しています。これらの受容体と相互作用し、複雑な天然混合物中に存在する特殊な植物代謝産物の同定におけるCMACカラムの使用についても説明します。

要約

植物、真菌、細菌、海洋無脊椎動物によって合成された化学物質は、新薬のヒットとリードの豊富な供給源となっています。医療現場で一般的に使用されるスタチン、ペニシリン、パクリタキセル、ラパマイシン、またはアルテミシニンなどの医薬品は、最初に同定され、天然物から単離されています。しかし、天然源からの生物学的に活性な特殊代謝産物の同定および単離は、困難で時間のかかるプロセスである。伝統的に、個々の代謝産物は、バイオマスの抽出に続いて、複雑な混合物から単離および精製される。続いて、単離された分子を機能アッセイにおいて試験し、それらの生物学的活性を検証する。ここでは、複雑な混合物から直接生物学的に活性な化合物を同定するための細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)カラムの使用を紹介します。CMACカラムは、天然のリン脂質二重層環境に埋め込まれた固定化機能性膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化合物の同定を可能にします。これは標的を絞ったアプローチであり、新たに同定された小分子薬物候補で活性を調節しようとするTMPを知る必要がある。このプロトコルでは、多数の神経系疾患に対する創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を有するCMACカラムを調製するアプローチを提示する。この記事では、TrkB受容体を過剰発現する神経芽細胞腫細胞株を使用して、固定化されたTrkB受容体を有するCMACカラムを組み立てるための詳細なプロトコルを提供する。我々はさらに、カラムの機能性を調査するためのアプローチと、TrkB受容体と相互作用する特殊な植物代謝産物の同定におけるその使用を提示する。

概要

植物混合物は、薬理学的に活性な化合物1に富んでおり、新薬ヒットおよびリード2、3、4、5の同定のための良好な供給源として役立つ。天然物からの新薬の発見は実り多いアプローチであり、現在承認されている多くの薬は、自然界で最初に同定された化合物に由来しています。天然化合物の化学的多様性は、化学的に合成された分子の人工ライブラリに匹敵することは困難です。多くの天然化合物は、ヒトタンパク質標的と相互作用し、調節し、進化的に最適化された薬物様分子と考えることができる6。これらの天然化合物は、神経学的障害6において使用する薬物鉛同定に特に適している。アルツハイマー病(AD)の管理のために現在FDAが承認している2つの薬は、天然アルカロイド、すなわちガランタミンとリバスチグミン(フィゾスチグミンの誘導体)に由来しています6。L-DOPA, 現在、パーキンソン病のための最も一般的に処方薬, 最初にソラマメから同定されました (Vicia faba L.)ペルゴリドおよびリスリド、ドーパミン作動性受容体アゴニストは、寄生菌クラビセプス・プルプレア由来の天然麦角アルカロイドの誘導体である8.レセルピンは、インドのヘビの根(Rauvolfia serpentina(L.ベンス、元クルツ)から単離されたアルカロイドであり、最初の抗精神病薬9の1つであった。近年、調節不全の免疫応答および全身性炎症は、大うつ病性障害または神経変性疾患などの多数の神経学的疾患の発症に関連している10。植物ベースの食事療法と他のライフスタイル介入は、高齢者の認知能力および機能的能力を改善することが見出されている11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21.トリテルペンおよびポリフェノールに属するある種の求電子性分子は、インビトロおよびインビボモデルの両方において炎症応答を調節することが見出されている12。例えば、α,β−不飽和カルボニル(例えば、クルクミン、シンナムアルデヒド)、またはイソチオシアネート基(例えば、スルフォラファン)を含む天然化合物は、マウスインターロイキン−3依存性プロB細胞株における炎症誘発性サイトカインの下流合成を阻害するToll様受容体−4(TLR4)二量体化を妨害する12、22.疫学的証拠は、複雑な食品マトリックス中に存在する食事性植物化学物質も、新薬リードの実行可能な供給源を構成する可能性があることを強く指摘している6。

植物ベースの食品を含む植物抽出物中に存在する生物学的に活性な分子の同定における主要な障害の1つは、調査されたサンプルの複雑さである。伝統的に、個々の化合物は単離され、精製され、続いて生物学的活性について試験される。このアプローチは、通常、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物の同定につながる。定義された分子標的を伴わない表現型創薬アプローチは、複雑な混合物のバイオガイド分画に依存する23。このアプローチでは、抽出物は、より複雑でないサブフラクションに分画され、その後、表現型アッセイで試験される。活性化合物の単離および精製は、アッセイにおいて検証された生物学的活性によって導かれる。特定の薬物標的の同一性の知識は、複雑な混合物中に存在する薬理学的に活性な化合物の同定を有意にスピードアップし得る。これらのアプローチは、通常、分子標的、例えば酵素の固定化に基づいており、固体表面上の、磁気ビーズ23などが挙げられる。固定化された標的は、その後、スクリーニング実験において使用され、標的と相互作用する化合物の単離をもたらす。このアプローチは、細胞質ゾルタンパク質を標的とする化合物の同定に広く使用されてきたが、膜貫通タンパク質(TMP)と相互作用する化学物質の同定にはあまり一般的に適用されていない23。TMPsの固定化におけるさらなる課題は、タンパク質の活性が、細胞膜リン脂質およびコレステロール23,24などの二重層中の他の分子との相互作用に依存するという事実に由来する。膜貫通標的を固定化しようとする場合、タンパク質と天然のリン脂質二重層環境との間のこれらの微妙な相互作用を保存することが重要です。

細胞膜アフィニティークロマトグラフィー(CMAC)では、精製されていないタンパク質と細胞膜断片が、人工膜(IAM)固定相粒子23に固定化される。IAM固定相は、ホスファチジルコリン類似体をシリカ上に共有結合することによって調製される。最近、遊離アミン基およびシラノール基が末端キャップされているIAM固定相の新規クラスが開発されている(IAM.パソコン。DD2粒子)。CMACカラム調製中、細胞膜断片は吸着によってIAM粒子の表面に固定化されます。

CMACカラムは、イオンチャネル(例えば、ニコチン性受容体)、GPCR(例えば、オピオイド受容体)、タンパク質トランスポーター(例えば、p-糖タンパク質)などを含む、異なるクラスのTMPを固定化するために今日まで使用されてきた24。固定化タンパク質標的は、標的と相互作用する小分子リガンドの薬力学(例えば、解離定数、Kd)の特性評価または結合動態(kon およびkoff)の決定、ならびに複合体マトリックス中に存在する潜在的な新薬リードの同定の過程において使用されてきた24.ここでは、多数の神経系疾患の創薬の実行可能な標的として浮上している固定化トロポミオシンキナーゼ受容体B(TrkB)を用いたCMACカラムの調製法を紹介します。

これまでの研究では、脳由来神経栄養因子(BDNF)/TrkB経路の活性化が、ADや大うつ病性障害などの特定の神経学的疾患の改善と関連していることが示されました25,26,27,28。ADのBDNFレベルおよびその受容体TrkB発現の減少、および同様の低下がAD29の動物モデルにおいて海馬機能を損なうことが報告された。BDNFのレベルの低下は、AD患者30、31、32の血清および脳において報告された。タウ過剰発現または過剰リン酸化は、初代ニューロンおよびAD動物モデルにおけるBDNF発現をダウンレギュレートすることが見出された33、34、35。さらに、BDNFは、インビトロおよびインビボでβアミロイド誘導神経毒性に対して保護効果を有することが報告された36。ラット脳へのBDNFの直接投与は、認知障害のある動物における学習および記憶を増加させることが示された37。BDNF/TrkBは、AD28,38を含む神経学的および精神医学的障害を改善するための有効な標的として浮上した。ADにおける治療法の開発のためにBDNF/TrkBシグナル伝達経路を標的にすることは、この疾患の理解を潜在的に強化するであろう39。残念なことに、BDNF自体は、その貧弱な薬物動態学的特性および有害な副作用のために治療として使用することができない40。TrkB/BDNF経路の小分子活性化剤が、潜在的なTrkBリガンドとして探索されている41、42、43。試験された低分子アゴニストのうち、7,8-ジヒドロキシフラボン(7,8-DHF)はBDNF/TrkB経路41,44,45,46を活性化することが示されている。7,8-DHFの誘導体(R13;4-オキソ-2-フェニル-4H-クロメン-7,8-ジイルビス(メチルカルバメート))は、AD47の可能性のある薬物として現在検討されている。最近、いくつかの抗うつ薬がTrkBに直接結合し、BDNFシグナル伝達を促進することによって作用することが示され、様々な神経学的障害を治療するための有効な標的としてTrkBを追求することの重要性をさらに強調する48。

このプロトコルは、機能的なTrkBカラムおよびTrkB-NULLネガティブコントロールカラムをアセンブルするプロセスを記述している。カラムは、既知の天然物小分子リガンドである7,8-DHFを使用して特徴付けられます。さらに、TrkBと相互作用する化合物の同定のために、植物抽出物を例に挙げて複雑なマトリックスをスクリーニングするプロセスについて説明する。

プロトコル

SH-SY5Y神経芽細胞腫細胞(TrkBおよびTrkB-NULL(親)細胞株)の細胞培養

注:細胞株(SH-SY5Y細胞株(TrkB、BR6)およびSH-SY5Y親細胞株(TrkB NULL))49,50をケラファストから購入した。培養細胞は、CMACカラムの調製のために固定化される膜貫通受容体の供給源として使用される。以下のステップでは、細胞膜フラグメントを取得し、機能的な CMAC カラムを組み立てる方法について説明します。

  1. 450 mLのRPMI培地、50 mLのFBS、5 mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液、および0.3 mg/mLのジェネチシン(G418)を混合した細胞培養培地中で、5%CO2の湿潤雰囲気下で37°Cの150 mm細胞培養皿中で細胞を増殖させる。

2. 細胞採取

  1. 顕微鏡を用いて細胞コンフルエンシー(80%〜90%)を確認し、細胞継代後3〜4日後に到達した。
  2. 細胞の上方から細胞培養培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x、pH7.4)で細胞を2回洗浄する。PBSを除去し、2mLの低濃縮トリプシン(0.25%)を加えて細胞を剥離する。
  3. プレートを静かに旋回させて、トリプシン溶液ですべての細胞を均等に覆い、5%CO2を含む湿潤雰囲気下で37°Cで約2分間細胞をインキュベートする。剥離細胞に8 mLの細胞培養培地を加え、剥離した細胞を50 mL円錐管に移し、氷上に置く。
  4. 血球計数器を使用して、細胞数(約3 x107 細胞)を推定します。混合細胞懸濁液を上下にピペッティングすることによって、混合物中の均一な細胞密度を得る。10μLの細胞懸濁液をカバースリップの下に置き、40倍の対物レンズを用いて顕微鏡下で細胞を計数した。

3. 細胞均質化

  1. ベンズアミジン(200mM)、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF、10mM)、および4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)、アプロチニン、ベスタチン、およびロイペプチンを含む市販のプロテアーゼ阻害剤カクテル(100倍濃度)のプロテアーゼ阻害剤のストック溶液を調製する。
    警告: PMSF はヒュームフード内でのみ取り扱ってください。
    1. ベンズアミジン原液(200mM)を5mLの超高純度脱イオン水に溶解してベンズアミジン原液(200mM)を調製する。4°Cで保存し、1日以内に使用してください。各使用前に溶液を新たに調製する(推奨)。
    2. 0.017 gのPMSFを10 mLのエタノールに溶解してPMSFストック溶液(10 mM)を調製する。-20°Cで保管してください。
    3. 市販のプロテアーゼ阻害剤混合液を1mLの超純イオン交換水に溶解してプロテアーゼ阻害剤カクテル(100x)を調製する。十分に混合し、200〜300μLのカクテルをアリコートし、使用前に-20°Cで保存する。
  2. ATP二ナトリウム塩水和物55.114 mgを脱イオン超純水1 mLに溶解してATP原液(100 mM)を調製する。十分に混合し、混合物のアリコート100 μLと使用前に-20°Cで保存する。
  3. 3.03gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl、50mM)、2.9gの塩化ナトリウム(NaCl、100mM)、0.22gの塩化カルシウム無水物(CaCl2、3mM)、0.2gの塩化マグネシウム六水和物(MgCl2、2mM)および0.19の塩化カリウム(KCl、5mM)を500mLの超高純度脱イオン水に溶解して緩衝液を調製する。
  4. ステップ3.3で調製した緩衝液17.3 mLを0.3 mL(3 mM)のベンズアミジン原液、0.2 mL(0.1 mM)のPMSF原液、0.2 mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル混合物、20 μL(100 μM)のATP原液、2 mL(10%)のグリセロール、および0.029 g(5mM)のEDTAと混合してホモジナイズバッファーを調製する(表1)。塩酸溶液を用いてpHを7.4に調整する。
  5. ステップ2.3で回収した細胞を4°Cで400 x gで5分間スピンダウンします。上清を除去し、残りの細胞ペレットを10mLの氷冷PBS(1x、pH7.4)で洗浄する。細胞を再び4°Cで400 x gで5分間スピンダウン します。
  6. 上清を廃棄し、ステップ3.4で調製した20mLのホモジナイズバッファーと交換する。円錐形のチューブを氷の上に置きます。
  7. 細胞懸濁液を40mLのDounceホモジナイザー組織グラインダーに移し、氷の上に置きます。懸濁液を手動で氷上で均質化し、40回の上下の乳棒ストロークを使用します。均質化した細胞懸濁液を50mL円錐管に移す。
  8. ホモジネートを4°Cで400 x gで7分間遠心分離 する。ペレットを廃棄し、上清を新しい円錐管に移し、4°Cで47900 x gで30分間遠心分離する。細胞膜ペレットを保存し、上清を捨てる。

4. 細胞膜可溶化

  1. ステップ3.3で作製した緩衝液8.7 mLをPMSF原液0.1 mL(0.1 mM)、ベンズアミジン原液0.15 mL(3 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル0.1 mL、ATP原液10 μL(100 μM)、グリセロール1 mL(10%)、コール酸ナトリウム0.2 g(2%)と混合して可溶化緩衝液を調製する(表2)。
  2. ステップ3.8で得られた細胞膜断片を含む可溶化緩衝液を円錐形チューブに移し、ペレットを再懸濁する。得られた混合物を4°Cで150rpmで18時間回転させる。
    注:この時点で、実験は一晩細胞膜ペレット可溶化のために一時停止することができる。

5. IAMへの細胞膜固定化。パソコン。DD2パーティクル

  1. 18時間後、可溶化混合物を4°Cで47900 x gで30分間遠心分離 する。
  2. 上清を保管し、ペレットを捨てる。100mgのIAMを加える。パソコン。DD2粒子は、上清に対して、渦巻き、得られた懸濁液混合物を4°Cで150rpmで1時間回転させる。
  3. IAM上の細胞膜断片の固定化を容易にする。パソコン。DD2粒子は、以下に概説するように透析ステップに進む。
    1. 24gのトリス塩酸(50mM)、23.4gのNaCl(100mM)、0.06gのCaCl2(0.1mM)、5.85gのEDTA( 5mM)、および0.07gのPMSF(0.1mM; 表3)。
      注:PMSFは水に溶けないため、まず少量のエタノールに溶解し、次に緩衝液でビーカーにゆっくりと加えます。
    2. 塩酸溶液でpHを7.4に調整します。透析ステップに進む前に、緩衝液を4°Cで最低1時間置く。
    3. 10cmのセルロース膜透析チューブ(10K MWCO、35mm)を切断して透析チューブを作製し、IAMを含む懸濁液を移す。パソコン。DD2粒子および細胞膜断片を透析チューブに入れる。透析チューブクリップを使用して、透析チューブの両端を閉じます。
    4. IAMを入れた透析チューブを置く。パソコン。DD2固定相を透析バッファーに入れ、穏やかに攪拌しながら4°Cで24時間透析する。
    5. 24時間後、新しく調製した透析バッファーに透析チューブを入れ、さらに24時間透析を続けます。

6. CMACカラムパッキング

  1. IAMを洗浄するために使用する酢酸アンモニウム緩衝液(10 mM、pH 7.4)を調製する。パソコン。DD2粒子およびカラム内特性評価実験は、0.7708gの酢酸アンモニウムを1Lの超高純度脱イオン水に溶解して行う。塩酸溶液でpHを7.4に調整します。
  2. 透析の48時間後、透析バッファーから透析チューブを取り出し、透析チューブの内容物を15mL円錐管に移す。
  3. 混合物を4°Cで400 x gで5分間遠心分離 する。上清を捨て、残りのペレットを10mLの酢酸アンモニウム緩衝液で3回洗浄し、混合物を400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、各洗浄を行った。
  4. 3回目の洗浄後、残りのペレットを1mLの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。それを十分に混合し、得られたスラリーを使用して5/20ガラスカラムを充填し、CMACクロマトグラフィーカラムを得た。
  5. カラムを充填するには、まず、酢酸アンモニウム緩衝液で予め浸した底部フィルターをフィルターホルダーに入れます。フィルターホルダーをガラスカラムに嵌め込み、カラムキャップをねじ込んでホルダーの位置を固定します。カラムをフィンガークランプに垂直に置き、ラボスタンドに固定します。ビーカーを柱の下に置きます。
  6. 単流路ピペッターを使用して、ステップ6.4で得られた少量のスラリーをガラスカラムに移送する。ピペットチップをガラス柱壁に当てて、材料をゆっくりと注ぎます。別の量のスラリーを注ぐ前に、梱包材が沈降するのを許してください。
  7. パッキングプロセスをスピードアップするために、各ステップの間にマイクロピペットを使用して固定床の上から緩衝液を除去する。1mLのスラリーが充填されるまで、これらの手順を繰り返します。
  8. 図 1 に示すように、上部フィルターを配置し、固定相の上にバッファーが残らないようにアダプター・ユニットをねじ込みます。アダプター・ロックでアダプター装置の位置を固定します。
  9. カラムを高速液体クロマトグラフィー (HPLC) ポンプに接続し、流速を 0.2 mL/minに設定し、酢酸アンモニウムバッファーでカラムを一晩洗浄します。これで、列は特性評価ステップの準備が整いました。使用時までカラムを4°Cで保存する。
    注: 長期間保存する場合 (カラムは 1 週間以上使用しない場合)、酢酸アンモニウムバッファー中の 0.05% アジ化ナトリウム溶液でカラムをランディングし、4 °C で保存します。
    注意: アジ化ナトリウムは、経口摂取または皮膚を通して吸収されると非常に有毒です;それはヒュームフードの下でのみ取り扱われるべきです。アジ化ナトリウムを使用するときは、ラボコート、安全メガネ、手袋(ニトリルが好ましい)を着用してください。

7. CMACカラムの特性評価

  1. 共焦点顕微鏡とBDNF結合
    1. IAM を準備します。PCC.DD2固定相粒子を固定化した細胞膜断片を用いて、工程1~工程6.4の指示に従ってTrkBおよびSH-SY5Yを過剰発現する神経芽細胞腫細胞およびSH-SY5Y神経芽細胞とは別に得た。
    2. 抗体染色の前にBDNFと共にインキュベートされるサンプルについては、10μgのBDNFを100μLの超純粋な脱イオン水に溶解してBDNFストック溶液を調製する。溶液を-20°Cで保存する。
      1. 別の1.5 mL微量遠心チューブ、IAMの100 μLアリコートに移す。パソコン。DD2カラム充填材は、TrkBおよびIAMの100μLアリコートを過剰発現する固定化SH−SY5Y神経芽細胞腫細胞を有する。パソコン。DD2カラム充填剤を固定化したSH-SY5Y TrkB-NULL細胞を酢酸アンモニウム緩衝液に懸濁した。
      2. 390 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、10 μLのBDNFストック溶液、および0.5 μLのATPストック溶液(ステップ3.2で調製)を各チューブに追加し、ロッキングしながら室温で1時間インキュベートする。
    3. 抗体染色前にBDNFとインキュベートされないサンプルについては、IAMの100μLアリコートを移す。パソコン。DD2カラム充填剤を固定化したSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を酢酸アンモニウムに懸濁して1.5mL微量遠心チューブに懸濁したTrkBを過剰発現させた。
    4. 400 μLの酢酸アンモニウム緩衝液および0.5 μLのATPストック溶液(ステップ3.2で調製)を各チューブに加え、ロッキングしながら室温で1時間インキュベートする。
    5. ステップ7.1.2および7.1.4で調製したサンプルを4°Cで10,000 x g で1分間スピンし、上清を捨てた。
    6. 得られたペレットを500 μLの酢酸アンモニウム緩衝液で10分間洗浄し、4°Cで10,000 x g で1分間再びスピンさせ、上清を捨てる。
    7. 各ペレットに、220 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、25 μLの10%ヤギ血清、および5 μLの一次抗BDNF抗体を加える。低温室(4°C)で一晩ロッキングしながらインキュベートする。
    8. インキュベーション工程の完了時に、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を捨てた。
    9. 得られたペレットを1%中性洗剤(例えば、コール酸ナトリウム)を含む酢酸アンモニウム緩衝液で10分間3回洗浄し、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を廃棄する。
    10. 900 μLの酢酸アンモニウム緩衝液、100 μLの10%ノルマルヤギ血清、および1 μLのフルオロフォア結合二次抗体(1:1,000希釈)を混合して二次抗体溶液を調製する。ステップ7.1.9で得られたペレットのそれぞれに300μLの二次抗体溶液を加える。揺動しながら4°Cで一晩インキュベートした。
    11. 混合物を10,000 x g で4°Cで1分間スピンさせ、上清を捨てる。
    12. 得られたペレットを1%の中性洗剤(例えば、コール酸ナトリウム)を含む酢酸アンモニウム緩衝液で10分間3回洗浄し、混合物を4°Cで10,000 x g で1分間スピンさせ、上清を捨てる。
    13. 得られたペレットを50μLの酢酸アンモニウム緩衝液に再懸濁する。各混合物を20μLをスライドの上に置き、カバースリップで覆う。
    14. IAM をイメージします。パソコン。固体レーザーシステムを用いて生成された488nmでの励起および520nmでの発光を有する共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて固定化された細胞膜断片を有するDD2粒子。NA が 0.75 で WD が 0.35 mm の 20 倍の対物レンズを使用します。
  2. マーカーリガンドとして7,8-DHFを用いた正面アフィニティークロマトグラフィー
    1. CMACカラムをダイオードアレイ検出器および/または質量分析計を備えたHPLCシステムに接続します。
    2. 5%メタノールを含む酢酸アンモニウム緩衝液中の7,8-DHFの1 mM溶液500 mLを調製する。
    3. マーカーリガンド(1 mM)の一定濃度をCMACカラムに室温で0.4 mL/minの流速でポンプで送ります。ダイオードアレイ検出(DAD)(波長254nm)検出器または質量分析計(シングルイオンモニタリングモードを使用、マイナスイオン化モードでm/z 253を使用)を使用して溶出プロファイルを監視します。
    4. ラン終了後、カラムを通して酢酸アンモニウム緩衝液を流して一晩洗浄を行う。
    5. 手順 7.2.2 を繰り返します。- 7.2.4.異なる濃度のマーカーリガンド(750nM、500nM、300nM)を用いて、各ラン後にカラムを一晩洗浄した。正面アフィニティークロマトグラフィーを使用して、詳細にレビューされたリガンドKdを他の場所で計算します。24,51の
  3. ツボクサ・アジアティカ(L.)ウルブによる変位研究(ゴツコラ)エキス
    1. 5%メタノールおよび0.2%水性ゴツコラ抽出物(10mg/mL)を含む酢酸アンモニウム緩衝液中に7,8-DHFの500nM溶液500mLを調製する。
    2. マーカーリガンド(500 nM)の一定濃度をポンプで抽出し、室温で0.4 mL/minの流速でカラムを通す。DAD検出器(波長254nm)または質量分析計(シングルイオンモニタリングモードを使用、マイナスイオン化モードでm/z 253を使用)のいずれかを使用して溶出プロファイルを監視します。
    3. ラン終了後、カラムを通して酢酸アンモニウム緩衝液を流して一晩洗浄を行う。
    4. 500nM 7,8-DHFの溶出プロファイルと、ゴツコラ抽出物で溶液を実行した後に得られたものをプロットし、マーカーリガンド変位を検査する。

8. ゴツコラ抽出物から潜在的なTrkB結合剤を同定するためのピーククロマトグラフィーアプローチの欠落

  1. CMACカラムでのゴツコラ抽出物の分画
    1. CMAC TrkB カラムと TrkB-NULL カラムを別々に HPLC システムに接続し、各カラムに 50 μL の水性ゴツコラ抽出物 (10 mg/mL) を注入します。5% メタノールを含む酢酸アンモニウム緩衝液 (10 mM, pH 7.4) を室温で 0.4 mL/分の流速でカラムにポンプで通します。
    2. CMAC TrkB および TrkB-NULL カラムとは別に、0 ~ 5 分、5 ~ 10 分、10 ~ 15 分、15 ~ 20 分、20 ~ 25 分、25 ~ 30 分、30 ~ 35 分、35 ~ 40 分、40 ~ 45 分、45 ~ 50 分、50 ~ 55 分、55 ~ 60 分。
    3. 得られた画分を凍結し凍結乾燥する。凍結乾燥画分を50 μLのメタノールに再懸濁してから、超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析分析に進みます。
  2. 超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間質量分析(UPLC-QTOF-MS)分析
    1. ポイント8.1.3で得られたすべての分画を分析します。UPLCシステムと結合された質量分析計を使用する(UPLC-MSE 分析モード)。C18 カラム (2.1 x 50 mm, 1.7 μm) と C18 VanGuard プレカラム (2.1 mm x 5 mm, 1.7 μm) を使用してフラクションを分析します。
    2. 移動相A(0.1%ギ酸を含む水)およびB(0.1%ギ酸を含むアセトニトリル)を用いて、以下のグラジエント溶液を用いて0.3mL/minの流速でカラムを溶出する:0.0分99%A 1%B、1.5分84%A 16%B、5.0分80%A 20%B、7.0分75%A 25%B、 10.0分 65% A 35% B, 20.0-24.0 分 1% A 99% B, 25.0-29.0 分 99% A 1% B.
    3. 各サンプルの注入量を 3 μL に設定します。MSE を分解能の正イオンモードと負イオンモードで実行し、衝突エネルギーは低エネルギーの場合は 4V、高エネルギーの場合は 20 ~ 35 V にします。
    4. 陽イオン化モードでは、キャピラリー電圧1.5kV、サンプリングコーン40V、ソースオフセット80、ソース温度100°C、脱溶媒温度350°C、コーンガス流量38.0L/h、脱溶媒和ガス400L/hのESIソース条件を使用します。
    5. 負イオン化モードでは、キャピラリー電圧1.45kV、サンプリングコーン40V、ソースオフセット80、ソース温度110°C、脱溶媒温度300°C、コーンガス流量50.0L/h、脱溶媒和ガス流量652L/hのESIソース条件を使用します。

結果

プロトコールに従って、2つのCMACクロマトグラフィーカラムを組み立てました:1つは過剰発現TrkBを有する固定化SH-SY5Y神経芽腫細胞膜断片、もう1つはSH-SY5Y TrkB-NULL細胞膜断片を有する。正しく組み立てられたCMACカラムを図 1 に、細胞膜断片の固定化に関与するステップを 図2に示します。

IAM上のTrkB受容体の固定化以来。パソコ?...

ディスカッション

特殊な代謝産物の複雑な混合物中に存在する活性化合物の同定は、非常に困難な作業である23。伝統的に、個々の化合物は単離され、その活性は異なるアッセイで試験される。このアプローチは、時間と費用がかかり、しばしば、最も豊富で十分に特徴付けられた化合物23の単離および同定をもたらす。現在使用されているハイスループットスクリーニング...

開示事項

Lukasz CieslaはIAMのプロバイダーであるRegis Technologiesと協力しています。パソコン。DD2 パーティクル。

謝辞

Z.C.A.は、トルコ科学技術研究評議会(TUBITAK)2219-国際ポスドク研究フェローシッププログラムの支援を受けました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立補完統合医療センターによって、賞番号1R41AT011716-01の下で支援されました。この研究は、米国生薬学会のスターターグラント、L.C.へのレジステクノロジーズ助成金によって部分的に支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Dihydroxyflavone hydrateSigma-AldrichD5446-10 mg≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-AldrichA2383-1 g
Ammonium acetateVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
BDNF antibodyInvitrogenPA5-15198-400 μLPrimary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μgRecombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chlorideVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Cholic acid sodium saltAlfa AesarJ62050-100 g
Dounce homogenizerVWR71000-51640 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EthanolSigma-Aldrich493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442-500 mLsterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solutionSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrateVWR AnalyticalBDH9244-500 mL
MethanolSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbNikonConfocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)Life Technologies50197Z
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Potassium chlorideVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Protease inhibitor cocktailVWR Life Science AmbresoM221-1 mLProteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLwith L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell lineKerafastECP005
Snake skin dialysis tubingThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium chlorideBDH VWR AnalyticalBDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 columnGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4049-500 mL0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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