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Resumo

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Resumo

Produtos químicos sintetizados por plantas, fungos, bactérias e invertebrados marinhos têm sido uma rica fonte de novos hits e leads de drogas. Medicamentos como estatinas, penicilina, paclitaxel, rapamicina ou artemisina, comumente utilizados na prática médica, foram primeiramente identificados e isolados de produtos naturais. No entanto, a identificação e isolamento de metabólitos especializados biologicamente ativos de fontes naturais é um processo desafiador e demorado. Tradicionalmente, os metabólitos individuais são isolados e purificados a partir de misturas complexas, após a extração da biomassa. Posteriormente, as moléculas isoladas são testadas em ensaios funcionais para verificar sua atividade biológica. Aqui apresentamos o uso de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) para identificar compostos biologicamente ativos diretamente de misturas complexas. As colunas CMAC permitem a identificação de compostos interagindo com proteínas transmembrana funcionais imobilizadas (TMPs) incorporadas em seu ambiente bicamador nativo fosfolipídico. Trata-se de uma abordagem direcionada, que requer conhecer o TMP cuja atividade se pretende modular com o recém-identificado candidato a pequenas moléculas. Neste protocolo, apresentamos uma abordagem para preparar colunas CMAC com tropomyosina quinase imobilizada receptor B (TrkB), que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para montar a coluna CMAC com receptores TrkB imobilizados usando linhas celulares neuroblastoma superexpressando receptores TrkB. Apresentamos ainda a abordagem para investigar a funcionalidade da coluna e seu uso na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com receptores TrkB.

Introdução

As misturas botânicas são ricas em compostos farmacologicamente ativos1, servindo como uma boa fonte para a identificação de novos hits de drogas e leva 2,3,4,5. A descoberta de novos medicamentos a partir de produtos naturais tem sido uma abordagem frutífera e muitos medicamentos atualmente aprovados originaram-se de compostos identificados pela primeira vez na natureza. A diversidade química de compostos naturais é difícil de ser comparada por bibliotecas feitas pelo homem de moléculas quimicamente sintetizadas. Muitos compostos naturais interagem e modulam alvos de proteína humana e podem ser considerados moléculas evolutivamente otimizadas como drogas6. Estes compostos naturais são particularmente adequados para a identificação de chumbo de drogas para uso em distúrbios neurológicos6. Dois dos medicamentos atualmente aprovados pela FDA para o manejo da doença de Alzheimer (DA) são derivados de alcaloides naturais, a ver: galantamina e rivastigmina (um derivado da fisstigmina)6. L-DOPA, atualmente o medicamento mais comumente prescrito para doença de Parkinson, foi identificado pela primeira vez a partir do feijão largo (Vicia faba L.) 7. Pergolida e lisúride, agonistas receptores dopaminérgicos são os derivados de alcaloides naturais do fungo parasita Claviceps purpurea8. Reserpine, um alcaloide isolado da raiz de cobra indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) foi uma das primeiras drogas antipsicóticas9. Recentemente, a resposta imune disregulada e a inflamação sistêmica têm sido ligadas ao desenvolvimento de inúmeras doenças neurológicas, como transtorno depressivo grave ou doenças neurodegenerativas10. Uma dieta à base de plantas, juntamente com outras intervenções de estilo de vida, tem sido encontrada para melhorar as habilidades cognitivas e funcionais em idosos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Algumas moléculas eletrofílicas pertencentes a triterpenos e polifenóis foram encontradas para modular respostas inflamatórias nos modelos in vitro e in vivo 12. Por exemplo, compostos naturais contendo carbonilo α.β insaturados (por exemplo, curcumina, cinnamaldeído), ou grupo isothiocyanato (por exemplo, sulforaphane) interfere com a dimerização do receptor-4 (TLR4) que inibe a síntese a jusante de citocinas pró-inflamatórias em uma linha de células pró-B dependentesde maça . Evidências epidemiológicas apontam fortemente que fitoquímicos dietéticos, presentes em matrizes alimentares complexas, também podem constituir uma fonte viável de novas drogas leva6.

Um dos principais obstáculos na identificação de moléculas biologicamente ativas presentes nos extratos vegetais, incluindo alimentos à base de plantas, é a complexidade das amostras investigadas. Tradicionalmente, os compostos individuais são isolados, purificados e posteriormente testados para atividade biológica. Essa abordagem geralmente leva à identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados. A descoberta de drogas fenotípicas se aproxima sem um alvo molecular definido, depende do fracionamento bioguisticuto de misturas complexas23. Nesta abordagem, um extrato é fracionado em sub frações menos complexas que são posteriormente testadas em ensaios fenotípicos. O isolamento e purificação dos compostos ativos são orientados pela atividade biológica verificada no ensaio. O conhecimento da identidade de um alvo de drogas especificado pode acelerar significativamente a identificação de compostos farmacologicamente ativos presentes em misturas complexas. Essas abordagens são geralmente baseadas na imobilização do alvo molecular, por exemplo, uma enzima, em uma superfície sólida, como as contas magnéticas23. Os alvos imobilizados são posteriormente usados nos experimentos de triagem, resultando no isolamento de compostos interagindo com o alvo. Embora essa abordagem tenha sido amplamente utilizada na identificação de compostos voltados para proteínas citosóicas, tem sido menos comumente aplicada na identificação de produtos químicos interagindo com proteínas transmembranas (TMPs)23. Um desafio adicional na imobilização dos TMPs decorre do fato de que a atividade da proteína depende de sua interação com fosfolipídios de membrana celular e outras moléculas na bicamada, como o colesterol 23,24. É importante preservar essas interações sutis entre proteínas e seu ambiente bicamfato fosfolipídico nativo ao tentar imobilizar o alvo transmembrano.

Na membrana celular a cromatografia de afinidade de membrana (CMAC) fragmentos de membrana celular, e não proteínas purificadas, são imobilizados nas partículas de fase estacionárias da membrana artificial (IAM)23. As fases estacionárias do IAM são preparadas por análogos de fosfatialina em sílica. Recentemente, novas classes de fases estacionárias do IAM foram desenvolvidas nas quais grupos gratuitos de amina e silanol são end-capped (IAM. Computador pessoal. Partículas DD2). Durante as colunas CMAC, fragmentos de membrana celular de preparação são imobilizados na superfície das partículas IAM através de adsorção.

As colunas CMAC têm sido usadas até o momento para imobilizar diferentes classes de TMPs, incluindo canais de íons (por exemplo, receptores nicotínicos), GPCRs (por exemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por exemplo, p-glicoproteína), etc.24. Os alvos de proteína imobilizada têm sido utilizados na caracterização da farmacodinâmica (por exemplo, constante de dissociação, Kd) ou determinando cinética de ligação (kon e koff) de ligantes de moléculas pequenas interagindo com o alvo, bem como no processo de identificação de potenciais novos cabos de droga presentes em matrizes complexas24 . Aqui apresentamos a preparação das colunas CMAC com o receptor de tropomyosina quinase B (TrkB) imobilizado, que emergiu como um alvo viável para a descoberta de drogas para numerosos distúrbios do sistema nervoso.

Estudos anteriores mostraram que a ativação do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)/TrkB está associada à melhora de certas doenças neurológicas, como DA ou transtorno depressivo grave 25,26,27,28. Foi relatado que os níveis de BDNF e sua expressão receptor TrkB diminuem em AD, e reduções semelhantes prejudicam a função hipocampal em modelos animais de AD29. A diminuição dos níveis de BDNF foi relatada em soro e cérebro de pacientes com DA 30,31,32. A superexpressão de Tau ou hiperfosforilação foram encontradas para diminuir a expressão BDNF em neurônios primários e modelos animais AD 33,34,35. Além disso, foi relatado que o BDNF tem efeitos protetores na neurotoxicidade induzida por β amiloide in vitro e in vivo36. A administração direta de BDNF no cérebro de rato mostrou-se aumentar o aprendizado e a memória em animais com deficiência cognitiva37. BDNF/TrkB emergiu como um alvo válido para amenização de distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo28,38 d.C. Direcionar o caminho de sinalização BDNF/TrkB para o desenvolvimento de terapias em DDa potencialmente melhorará nossa compreensão da doença39. Infelizmente, o BDNF em si não pode ser usado como tratamento devido às suas más propriedades farmacocinéticas e aos efeitos colaterais adversos40. Pequenos ativadores de moléculas de vias TrkB/BDNF foram explorados como potenciais ligantes TrkB 41,42,43. Entre os agonistas de pequenas moléculas testados, 7,8-dihidroxyflavone (7,8-DHF), foi mostrado para ativar a via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Um derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromne-7,8-diyl bis (metilcarbamate)) está atualmente em consideração como uma possível droga para AD47. Recentemente, foi demonstrado que vários antidepressivos trabalham diretamente ligados ao TrkB e promovendo a sinalização BDNF, enfatizando ainda mais a importância de perseguir o TrkB como um alvo válido para tratar vários distúrbios neurológicos48.

O protocolo descreve o processo de montagem da coluna TrkB funcional e da coluna de controle negativo TrkB-NULL. As colunas são caracterizadas por um produto natural conhecido ligante molecular: 7,8-DHF. Além disso, descrevemos o processo de triagem de matrizes complexas, utilizando como exemplo o extrato vegetal, para a identificação de compostos interagindo com trkB.

Protocolo

1. Cultura celular das células neuroblastoma SH-SY5Y (linhas celulares TrkB e TrkB-NULL (parental) )

NOTA: As linhas de celular (linha celular SH-SY5Y (TrkB, BR6) e a linha de células parentais SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 foram compradas da Kerafast. As células cultivadas são usadas como fonte dos receptores transmembranos para serem imobilizadas para a preparação de colunas CMAC. As etapas a seguir descrevem como obter fragmentos de membrana celular e montar colunas CMAC funcionais.

  1. Cultivar as células em um meio de cultura celular preparado misturando 450 mL de mídia RPMI, 50 mL de FBS, 5 mL de solução de penicilina/estreptomicina, e 0,3 mg/mL de geneticina (G418) em um prato de cultura celular de 150 mm a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2.

2. Colheita celular

  1. Confirmar a confluência celular (80%-90%) usando um microscópio, alcançado após 3-4 dias após a passagem celular.
  2. Aspirar o meio de cultura celular acima das células e lavar as células duas vezes com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS, 1x, pH 7.4). Remova o PBS e adicione 2 mL de trippsina concentrada baixa (0,25%) para desacoplar células.
  3. Gire suavemente a placa para cobrir uniformemente todas as células com solução de trippsina e incubar as células por aproximadamente 2 min a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2. Adicione 8 mL de cultura celular média para descolar células e transfira células separadas para um tubo cônico de 50 mL e coloque-o no gelo.
  4. Use um hemótmetro para estimar o número de células (aproximadamente 3 x 107 células). Misture a suspensão celular por tubulação para cima e para baixo para obter densidade celular uniforme na mistura. Coloque 10 μL de suspensão celular sob o deslizamento de tampa e conte as células sob um microscópio usando um objetivo de 40x.

3. Homogeneização celular

  1. Preparar soluções de estoque dos seguintes inibidores de protease: benzamidina (200 mM), flúor de fenilmetilasulfonil (PMSF, 10 mM), e coquetel de inibidores de protease comercialmente disponíveis (concentração de 100x) contendo 4-(2-Aminoetila)benzenosulfonyl cloridrato de flúor (AEBSF), aprotinina, bestatina e leupeptina.
    ATENÇÃO: O PMSF só deve ser manuseado dentro do capô da fumaça.
    1. Prepare a solução de estoque de benzamidina (200 mM) dissolvendo 120 mg de benzamidina em 5 mL de água desionizada ultrapura. Armazene a 4 °C e use dentro de um dia. Prepare-se recentemente antes de cada uso (recomendado).
    2. Prepare a solução de estoque PMSF (10 mM) dissolvendo 0,017 g de PMSF em 10 mL de etanol. Loja a - 20 °C.
    3. Prepare o coquetel inibidor de protease (100x) dissolvendo a mistura inibidora de protease comercialmente disponível em 1 mL de água desionizada ultrapura. Misture bem e aliquot 200-300 μL do coquetel e armazene a - 20 °C antes de usar.
  2. Prepare a solução de estoque ATP (100 mM) dissolvendo 55.114 mg de hidratação de sal de disódio ATP em 1 mL de água ultrapura desionizada. Misture bem e aliquot 100 μL da mistura e armazene a - 20 °C antes de usar.
  3. Prepare o tampão dissolvendo 3,03 g de tris (hidroximetila)hidrocloreto de aminometano (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g de cloreto de sódio (NaCl, 100 mM), 0,22 g de cloreto de cálcio anidro (CaCl2, 3 mM), 0,2 g de hexahidrato de cloreto de magnésio (MgCl2, 2 mM) e 0,19 de cloreto de potássio (KCl, 5 mM) em 500 mL de água ultrapurina desfiminizada.
  4. Prepare o tampão de homogeneização misturando 17,3 mL do tampão preparado na etapa 3.3 com 0,3 mL (3 mM) de solução de estoque de benzamidina, 0,2 mL (0,1 mM) de solução de estoque PMSF, 0,2 mL de mistura de coquetel inibidor de protease, 20 μL (100 μM) de solução de ações ATP, 2 mL (10%) de glicerol e 0,029 g (5mM) de EDTA (Tabela 1). Ajuste o pH para 7,4 usando solução de ácido clorídrico.
  5. Gire as células colhidas na etapa 2.3 a 4 °C por 5 min a 400 x g. Remova o supernatante e lave a pelota de célula restante com 10 mL de PBS gelado (1x, pH 7.4). Gire as células novamente a 4 °C por 5 min a 400 x g.
  6. Descarte o supernante e substitua-o por 20 mL de tampão de homogeneização preparado na etapa 3.4. Coloque o tubo cônico no gelo.
  7. Transfira a suspensão celular para um moedor de tecido homogeneizador Dounce de 40 mL e coloque-a no gelo. Homogeneize a suspensão manualmente, no gelo, utilizando 40 golpes de pilão para cima e para baixo. Transfira a suspensão celular homogeneizada em um tubo cônico de 50 mL.
  8. Centrifugar o homogeneizar a 4 °C por 7 min a 400 x g. Descarte a pelota e transfira o supernante para um novo tubo cônico e centrífuga a 4 °C por 30 min a 47900 x g. Salve a pelota da membrana celular e descarte o supernasce.

4. Solubilização da membrana celular

  1. Prepare o tampão de solubilização misturando 8,7 mL da solução tampão feita na etapa 3.3 com 0,1 mL (0,1 mM) de solução de estoque PMSF, 0,15 mL (3 mM) de solução de estoque de benzamidina, 0,1 mL de coquetel inibidor de protease, 10 μL (100 μM) de solução de estoque ATP, 1 mL (10%) de glicerol e 0,2 g (2%) de contodoto de sódio (Tabela 2).
  2. Transfira o tampão de solubilização para o tubo cônico com fragmentos de membrana celular obtidos na etapa 3.8 e resuspense a pelota. Gire a mistura resultante a 150 rpm a 4 °C por 18 h.
    NOTA: Neste ponto, o experimento pode ser pausado para solubilização de pelotas de membrana celular durante a noite.

5. Imobilização da membrana celular no IAM. Computador pessoal. Partículas DD2

  1. Após 18 h, centrifugar a mistura de solubilização a 4 °C por 30 min a 47900 x g.
  2. Mantenha o supernatante e descarte a pelota. Adicione 100 mg de IAM. Computador pessoal. Partículas DD2, para o supernascida, vórtice e gire a mistura de suspensão resultante a 150 rpm a 4 °C por 1h.
  3. Para facilitar a imobilização de fragmentos de membrana celular no IAM. Computador pessoal. As partículas DD2 seguem para a etapa de diálise como descrito abaixo.
    1. Prepare o tampão de diálise em 4 L de água desionizada ultrapure adicionando 24 g de tris-HCl (50 mM), 23,4 g de NaCl (100 mM), 0.06 g de CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g de EDTA (5 mM) e 0,07 g de PMSF (0,1 mM; Tabela 3).
      NOTA: O PMSF não é solúvel em água, portanto, dissolve-o primeiro em pequeno volume de etanol e, em seguida, adicione lentamente no béquer com o tampão.
    2. Ajuste o pH para 7,4 com solução de ácido clorídrico. Coloque o tampão a 4 °C por uma mínima de 1h antes de seguir para a etapa de diálise.
    3. Prepare o tubo de diálise cortando 10 cm de tubos de diálise de membrana de celulose (10 K MWCO, 35 mm) e transfira a suspensão contendo IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e fragmentos de membrana celular no tubo de diálise. Use clipes de tubo de diálise para fechar as duas extremidades do tubo de diálise.
    4. Coloque o tubo de diálise contendo o IAM. Computador pessoal. Fase estacionária DD2 no tampão de diálise e diálise a 4 °C por 24 h enquanto mexe suavemente.
    5. Depois das 24h, coloque a tubulação de diálise no tampão de diálise recém-preparada e continue a diálise por mais 24 horas.

6. Embalagem de coluna cmac

  1. Prepare o tampão de acetato de amônio (10 mM, pH 7.4) que será usado para lavar o IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 e experimentos de caracterização de colunas dissolvendo 0,7708 g de acetato de amônio em 1 L de água desionizada ultrapura. Ajuste o pH para 7,4 com solução de ácido clorídrico.
  2. Após 48 h de diálise, remova o tubo de diálise do tampão de diálise e transfira o conteúdo do tubo de diálise para um tubo cônico de 15 mL.
  3. Centrifugar a mistura a 4 °C por 5 min a 400 x g. Descarte o supernatante e lave a pelota restante três vezes com 10 mL de tampão de acetato de amônio, centrifugando a mistura a 4 °C por 5 min a 400 x g, após cada lavagem.
  4. Após a terceira lavagem, resuspenja a pelota restante em 1 mL de tampão de acetato de amônio. Misture bem e use o chorume resultante para embalar a coluna de vidro 5/20 para produzir coluna de cromatografia CMAC.
  5. Para embalar a coluna, primeiro coloque um filtro inferior previamente encharcado com tampão de acetato de amônio, no suporte do filtro. Coloque o suporte do filtro na coluna de vidro e enrosque a tampa da coluna para fixar a posição do suporte. Coloque a coluna verticalmente em um grampo de dedo e fixe-a no suporte do laboratório. Coloque um béquer abaixo da coluna.
  6. Utilizando um único pipettor de canal, transfira um pequeno volume do chorume obtido na etapa 6.4 para a coluna de vidro. Despeje o material lentamente, segurando a ponta da pipeta contra a parede da coluna de vidro. Deixe que o material de embalagem se acomode antes de derramar outro volume de chorume.
  7. Para acelerar o processo de embalagem, remova o buffer de cima da cama estacionária usando uma micropipette entre cada etapa. Repita estas etapas até que 1 mL do chorume esteja embalado.
  8. Coloque um filtro superior e enrosque a unidade adaptador para que não haja um buffer restante acima da fase estacionária, conforme apresentado na Figura 1. Fixar a posição da unidade adaptadora com a trava do adaptador.
  9. Conecte a coluna a uma bomba de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), defina a taxa de fluxo para 0,2 mL/min e lave a coluna durante a noite com tampão de acetato de amônio. A coluna está pronta para a etapa de caracterização. Armazene a coluna a 4 °C até o uso.
    NOTA: Para um armazenamento mais longo (coluna não utilizada há mais de uma semana) execute a coluna com solução de azida de sódio de 0,05% no tampão de acetato de amônio e armazene a 4 °C.
    ATENÇÃO: O azida de sódio é altamente tóxico quando ingerido oralmente ou absorvido pela pele; ele só deve ser manuseado sob o capô da fumaça. Certifique-se de usar um jaleco, óculos de segurança e luvas (nitrito preferido) ao trabalhar com azida de sódio.

7. Caracterização da coluna CMAC

  1. Microscopia confocal e vinculação BDNF
    1. Prepare IAM. Pcc. Partículas de fase estacionária DD2 com fragmentos de membrana celular imobilizada obtidos separadamente das células neuroblastoma SH-SY5Y sobreexpressando células TrkB e SH-SY5Y TrkB-NULL seguindo as instruções do passo 1 ao passo 6.4.
    2. Para amostras que serão incubadas com BDNF antes da coloração de anticorpos, prepare a solução de estoque BDNF dissolvendo 10 μg de BDNF em 100 μL de água desionizada ultrapure. Armazene a solução a -20 °C.
      1. Transfira em tubos de microcentrifus de 1,5 mL separados, 100 μL aliquot de IAM. Computador pessoal. Material de embalagem da coluna DD2 com células de neuroblastoma SH-SY5Y imobilizadas superexpressando TrkB e alíquota de 100 μL de IAM. Computador pessoal. Material de embalagem da coluna DD2 com células Imobilizadas SH-SY5Y TrkB-NULL suspensas em tampão de acetato de amônio.
      2. Adicione 390 μL de tampão de acetato de amônio, 10 μL de solução de estoque BDNF e 0,5 μL de solução de estoque ATP (preparada na etapa 3.2) em cada tubo e incubar por 1h em temperatura ambiente com balanço.
    3. Para amostras que não serão incubadas com BDNF antes da coloração de anticorpos, transfira 100 μL aliquot de IAM. Computador pessoal. Material de embalagem da coluna DD2 com células de neuroblastoma SH-SY5Y imobilizadas superexpressando TrkB suspenso em acetato de amônio em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
    4. Adicione 400 μL de tampão de acetato de amônio e 0,5 μL de solução de estoque ATP (preparada na etapa 3.2) em cada tubo e incubar por 1h à temperatura ambiente com balanço.
    5. Gire as amostras preparadas nas etapas 7.1.2 e 7.1.4 a 4 °C por 1 min a 10.000 x g e descarte o sobrenante.
    6. Lave as pelotas resultantes com 500 μL de tampão de acetato de amônio por 10 minutos e gire novamente a 4 °C por 1 min a 10.000 x g e descarte o supernatante.
    7. Para cada uma das pelotas, adicione 220 μL de tampão de acetato de amônio, 25 μL de soro de cabra 10% normal e 5 μL de anticorpo anti-BDNF primário. Incubar em uma sala fria (4 °C) durante a noite com balanço.
    8. Após a conclusão da etapa de incubação gire a mistura por 1 min a 10.000 x g a 4 °C e descarte o supernaspe.
    9. Lave a pelota resultante 3 vezes com tampão de acetato de amônio contendo detergente 1% leve (por exemplo, concunda de sódio) por 10 min e gire as misturas por 1 min a 10.000 x g a 4 °C e descarte o supernatante.
    10. Prepare a solução secundária de anticorpos misturando 900 μL de tampão de acetato de amônio, 100 μL de soro de cabra 10% normal e 1 μL de anticorpo secundário conjugado por fluorohore (diluição de 1:1.000). Adicione 300 μL de solução de anticorpos secundários a cada uma das pelotas obtidas na etapa 7.1.9. e incubar durante a noite a 4 °C com balanço.
    11. Gire a mistura a 10.000 x g por 1 min a 4 °C e descarte o supernaspe.
    12. Lave a pelota resultante 3 vezes com tampão de acetato de amônio contendo detergente 1% leve (por exemplo, concunda de sódio) por 10 minutos e gire a mistura por 1 min a 10.000 x g a 4 °C e descarte o supernascedor.
    13. Resuspenda as pelotas resultantes em 50 μL de tampão de acetato de amônio. Coloque 20 μL de cada uma das misturas em um slide e cubra com um deslizamento.
    14. Imagem do IAM. Computador pessoal. Partículas DD2 com fragmentos de membrana celular imobilizada usando um microscópio de varredura a laser confocal com excitação a 488 nm e emissão a 520 nm geradas usando um sistema laser de estado sólido. Use um objetivo de 20x com um NA de 0,75 e WD de 0,35mm.
  2. Cromatografia de afinidade frontal usando 7,8-DHF como marcador de ligante
    1. Conecte uma coluna CMAC a um sistema HPLC com um detector de matriz de diodo e/ou espectrômetro de massa.
    2. Prepare 500 mL de solução de 1 mM de 7,8-DHF em tampão de acetato de amônio contendo 5% de metanol.
    3. Bombeie a concentração constante do ligante marcador (1 mM) através da coluna CMAC a 0,4 mL/min de fluxo à temperatura ambiente. Monitore o perfil de eluição usando um detector de detecção de matriz de diodo (DAD) (comprimento de onda de 254 nm) ou espectrômetro de massa (use modo de monitoramento de íon único; m/z 253 no modo de ionização negativa).
    4. Após a conclusão da corrida, execute a lavagem durante a noite, executando o tampão de acetato de amônio através da coluna.
    5. Repetir as etapas 7.2.2. - 7.2.4. utilizando diferentes concentrações do ligante marcador (750 nM, 500 nM, 300 nM), lavando as colunas durante a noite após cada execução. Use cromatografia de afinidade frontal para calcular ligante Kd, conforme revisado em detalhes, em outros lugares. 24,51
  3. Estudos de deslocamento com Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extrato
    1. Prepare 500 mL de solução de 500 nM de 7,8-DHF em tampão de acetato de amônio contendo 5% de metanol e extrato de gotu kola aquoso de 0,2% (10 mg/mL).
    2. Bombeie a concentração constante do ligante marcador (500 nM) com o extrato através da coluna a 0,4 mL/min de vazão à temperatura ambiente. Monitore o perfil de elução usando um detector PAI (comprimento de onda de 254 nm) ou um espectrômetro de massa (use modo de monitoramento de íons único; m/z 253 no modo de ionização negativa).
    3. Após a conclusão da corrida, execute a lavagem durante a noite, executando o tampão de acetato de amônio através da coluna.
    4. Plote os perfis de elução para 500 nM 7,8-DHF e o obtido após executar a solução com extrato gotu kola para inspecionar o deslocamento de ligantes marcadores.

8. Abordagem de cromatografia de pico ausente para identificar potenciais aglutinantes TrkB do extrato de Gotu Kola

  1. Fracionamento do extrato gotu kola nas colunas CMAC
    1. Conecte separadamente as colunas CMAC TrkB e TrkB-NULL a um sistema HPLC e injete 50 μL do extrato aquoso gotu kola (10 mg/mL) em cada uma das colunas. Tampão de acetato de amônio da bomba (10 mM, pH 7,4) contendo 5% de metanol através da coluna a 0,4 mL/min de fluxo à temperatura ambiente.
    2. Coletar frações separadamente das colunas CMAC TrkB e TrkB-NULL da seguinte forma: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Congele e liofilize as frações obtidas. Frações liofilizadas resuspend em 50 μL de metanol antes de proceder à cromatografia líquida de ultra-desempenho e análise de espectrometria de massa.
  2. Análise de espectrometria de massa de cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC-QTOF-MS) de frações gotu kola CMAC
    1. Analisar todas as frações obtidas no ponto 8.1.3. usando um espectrômetro de massa acoplado a um sistema UPLC (modo de análise UPLC-MSE ). Analise as frações utilizando uma coluna C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) com uma pré-coluna C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Elute a coluna utilizando as seguintes soluções gradientes a uma vazão de 0,3 mL/min com fase móvel A (água com ácido fórmico de 0,1%) e B (acetonitrilo com ácido fórmico de 0,1%): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
    3. Ajuste o volume de injeção para cada amostra para 3 μL. Execute MSE em modos de íon positivo e negativo em resolução, com energia de colisão em 4V para baixa energia e 20-35 V para alta energia.
    4. Use as seguintes condições de origem do ESI no modo de ionização positiva: tensão capilar 1,5 kV, cone amostral 40 V, deslocamento de origem 80, temperatura da origem 100 °C, temperatura de desolvação de 350 °C, fluxo de gás cone 38,0 L/h, gás dessolvation 400 L/h.
    5. Use as seguintes condições de origem do ESI no modo de ionização negativa: tensão capilar 1,45 kV, cone amostral 40 V, deslocamento de origem 80, temperatura da origem 110 °C, temperatura de dessolvação de 300 °C, fluxo de gás cone 50.0 L/h, fluxo de gás desolvação 652 L/h.

Resultados

Seguindo o protocolo, foram montadas duas colunas cromatográficas CMAC: uma com fragmentos imobilizados de membrana celular neuroblastoma SH-SY5Y com TrkB superexpresso e outra com fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. A coluna CMAC corretamente montada é apresentada na Figura 1 e as etapas envolvidas na imobilização do fragmento de membrana celular são apresentadas na Figura 2.

Desde a imobilização dos receptores T...

Discussão

A identificação de compostos ativos presentes em misturas complexas de metabólitos especializados é uma tarefa muito desafiadora23. Tradicionalmente, compostos individuais são isolados, e sua atividade é testada em diferentes ensaios. Essa abordagem é demorada e cara e muitas vezes leva ao isolamento e identificação dos compostos mais abundantes e bem caracterizados23. Atualmente, os ensaios de triagem de alto rendimento utilizados dependem fortemente da triagem d...

Divulgações

Lukasz Ciesla colabora com a Regis Technologies, fornecedora do IAM. Computador pessoal. Partículas DD2.

Agradecimentos

A Z.C.A. foi apoiada pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Centro Nacional de Medicina Complementar e Integrativa dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número 1R41AT011716-01. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pela American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, a Regis Technologies concedeu a L.C. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Dihydroxyflavone hydrateSigma-AldrichD5446-10 mg≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-AldrichA2383-1 g
Ammonium acetateVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
BDNF antibodyInvitrogenPA5-15198-400 μLPrimary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μgRecombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chlorideVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Cholic acid sodium saltAlfa AesarJ62050-100 g
Dounce homogenizerVWR71000-51640 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EthanolSigma-Aldrich493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442-500 mLsterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solutionSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrateVWR AnalyticalBDH9244-500 mL
MethanolSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbNikonConfocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)Life Technologies50197Z
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Potassium chlorideVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Protease inhibitor cocktailVWR Life Science AmbresoM221-1 mLProteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLwith L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell lineKerafastECP005
Snake skin dialysis tubingThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium chlorideBDH VWR AnalyticalBDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 columnGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4049-500 mL0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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