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Resumen

El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.

Resumen

Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.

Introducción

Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos1, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de moléculas sintetizadas químicamente. Muchos compuestos naturales interactúan y modulan los objetivos de proteínas humanas y pueden considerarse moléculas similares a fármacos optimizadas evolutivamente6. Estos compuestos naturales son particularmente adecuados para la identificación de plomo de fármacos para su uso en trastornos neurológicos6. Dos de los medicamentos actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) se derivan de alcaloides naturales, a saber: galantamina y rivastigmina (un derivado de la fisostigmina)6. L-DOPA, actualmente el medicamento más comúnmente recetado para la enfermedad de Parkinson, se identificó por primera vez a partir del frijol ancho (Vicia faba L.) 7. Pergolida y lisurida, agonistas del receptor dopaminérgico son los derivados de los alcaloides naturales del cornezuelo de centeno del hongo parásito Claviceps purpurea8. La reserpina, un alcaloide aislado de la raíz de serpiente india (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) fue uno de los primeros fármacos antipsicóticos9. Recientemente, la respuesta inmune desregulada y la inflamación sistémica se han relacionado con el desarrollo de numerosas dolencias neurológicas, como el trastorno depresivo mayor o las enfermedades neurodegenerativas10. Se ha encontrado que una dieta basada en plantas junto con otras intervenciones de estilo de vida mejora las capacidades cognitivas y funcionales en los ancianos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Se ha encontrado que ciertas moléculas electrofílicas pertenecientes a triterpenos y polifenoles modulan las respuestas inflamatorias tanto en modelos in vitro como in vivo 12. Por ejemplo, los compuestos naturales que contienen α,β carbonilo insaturado (por ejemplo, curcumina, cinamaldehído) o grupo isotiocianato (por ejemplo, sulforafano) interfieren con la dimerización del receptor Toll-4 (TLR4) que inhibe la síntesis aguas abajo de citoquinas proinflamatorias en una línea celular pro-B dependiente de interleucina-3 murina12,22 . La evidencia epidemiológica apunta fuertemente a que los fitoquímicos dietéticos, presentes en matrices alimentarias complejas, también pueden constituir una fuente viable de nuevos fármacos6.

Uno de los principales obstáculos en la identificación de moléculas biológicamente activas presentes en los extractos de plantas, incluidos los alimentos de origen vegetal, es la complejidad de las muestras investigadas. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan, purifican y posteriormente se prueban para la actividad biológica. Este enfoque generalmente conduce a la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados. Los enfoques de descubrimiento de fármacos fenotípicos sin una diana molecular definida se basan en el fraccionamiento bioguiado de mezclas complejas23. En este enfoque, un extracto se fracciona en subfracciones menos complejas que posteriormente se prueban en ensayos fenotípicos. El aislamiento y la purificación de los compuestos activos se guían por la actividad biológica verificada en el ensayo. El conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico puede acelerar significativamente la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en mezclas complejas. Esos enfoques generalmente se basan en la inmovilización del objetivo molecular, por ejemplo, una enzima, en una superficie sólida, como las perlas magnéticas23. Los objetivos inmovilizados se utilizan posteriormente en los experimentos de detección, lo que resulta en el aislamiento de compuestos que interactúan con el objetivo. Si bien este enfoque se ha utilizado ampliamente en la identificación de compuestos dirigidos a proteínas citosólicas, se ha aplicado con menos frecuencia en la identificación de sustancias químicas que interactúan con proteínas transmembrana (TMP)23. Un desafío adicional en la inmovilización de TMP se deriva del hecho de que la actividad de la proteína depende de su interacción con fosfolípidos de membrana celular y otras moléculas en la bicapa como el colesterol23,24. Es importante preservar estas interacciones sutiles entre las proteínas y su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos cuando se intenta inmovilizar el objetivo transmembrana.

En la cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) los fragmentos de membrana celular, y no las proteínas purificadas, se inmovilizan en las partículas de fase estacionaria de membrana artificial (IAM)23. Las fases estacionarias de IAM se preparan uniendo covalentemente análogos de fosfatidilcolina a sílice. Recientemente se han desarrollado nuevas clases de fases estacionarias de IAM en las que los grupos de amina libre y silanol tienen un límite final (IAM. PC. Partículas DD2). Durante la preparación de las columnas CMAC, los fragmentos de membrana celular se inmovilizan en la superficie de las partículas de IAM a través de la adsorción.

Las columnas de CMAC se han utilizado hasta la fecha para inmovilizar diferentes clases de TMP, incluidos los canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos), GPCR (por ejemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por ejemplo, p-glicoproteína), etc.24. Las dianas proteicas inmovilizadas se han utilizado en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (kon y koff) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de identificación de posibles nuevas derivaciones farmacológicas presentes en matrices complejas24 . Aquí presentamos la preparación de columnas CMAC con el receptor inmovilizado de tropomiosina quinasa B (TrkB), que ha surgido como un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso.

Estudios previos demostraron que la activación de la vía del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)/TrkB se asocia con la mejoría de ciertas dolencias neurológicas, como la EA o el trastorno depresivo mayor 25,26,27,28. Se informó que los niveles de BDNF y su receptor TrkB de expresión disminuyen en la EA, y reducciones similares perjudican la función del hipocampo en modelos animales de AD29. Se notificó disminución de los niveles de BDNF en suero y cerebro de pacientes con EA 30,31,32. Se encontró que la sobreexpresión de Tau o la hiperfosforilación regulan a la baja la expresión de BDNF en neuronas primarias y modelos animales de EA 33,34,35. Además, se informó que el BDNF tiene efectos protectores sobre la neurotoxicidad inducida por β-amiloide in vitro e in vivo36. Se demostró que la administración directa de BDNF en el cerebro de la rata aumenta el aprendizaje y la memoria en animales con deterioro cognitivo37. BDNF / TrkB surgió como un objetivo válido para mejorar los trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluido el28,38 d.C. Dirigirse a la vía de señalización BDNF / TrkB para el desarrollo de terapias en la EA mejorará potencialmente nuestra comprensión de la enfermedad39. Desafortunadamente, el BDNF en sí no se puede usar como tratamiento debido a sus pobres propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios adversos40. Se han explorado activadores de moléculas pequeñas de las vías TrkB/BDNF como ligandos TrkB potenciales 41,42,43. Entre los agonistas de moléculas pequeñas probados, se ha demostrado que la 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF) activa la vía BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromona-7,8-diil bis(metilcarbamato)) está actualmente bajo consideración como un posible fármaco para la EA47. Recientemente, se demostró que varios antidepresivos funcionan a través de la unión directa a TrkB y la promoción de la señalización bdNF, enfatizando aún más la importancia de perseguir TrkB como un objetivo válido para tratar diversos trastornos neurológicos48.

El protocolo describe el proceso de ensamblaje de la columna TrkB funcional y la columna de control negativo TrkB-NULL. Las columnas se caracterizan utilizando un conocido ligando de pequeño molecular de producto natural: 7,8-DHF. Además, describimos el proceso de cribado de matrices complejas, utilizando extracto de planta como ejemplo, para la identificación de compuestos que interactúan con TrkB.

Protocolo

1. Cultivo celular de células de neuroblastoma SH-SY5Y (líneas celulares TrkB y TrkB-NULL (parentales))

NOTA: Las líneas celulares (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) y SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 fueron compradas a Kerafast. Las células cultivadas se utilizan como fuente de los receptores transmembrana a inmovilizar para la preparación de columnas CMAC. Los siguientes pasos describen cómo obtener fragmentos de membrana celular y ensamblar columnas CMAC funcionales.

  1. Cultive las células en un medio de cultivo celular preparado mezclando 450 ml de medios RPMI, 50 ml de FBS, 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina y 0,3 mg/ml de genetina (G418) en una placa de cultivo celular de 150 mm a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2.

2. Recolección celular

  1. Confirme la confluencia celular (80% -90%) utilizando un microscopio, alcanzada después de 3-4 días después del paso celular.
  2. Aspirar el medio de cultivo celular desde arriba de las células y lavar las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 1x, pH 7.4). Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina concentrada baja (0.25%) para separar las células.
  3. Gire suavemente la placa para cubrir uniformemente todas las células con solución de tripsina e incube las células durante aproximadamente 2 minutos a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2. Agregue 8 ml de medio de cultivo celular a las células de separación y transfiera las células separadas a un tubo cónico de 50 ml y colóquelo en hielo.
  4. Utilice un hemocitómetro para estimar el número de células (aproximadamente 3 x 107 células). Mezcle la suspensión de la celda mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo para obtener una densidad celular uniforme en la mezcla. Coloque 10 μL de suspensión celular debajo del cobertor y cuente las células bajo un microscopio utilizando un objetivo 40x.

3. Homogeneización celular

  1. Prepare soluciones madre de los siguientes inhibidores de la proteasa: benzamidina (200 mM), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, 10 mM) e inhibidores de proteasa disponibles comercialmente (concentración de 100x) que contenga clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenolfo (AEBSF), aprotinina, bestatina y leupeptina.
    PRECAUCIÓN: El PMSF solo debe manipularse dentro de la campana de humos.
    1. Prepare la solución madre de benzamidina (200 mM) disolviendo 120 mg de benzamidina en 5 ml de agua desionizada ultrapura. Conservar a 4 °C y utilizar en un día. Prepare la solución recién preparada antes de cada uso (recomendado).
    2. Preparar la solución madre de PMSF (10 mM) disolviendo 0,017 g de PMSF en 10 ml de etanol. Conservar a - 20 °C.
    3. Prepare el cóctel de inhibidores de la proteasa (100x) disolviendo la mezcla de inhibidores de la proteasa disponibles comercialmente en 1 ml de agua desionizada ultrapura. Mezclar bien y alícuota 200-300 μL del cóctel y conservar a - 20 °C antes de su uso.
  2. Preparar la solución madre de ATP (100 mM) disolviendo 55.114 mg de hidrato de sal disódica de ATP en 1 ml de agua ultrapura desionizada. Mezclar bien y alícuota 100 μL de la mezcla y almacenar a - 20 °C antes de usar.
  3. Preparar tampón disolviendo 3,03 g de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g de cloruro de sodio (NaCl, 100 mM), 0,22 g de cloruro de calcio anhidro (CaCl2, 3 mM), 0,2 g de cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2, 2 mM) y 0,19 de cloruro de potasio (KCl, 5 mM) en 500 mL de agua ultrapura desionizada.
  4. Preparar el tampón de homogeneización mezclando 17,3 ml del tampón preparado en la etapa 3,3 con 0,3 ml (3 mM) de solución madre de benzamidina, 0,2 ml (0,1 mM) de solución madre de FSPM, 0,2 ml de mezcla de cóctel inhibidor de la proteasa, 20 μL (100 μM) de solución madre de ATP, 2 ml (10%) de glicerol y 0,029 g (5 mM) de EDTA (Tabla 1). Ajuste el pH a 7.4 usando solución de ácido clorhídrico.
  5. Gire hacia abajo las células cosechadas en el paso 2.3 a 4 °C durante 5 min a 400 x g. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular restante con 10 ml de PBS helado (1x, pH 7.4). Gire las células de nuevo a 4 °C durante 5 min a 400 x g.
  6. Deseche el sobrenadante y reemplácelo por 20 ml de tampón de homogeneización preparado en el paso 3.4. Coloque el tubo cónico sobre hielo.
  7. Transfiera la suspensión celular a una amoladora de tejido homogeneizador Dounce de 40 ml y colóquela en hielo. Homogeneiza la suspensión manualmente, sobre hielo, utilizando 40 golpes de mortero hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión celular homogeneizada a un tubo cónico de 50 ml.
  8. Centrifugar el homogeneizado a 4 °C durante 7 min a 400 x g. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico y centrífuguelo a 4 °C durante 30 min a 47900 x g. Guarde el pellet de membrana celular y deseche el sobrenadante.

4. Solubilización de la membrana celular

  1. Preparar el tampón de solubilización mezclando 8,7 ml de la solución tampón realizada en la etapa 3,3 con 0,1 ml (0,1 mM) de solución madre de FMP, 0,15 ml (3 mM) de solución madre de benzamidina, 0,1 ml de cóctel inhibidor de la proteasa, 10 μL (100 μM) de solución madre de ATP, 1 ml (10%) de glicerol y 0,2 g (2%) de colato de sodio (Tabla 2).
  2. Transfiera el tampón de solubilización al tubo cónico con fragmentos de membrana celular obtenidos en el paso 3.8 y vuelva a suspender el pellet. Gire la mezcla resultante a 150 rpm a 4 °C durante 18 h.
    NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar para la solubilización de pellets de membrana celular durante la noche.

5. Inmovilización de la membrana celular en IAM. PC. Partículas DD2

  1. Después de 18 h, centrifugar la mezcla de solubilización a 4 °C durante 30 min a 47900 x g.
  2. Mantenga el sobrenadante y deseche el pellet. Añadir 100 mg de IAM. PC. Partículas DD2, al sobrenadante, vórtice y gire la mezcla de suspensión resultante a 150 rpm a 4 °C durante 1 h.
  3. Facilitar la inmovilización de fragmentos de membrana celular en el IAM. PC. Las partículas DD2 pasan a la etapa de diálisis como se describe a continuación.
    1. Preparar tampón de diálisis en 4 L de agua desionizada ultrapura añadiendo 24 g de tris-HCl (50 mM), 23,4 g de NaCl (100 mM), 0,06 g de CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g de EDTA (5 mM) y 0,07 g de PMSF (0,1 mM; Tabla 3).
      NOTA: PMSF no es soluble en agua, por lo tanto, disuelva primero en un pequeño volumen de etanol y luego agregue lentamente al vaso de precipitados con el tampón.
    2. Ajuste el pH a 7.4 con solución de ácido clorhídrico. Coloque el tampón a 4 °C durante un mínimo de 1 h antes de proceder a la etapa de diálisis.
    3. Prepare el tubo de diálisis cortando 10 cm de tubo de diálisis de membrana de celulosa (10 K MWCO, 35 mm) y transfiera la suspensión que contiene IAM. PC. Partículas DD2 y fragmentos de membrana celular en el tubo de diálisis. Use clips de tubos de diálisis para cerrar ambos extremos del tubo de diálisis.
    4. Coloque el tubo de diálisis que contiene el IAM. PC. Fase estacionaria DD2 en el tampón de diálisis y diálisis a 4 °C durante 24 h mientras se agita suavemente.
    5. Después de 24 h, coloque el tubo de diálisis en el tampón de diálisis recién preparado y continúe la diálisis durante otras 24 h.

6. Embalaje de columna CMAC

  1. Prepare el tampón de acetato de amonio (10 mM, pH 7.4) que se utilizará para lavar el IAM. PC. Partículas DD2 y en experimentos de caracterización en columna disolviendo 0,7708 g de acetato de amonio en 1 L de agua ultrapura desionizada. Ajuste el pH a 7.4 con solución de ácido clorhídrico.
  2. Después de 48 h de diálisis, retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis y transfiera el contenido del tubo de diálisis a un tubo cónico de 15 ml.
  3. Centrifugar la mezcla a 4 °C durante 5 min a 400 x g. Deseche el sobrenadante y lave el pellet restante tres veces con 10 ml de tampón de acetato de amonio, centrifugando la mezcla a 4 °C durante 5 min a 400 x g, después de cada lavado.
  4. Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet restante en 1 ml de tampón de acetato de amonio. Mézclelo bien y use la suspensión resultante para empacar la columna de vidrio 5/20 para producir la columna de cromatografía CMAC.
  5. Para empacar la columna, primero coloque un filtro inferior previamente empapado con tampón de acetato de amonio, en el soporte del filtro. Coloque el soporte del filtro en la columna de vidrio y atornille la tapa de la columna para asegurar la posición del soporte. Coloque la columna verticalmente en una abrazadera para los dedos y asegúrela en el soporte de laboratorio. Coloque un vaso de precipitados debajo de la columna.
  6. Utilizando un pipeteador de un solo canal, transfiera un pequeño volumen de la lechada obtenida en el paso 6.4 a la columna de vidrio. Vierta el material lentamente, sosteniendo la punta de la pipeta contra la pared de la columna de vidrio. Deje que el material de embalaje se asiente antes de verter otro volumen de purín.
  7. Para acelerar el proceso de embalaje, retire el búfer de arriba del lecho estacionario utilizando una micropipeta entre cada paso. Repita estos pasos hasta que se empaquete 1 ml de la suspensión.
  8. Coloque un filtro superior y atornille la unidad adaptadora para que no quede ningún búfer restante por encima de la fase estacionaria, como se presenta en la Figura 1. Asegure la posición de la unidad adaptadora con el bloqueo del adaptador.
  9. Conecte la columna a una bomba de cromatografía líquida (HPLC) de alto rendimiento, ajuste el caudal a 0,2 ml/min y lave la columna durante la noche con tampón de acetato de amonio. La columna ya está lista para el paso de caracterización. Conservar la columna a 4 °C hasta su uso.
    NOTA: Para un almacenamiento más prolongado (columna que no se utiliza durante más de una semana), ejecute la columna con una solución de azida de sodio al 0,05% en tampón de acetato de amonio y guárdela a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxica cuando se ingiere por vía oral o se absorbe a través de la piel; solo debe manipularse debajo de la campana de humos. Asegúrese de usar una bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes (se prefiere el nitrilo) cuando trabaje con azida de sodio.

7. Caracterización de la columna CMAC

  1. Microscopía confocal y unión BDNF
    1. Preparar IAM. Pcc. Partículas de fase estacionaria DD2 con fragmentos de membrana celular inmovilizados obtenidos por separado de las células de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan las células TrkB y SH-SY5Y TrkB-NULL siguiendo las instrucciones del paso 1 al paso 6.4.
    2. Para las muestras que se incubarán con BDNF antes de la tinción de anticuerpos, prepare la solución madre de BDNF disolviendo 10 μg de BDNF en 100 μL de agua desionizada ultrapura. Guarde la solución a -20 °C.
      1. Transferencia en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml, alícuota de 100 μL de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células inmovilizadas de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan TrkB y alícuota de 100 μL de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células SH-SY5Y TrkB-NULL inmovilizadas suspendidas en tampón de acetato de amonio.
      2. Añadir 390 μL de tampón de acetato de amonio, 10 μL de solución madre de BDNF y 0,5 μL de solución madre de ATP (preparada en la etapa 3.2) en cada tubo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con balanceo.
    3. Para las muestras que no se incubarán con BDNF antes de la tinción de anticuerpos, transfiera 100 μL de alícuota de IAM. PC. Material de embalaje de columna DD2 con células inmovilizadas de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan TrkB suspendido en acetato de amonio en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    4. Añadir 400 μL de tampón de acetato de amonio y 0,5 μL de solución madre de ATP (preparada en la etapa 3.2) en cada tubo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente con balanceo.
    5. Girar las muestras preparadas en los pasos 7.1.2 y 7.1.4 a 4 °C durante 1 min a 10.000 x g y desechar el sobrenadante.
    6. Lave los gránulos resultantes con 500 μL de tampón de acetato de amonio durante 10 min y gire de nuevo a 4 °C durante 1 min a 10.000 x g y deseche el sobrenadante.
    7. A cada uno de los gránulos, agregue 220 μL de tampón de acetato de amonio, 25 μL de suero de cabra normal al 10% y 5 μL de anticuerpo primario anti-BDNF. Incubar en una cámara frigorífica (4 °C) durante la noche con balanceo.
    8. Al finalizar la etapa de incubación, gire la mezcla durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
    9. Lave el pellet resultante 3 veces con tampón de acetato de amonio que contenga detergente suave al 1% (por ejemplo, colato de sodio) durante 10 min y haga girar las mezclas durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
    10. Preparar la solución de anticuerpos secundarios mezclando 900 μL de tampón de acetato de amonio, 100 μL de suero de cabra normal al 10% y 1 μL de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (dilución 1:1.000). Añadir 300 μL de solución secundaria de anticuerpos a cada uno de los gránulos obtenidos en la etapa 7.1.9. e incubar durante la noche a 4 °C con balanceo.
    11. Girar la mezcla a 10.000 x g durante 1 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    12. Lave el pellet resultante 3 veces con tampón de acetato de amonio que contenga detergente suave al 1% (por ejemplo, colato de sodio) durante 10 min y haga girar la mezcla durante 1 min a 10.000 x g a 4 °C y deseche el sobrenadante.
    13. Resuspender los gránulos resultantes en 50 μL de tampón de acetato de amonio. Coloque 20 μL de cada una de las mezclas en un portaobjetos y cúbralo con un cubrebocas.
    14. Imagen del IAM. PC. Partículas DD2 con los fragmentos de membrana celular inmovilizados utilizando un microscopio láser confocal con excitación a 488 nm y emisión a 520 nm generada mediante un sistema láser de estado sólido. Utilice un objetivo 20x con un NA de 0,75 y un WD de 0,35 mm.
  2. Cromatografía de afinidad frontal utilizando 7,8-DHF como ligando marcador
    1. Conecte una columna CMAC a un sistema HPLC con un detector de matriz de diodos y/o un espectrómetro de masas.
    2. Preparar 500 ml de solución de 1 mM de 7,8-DHF en tampón de acetato de amonio que contenga 5% de metanol.
    3. Bombee la concentración constante del ligando marcador (1 mM) a través de la columna CMAC a un caudal de 0,4 ml/min a temperatura ambiente. Supervise el perfil de elución utilizando un detector de detección de matriz de diodos (DAD) (longitud de onda de 254 nm) o un espectrómetro de masas (utilice el modo de monitoreo de iones únicos; m/z 253 en modo de ionización negativa).
    4. Después de completar la ejecución, realice un lavado nocturno pasando el tampón de acetato de amonio a través de la columna.
    5. Repita los pasos 7.2.2. - 7.2.4. utilizando diferentes concentraciones del ligando marcador (750 nM, 500 nM, 300 nM), lavando las columnas durante la noche después de cada carrera. Utilice la cromatografía de afinidad frontal para calcular el ligando Kd, como se revisó en detalle, en otro lugar. 24,51
  3. Estudios de desplazamiento con Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extracto
    1. Preparar 500 ml de solución de 500 nM de 7,8-DHF en tampón de acetato de amonio que contenga 5% de metanol y extracto acuoso de centella asiática al 0,2% (10 mg/ml).
    2. Bombear la concentración constante del ligando marcador (500 nM) con el extracto a través de la columna a un caudal de 0,4 mL/min a temperatura ambiente. Monitoree el perfil de elución utilizando un detector DAD (longitud de onda 254 nm) o un espectrómetro de masas (use el modo de monitoreo de iones únicos; m / z 253 en modo de ionización negativa).
    3. Después de completar la ejecución, realice un lavado nocturno pasando el tampón de acetato de amonio a través de la columna.
    4. Trazar los perfiles de elución para 500 nM 7,8-DHF y el obtenido después de ejecutar la solución con extracto de centella asiática para inspeccionar el desplazamiento del ligando marcador.

8. Falta un enfoque de cromatografía de pico para identificar posibles aglutinantes de TrkB a partir del extracto de centella asiática

  1. Fraccionamiento del extracto de centella asiática en columnas CMAC
    1. Conecte por separado las columnas CMAC TrkB y TrkB-NULL a un sistema HPLC e inyecte 50 μL del extracto acuoso de centella asiática (10 mg/ml) en cada una de las columnas. Tampón de acetato de amonio de bomba (10 mM, pH 7.4) que contiene 5% de metanol a través de la columna a un caudal de 0.4 mL/min a temperatura ambiente.
    2. Recopile fracciones por separado de las columnas CMAC TrkB y TrkB-NULL de la siguiente manera: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
    3. Congelar y liofilizar las fracciones obtenidas. Resuspend fracciones liofilizadas en 50 μL de metanol antes de proceder a la cromatografía líquida de ultra rendimiento y al análisis de espectrometría de masas.
  2. Cromatografía líquida de ultra rendimiento quadrupolo de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (UPLC-QTOF-MS) análisis de fracciones de gotu kola CMAC
    1. Analizar todas las fracciones obtenidas en el punto 8.1.3. utilizando un espectrómetro de masas acoplado a un sistema UPLC (modo de análisis UPLC-MSE ). Analice las fracciones utilizando una columna C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) con una precolumna C18 VanGuard (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
    2. Eluya la columna utilizando las siguientes soluciones de gradiente a un caudal de 0,3 mL/min con fase móvil A (agua con ácido fórmico al 0,1%) y B (acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10.0 min 65% A 35% B, 20.0-24.0 min 1% A 99% B, 25.0-29.0 min 99% A 1% B.
    3. Ajuste el volumen de inyección para cada muestra a 3 μL. Realice MSE en modos de resolución de iones positivos y negativos, con energía de colisión a 4V para baja energía y 20-35 V para alta energía.
    4. Utilice las siguientes condiciones de fuente ESI en modo de ionización positiva: voltaje capilar 1.5 kV, cono de muestreo 40 V, compensación de fuente 80, temperatura de fuente 100 ° C, temperatura de dessolvación. 350 ° C, flujo de gas cono 38.0 L / h, gas de dessolvación 400 L / h.
    5. Utilice las siguientes condiciones de fuente ESI en modo de ionización negativa: voltaje capilar 1.45 kV, cono de muestreo 40 V, compensación de fuente 80, temperatura de fuente 110 ° C, temperatura de desolvación. 300 ° C, flujo de gas cono 50.0 L / h, flujo de gas de dessolvación 652 L / h.

Resultados

Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2.

Desde la inmoviliz...

Discusión

La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante23. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados23. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en...

Divulgaciones

Lukasz Ciesla colabora con Regis Technologies, el proveedor del IAM. PC. Partículas DD2.

Agradecimientos

Z.C.A. fue apoyado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) 2219- Programa Internacional de Becas de Investigación Postdoctoral. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional de Medicina Complementaria e Integrativa de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R41AT011716-01. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, regis Technologies grant to L.C. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
7-8 Dihydroxyflavone hydrateSigma-AldrichD5446-10 mg≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrateSigma-AldrichA2383-1 g
Ammonium acetateVWR Chemicals BDHBDH9204-500 g
BDNF antibodyInvitrogenPA5-15198-400 μLPrimary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrateSigma-AldrichB6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) humanSigma-AldrichB3795-10 μgRecombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chlorideVWR AnalyticalBDH9224-1 kg
Cholic acid sodium saltAlfa AesarJ62050-100 g
Dounce homogenizerVWR71000-51640 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
EthanolSigma-Aldrich493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWR AnalyticalBDH-9232-500 g
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442-500 mLsterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solutionSigma-AldrichG8168-100 mL50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
GlycerolVWR Life ScienceE520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)Regis Technologies, Inc.1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrateVWR AnalyticalBDH9244-500 mL
MethanolSigma-Aldrich322425
Nikon C2 DUVbNikonConfocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)Life Technologies50197Z
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)Thermo Scientific36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)VWR Life ScienceK812-500 mL1x
Potassium chlorideVWR Chemicals BDH0395-1 kg
Protease inhibitor cocktailVWR Life Science AmbresoM221-1 mLProteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758-500 mLwith L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen Alexa Flour Plus 488A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-BKerafastECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell lineKerafastECP005
Snake skin dialysis tubingThermo Scientific8824510K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azideSigma-AldrichS2002
Sodium chlorideBDH VWR AnalyticalBDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 columnGE Healthcare24-4064-08
Tris-HClVWR Life Science0497-1 kg
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT4049-500 mL0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA

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