고정화된 트로포미오신 키나제 수용체 B와 상호작용하는 특수 식물 대사산물을 확인하기 위한 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼

요약

상기 프로토콜은 기능적 막횡단 트로포미오신 키나제 수용체 B 단백질을 함유하는 고정화된 세포막 단편을 갖는 세포막 친화성 크로마토그래피(CMAC) 컬럼의 제조를 기술한다. 이러한 수용체와 상호 작용하고 복잡한 천연 혼합물에 존재하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 CMAC 컬럼의 사용도 설명됩니다.

초록

식물, 곰팡이, 박테리아 및 해양 무척추 동물에 의해 합성 된 화학 물질은 신약 히트 및 리드의 풍부한 원천이었습니다. 스타틴, 페니실린, 파클리탁셀, 라파마이신 또는 아르테미시닌과 같은 의약품은 의료 행위에서 일반적으로 사용되며 천연 제품에서 먼저 확인되고 분리되었습니다. 그러나 생물학적 활성 특수 대사 산물을 천연 공급원으로부터 식별하고 분리하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 전통적으로, 개별 대사 산물은 바이오 매스의 추출에 따라 복잡한 혼합물로부터 분리되고 정제됩니다. 이어서, 단리된 분자는 그들의 생물학적 활성을 검증하기 위해 기능적 분석에서 시험된다. 여기서 우리는 복잡한 혼합물로부터 직접 생물학적 활성 화합물을 확인하기 위해 세포막 친화성 크로마토그래피 (CMAC) 컬럼의 사용을 제시한다. CMAC 컬럼은 천연 인지질 이중층 환경에 내재된 고정화된 기능성 막횡단 단백질(TMP)과 상호작용하는 화합물의 동정을 가능하게 한다. 이것은 표적화 된 접근법이며, 이는 새로 확인 된 소분자 약물 후보로 조절하려는 활성을 가진 TMP를 알아야합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 수많은 신경계 장애에 대한 약물 발견의 실행 가능한 표적으로 부상 한 고정화 된 트로포미오신 키나제 수용체 B (TrkB)로 CMAC 컬럼을 제조하는 접근법을 제시합니다. 이 기사에서는 TrkB 수용체를 과발현하는 신경 모세포종 세포주를 사용하여 고정화 된 TrkB 수용체로 CMAC 컬럼을 조립하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 컬럼의 기능을 조사하기위한 접근법과 TrkB 수용체와 상호 작용하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 그 사용을 제시합니다.

서문

식물 혼합물은 약리학적 활성 화합물¹이 풍부하여 신약 히트의 식별을 위한 좋은 공급원 으로 작용하며 2,3,4,5를 리드한다. 천연 제품에서 새로운 의약품을 발견하는 것은 유익한 접근 방식이었으며 현재 승인 된 많은 약물은 자연에서 처음 확인 된 화합물에서 유래했습니다. 천연 화합물의 화학적 다양성은 화학적으로 합성 된 분자의 인공 라이브러리와 일치하기가 어렵습니다. 많은 천연 화합물이 인간 단백질 표적과 상호작용하고 조절하며, 진화적으로 최적화된 약물-유사 분자⁶로 간주될 수 있다. 이들 천연 화합물은 신경 장애⁶에 사용하기 위한 약물 납 확인에 특히 매우 적합하다. 알츠하이머 병 (AD)의 관리를위한 현재 FDA 승인 약물 중 두 가지는 천연 알칼로이드, 즉 갈란 타민과 리바 스티그민 (피소스티그민의 유도체)⁶에서 파생됩니다. 현재 파킨슨 병에 가장 일반적으로 처방되는 약물 인 L-DOPA는 넓은 콩 (Vicia faba L)에서 처음 확인되었습니다. ⁷. Pergolide 및 lisuride, dopaminergic 수용체 작용제는 기생 균류 Claviceps purpurea⁸에서 천연 ergot alkaloids의 유도체입니다. Reserpine, 인도 뱀 뿌리 (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz)에서 분리 된 알칼로이드는 최초의 항 정신병 약물^{중 하나였습니다 9}. 최근에, 조절되지 않는 면역 반응 및 전신 염증은 다수의 신경학적 질환, 예컨대 주요 우울 장애 또는 신경퇴행성 질환⁽¹⁰)의 발달과 연결되었다. 다른 생활 습관 개입과 함께 식물 기반식이 요법은 노인의인지 능력 및 기능 능력을 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . 트리테르펜 및 폴리페놀에 속하는 특정 친전자성 분자는 시험관내 및 생체내 모델¹² 모두에서 염증 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, α,β-불포화 카르보닐 (예를 들어, 커큐민, 신남알데히드), 또는 이소티오시아네이트 기 (예를 들어, 설포라판)를 함유하는 천연 화합물은 뮤린 인터루킨-3 의존성 pro-B 세포주^12,22에서 전염증성 사이토카인의 하류 합성을 억제하는 톨-유사 수용체-4 (TLR4) 이량체화를 방해한다. . 역학적 증거는 복잡한 식품 매트릭스에 존재하는식이 식물 화학 물질이 또한 신약 리드의 실행 가능한 원천이 될 수 있음을 강력하게 지적합니다⁶.

식물 기반 식품을 포함한 식물 추출물에 존재하는 생물학적 활성 분자의 확인에 있어 주요 장애물 중 하나는 조사된 샘플의 복잡성이다. 전통적으로, 개별 화합물은 단리되고, 정제되고, 이어서 생물학적 활성에 대해 시험된다. 이러한 접근법은 일반적으로 가장 풍부하고 잘 특성화된 화합물의 확인으로 이어진다. 정의된 분자 표적이 없는 표현형 약물 발견 접근법은 복합 혼합물⁽²³)의 생체가이드-분획화에 의존한다. 이 접근법에서, 추출물은 표현형 분석에서 후속적으로 시험되는 덜 복잡한 하위분획으로 분획된다. 활성 화합물의 단리 및 정제는 분석에서 검증된 생물학적 활성에 의해 유도된다. 특정 약물 표적의 동일성에 대한 지식은 복합 혼합물에 존재하는 약리학적 활성 화합물의 식별을 상당히 가속화시킬 수 있다. 이러한 접근법은 일반적으로 자성 비드⁽²³)와 같은 고체 표면 상에 분자 표적, 예를 들어, 효소의 고정화에 기초한다. 고정화된 표적은 후속적으로 스크리닝 실험에 사용되어 표적과 상호작용하는 화합물의 단리를 초래한다. 이 접근법은 세포질 단백질을 표적으로 하는 화합물의 확인에 광범위하게 사용되었지만, 막횡단 단백질(TMPs)²³과 상호작용하는 화학물질의 확인에는 덜 일반적으로 적용되어 왔다. TMPs의 고정화에 있어서의 추가적인 도전은 단백질의 활성이 세포막 인지질 및 콜레스테롤^23,24와 같은 이중층의 다른 분자와의 상호작용에 의존한다는 사실로부터 기인한다. 막횡단 표적을 고정화하려고 할 때 단백질과 그들의 천연 인지질 이중층 환경 사이의 이러한 미묘한 상호작용을 보존하는 것이 중요하다.

세포막 친화성 크로마토그래피 (CMAC)에서 세포막 단편은 정제되지 않은 단백질이며, 인공 막 (IAM) 고정상 입자 (²³) 상에 고정화된다. IAM 고정상은 포스파티딜콜린 유사체를 실리카 상에 공유 결합시킴으로써 제조된다. 최근 자유 아민 및 실라놀 그룹이 엔드 캡핑되는 IAM 고정상의 새로운 클래스가 개발되었습니다 (IAM. 개인용 컴퓨터. DD2 입자). CMAC 컬럼 준비 동안 세포막 단편은 흡착을 통해 IAM 입자의 표면 상에 고정화된다.

CMAC 컬럼은 현재까지 이온 채널 (예를 들어, 니코틴 수용체), GPCR (예를 들어, 오피오이드 수용체), 단백질 수송체 (예를 들어, p-당단백질) 등을 포함하는 TMP의 상이한 부류를 고정화하기 위해 사용되어 왔다.²⁴. 고정화된 단백질 표적은 표적과 상호작용하는 소분자 리간드의 약력학(예를 들어, 해리 상수, Kd) 또는 결합 동역학(_kon 및_koff)의 결정뿐만 아니라 복합 매트릭스(²⁴)에 존재하는 잠재적인 신약 리드의 동정 과정에서 사용되어 왔다. . 여기서 우리는 수많은 신경계 장애에 대한 약물 발견의 실행 가능한 표적으로 부상 한 고정화 된 트로포미오신 키나제 수용체 B (TrkB)를 가진 CMAC 컬럼의 제조를 제시합니다.

이전의 연구에 따르면 뇌 유래 신경 영양 인자 (BDNF) / TrkB 경로의 활성화는 AD 또는 주요 우울 장애 25,26,27,28과 같은 특정 신경 질환의 개선과 관련이 있음을 보여주었습니다. BDNF 수준 및 이의 수용체 TrkB 발현이 AD에서 감소하고, 유사한 감소가 AD²⁹의 동물 모델에서 해마 기능을 손상시킨다는 것이 보고되었다. BDNF의 감소된 수준은 AD 환자^30,31,32의 혈청 및 뇌에서 보고되었다. 타우 과발현 또는 과인산화는 원발성 뉴런 및 AD 동물 모델^33,34,35에서 BDNF 발현을 하향 조절하는 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, BDNF는 시험관내 및 생체내³⁶에서 β-아밀로이드 유도된 신경독성에 대한 보호 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 래트 뇌 내로의 BDNF의 직접 투여는 인지적으로 손상된 동물(³⁷)에서 학습 및 기억력을 증가시키는 것으로 나타났다. BDNF / TrkB는 AD^28,38을 포함한 신경 및 정신 질환을 개선하기위한 유효한 대상으로 나타났습니다. AD에서 치료법 개발을 위한 BDNF/TrkB 신호전달 경로를 표적화하는 것은 잠재적으로 질병⁽³⁹)에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것이다. 불행히도, BDNF 자체는 열악한 약동학 특성 및 부작용⁴⁰ 때문에 치료제로 사용할 수 없습니다. TrkB/BDNF 경로의 소분자 활성화제는 잠재적인 TrkB 리간드 ^41,42,43으로서 탐구되었다. 시험된 소분자 작용제 중에서, 7,8-디하이드록시플라본(7,8-DHF)은 BDNF/TrkB 경로^41,44,45,46을 활성화시키는 것으로 나타났다. 7,8-DHF의 유도체 (R13; 4-옥소-2-페닐-4H-크로멘-7,8-디일 비스(메틸카바메이트))는 현재 AD⁴⁷에 대한 가능한 약물로서 고려되고 있다. 최근에, 몇몇 항우울제가 TrkB에 직접 결합하고 BDNF 신호전달을 촉진함으로써 작용한다는 것이 밝혀졌으며, 다양한 신경 장애를 치료하기 위한 유효한 표적으로서 TrkB를 추구하는 것의 중요성을 더욱 강조하였다⁽⁴⁸).

이 프로토콜은 기능적 TrkB 컬럼 및 TrkB-NULL 음성 대조군 컬럼을 조립하는 과정을 기술한다. 컬럼은 공지된 천연 생성물 소분자 리간드: 7,8-DHF를 사용하여 특성화된다. 추가적으로, 우리는 TrkB와 상호작용하는 화합물의 동정을 위해 식물 추출물을 예로 사용하여 복합 매트릭스를 스크리닝하는 과정을 설명한다.

프로토콜

1. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 세포 배양 (TrkB 및 TrkB-NULL (비경구) 세포주)

참고: 세포주 (SH-SY5Y 세포주 (TrkB, BR6) 및 SH-SY5Y 부모 세포주 (TrkB NULL))^49,50은 케라파스트로부터 구입하였다. 배양된 세포는 CMAC 컬럼의 제조를 위해 고정화되는 막횡단 수용체의 공급원으로서 사용된다. 다음 단계는 세포막 단편을 얻고 기능적 CMAC 컬럼을 조립하는 방법을 설명합니다.

1. RPMI 배지 450mL, FBS 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 용액 5mL, 제네티신(G418) 0.3mg/mL를 5%_CO2가 있는 습한 분위기에서 37°C의 150mm 세포 배양 접시에 혼합하여 준비한 세포 배양 배지에서 세포를 성장시킨다.

2. 세포 수확

1. 현미경을 이용하여 세포 컨플루언시(80%-90%)를 확인하고, 세포 통과 후 3-4일 후에 도달하였다.
2. 세포 위로부터의 흡인물 세포 배양 배지는 세포를 인산완충식염수(PBS, 1x, pH 7.4)로 두 번 세척한다. PBS를 제거하고 저농축 트립신 2mL(0.25%)를 첨가하여 세포를 분리한다.
3. 모든 세포를 트립신 용액으로 고르게 덮기 위해 플레이트를 부드럽게 소용돌이치고, 세포를 5% CO2로 습한 분위기에서 37°C에서 대략₂분 동안 인큐베이션한다. 세포 배양 배지 8 mL를 첨가하여 세포를 분리하고 분리된 세포를 50 mL 원뿔형 튜브로 옮겨 얼음 위에 놓습니다.
4. 혈구세포계를 사용하여 세포 수 (약 3 x 10 7 세포)^를 추정하십시오. 세포 현탁액을 상하로 피펫팅하여 혼합하여 혼합물 중의 균일한 세포 밀도를 얻는다. 10 μL의 세포 현탁액을 커버슬립 아래에 놓고 40x 목표를 사용하여 현미경으로 세포를 계수한다.

3. 세포 균질화

1. 벤즈아미딘 (200 mM), 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF, 10 mM) 및 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드 (AEBSF), 아프로티닌, 베스타틴 및 류펩틴을 함유하는 시판되는 프로테아제 억제제 칵테일 (100x 농도)의 스톡 용액을 준비하십시오.
   주의: PMSF는 흄 후드 내부에서만 취급해야 합니다.
   1. 벤자미딘 120mg을 초순수 탈이온수 5mL에 용해시켜 벤자미딘 원액(200mM)을 준비한다. 4 °C에서 보관하고 하루 이내에 사용하십시오. 각 사용 전에 용액을 신선하게 준비하십시오 (권장).
   2. 0.017 g의 PMSF를 10 mL의 에탄올에 용해시켜 PMSF 원액 (10 mM)을 준비한다. - 20 °C에서 보관하십시오.
   3. 시판되는 프로테아제 억제제 혼합물을 초순수 탈이온수 1 mL에 용해시켜 프로테아제 억제제 칵테일(100x)을 준비한다. 칵테일 200-300 μL의 분취량을 완전히 혼합하고 사용 전에 -20°C에서 보관하십시오.
2. 탈이온화 초순수 1 mL에 ATP 디소듐 염 수화물 55.114 mg을 용해시켜 ATP 원액(100 mM)을 제조하였다. 혼합물 100 μL의 분취량을 완전히 혼합하고 사용 전에 -20°C에서 보관한다.
3. 3.03 g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris-HCl, 50 mM), 2.9 g의 염화나트륨(NaCl, 100 mM), 0.22 g의 염화칼슘 무수(_CaCl2, 3 mM), 0.2 g의 염화마그네슘 육수화물(_MgCl2, 2 mM) 및 0.19의 염화칼륨(KCl, 5 mM)을 초순수 탈이온수 500 mL에 용해시켜 완충액을 준비한다.
4. 단계 3.3에서 제조한 완충액 17.3 mL를 0.3 mL(3 mM)의 벤즈아미딘 원액, 0.2 mL(0.1 mM)의 PMSF 원액, 0.2 mL의 프로테아제 억제제 칵테일 혼합물, 20 μL(100 μM)의 ATP 원액, 2 mL(10%)의 글리세롤, 및 0.029 g(5mM)의 EDTA와 혼합하여 균질화 완충액을 제조하였다(표 1). 염산 용액을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
5. 단계 2.3에서 수확된 세포를 4°C에서 5분 동안 400 x g으로 스핀다운시킨다. 상청액을 제거하고 남은 세포 펠릿을 빙냉 PBS (1x, pH 7.4) 10 mL로 세척하였다. 세포를 다시 400 x g에서 5분 동안 4°C에서 스핀다운시킨다.
6. 상청액을 버리고 단계 3.4에서 제조된 균질화 완충액 20 mL로 교체한다. 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
7. 세포 현탁액을 40 mL Dounce 호모게나이저 조직 분쇄기에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 서스펜션을 얼음 위에서 수동으로 균질화하고 40 개의 상하 유역 스트로크를 사용하십시오. 균질화된 세포 현탁액을 50 mL 코니컬 튜브 내로 옮긴다.
8. 균질액을 400 x g에서 7분 동안 4°C에서 원심분리한다. 펠렛을 버리고 상층액을 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 4°C에서 30분 동안 47900 x g에서 원심분리한다. 세포막 펠릿을 저장하고 상층액을 버리십시오.

4. 세포막 가용화

1. 단계 3.3에서 만든 완충용액 8.7 mL를 0.1 mL(0.1 mM)의 PMSF 원액, 0.15 mL(3 mM)의 벤자미딘 원액, 0.1 mL의 프로테아제 억제제 칵테일, 10 μL(100 μM)의 ATP 원액, 1 mL(10%)의 글리세롤 및 0.2 g(2%)의 콜레이트나트륨과 혼합하여 가용화 완충액을 준비한다(표 2).
2. 가용화 완충액을 단계 3.8에서 수득된 세포막 단편과 함께 원뿔형 튜브 내로 옮기고 펠렛을 재현탁시킨다. 생성된 혼합물을 4°C에서 150 rpm으로 18 h 동안 회전시킨다.
   참고: 이 시점에서, 실험은 세포막 펠릿 가용화를 위해 밤새 일시 중지될 수 있다.

5. IAM에 세포막 고정화. 개인용 컴퓨터. DD2 입자

1. 18시간 후, 가용화 혼합물을 47900 x g에서 30분 동안 4°C에서 원심분리 한다.
2. 상청액을 유지하고 펠렛을 버리십시오. IAM 100mg을 첨가하십시오. 개인용 컴퓨터. DD2 입자는, 상청액, 와류를 위하여, 생성된 현탁액 혼합물을 4°C에서 1 h 동안 150 rpm으로 회전시킨다.
3. IAM 상의 세포막 단편의 고정화를 용이하게 한다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자는 아래에 요약된 바와 같이 투석 단계를 진행한다.
   1. 24 g의 tris-HCl (50 mM), 23.4 g의 NaCl (100 mM), 0.06 g의 CaCl2 (0.1 mM), 5.85 g의 EDTA (5 mM), 및 0.07 g의 PMSF₍ 0.1 mM; 표 3).
      참고 : PMSF는 물에 용해되지 않으므로 먼저 소량의 에탄올에 녹인 다음 버퍼로 비커에 천천히 첨가하십시오.
   2. 염산 용액으로 pH를 7.4로 조정하십시오. 투석 단계로 진행하기 전에 완충액을 최소 1 h 동안 4°C에 놓는다.
   3. 10 cm의 셀룰로오스 막 투석 튜브 (10 K MWCO, 35 mm)를 절단하여 투석 튜브를 준비하고 IAM을 함유 한 현탁액을 옮깁니다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자 및 세포막 단편은 투석 튜브 내로 들어간다. 투석 튜브 클립을 사용하여 투석 튜브의 양쪽 끝을 닫습니다.
   4. IAM이 포함된 투석 튜브를 놓습니다. 개인용 컴퓨터. DD2 고정상은 투석 완충액에서 4°C에서 24시간 동안 부드럽게 교반하면서 투석한다.
   5. 24시간 후, 투석 튜브를 갓 준비된 투석 완충액에 넣고 24시간 동안 투석을 계속한다.

6. CMAC 열 패킹

1. IAM을 세척하는데 사용될 암모늄 아세테이트 완충액 (10 mM, pH 7.4)을 준비한다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자 및 0.7708 g의 아세트산암모늄을 초순수 탈이온수 1 L에 용해시켜 컬럼 특성화 실험하였다. 염산 용액으로 pH를 7.4로 조정하십시오.
2. 투석 48시간 후, 투석 버퍼에서 투석 튜브를 제거하고 투석 튜브의 함량을 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
3. 혼합물을 400 x g에서 5분 동안 4°C에서 원심분리한다. 상층액을 버리고 남은 펠렛을 암모늄 아세테이트 완충액 10 mL로 세 번 세척하고, 혼합물을 400 x g에서 5분 동안 4°C에서 원심분리한 후, 각각 세척한다.
4. 세 번째 세척 후, 나머지 펠렛을 1 mL의 아세트산암모늄 완충액에 재현탁시킨다. 이를 완전히 혼합하고 생성 된 슬러리를 사용하여 5/20 유리 컬럼을 포장하여 CMAC 크로마토그래피 컬럼을 수득하십시오.
5. 컬럼을 포장하려면 먼저 이전에 아세트산암모늄 버퍼에 담근 바닥 필터를 필터 홀더에 넣습니다. 필터 홀더를 유리 컬럼에 맞추고 컬럼 캡을 조여서 홀더의 위치를 고정시킵니다. 컬럼을 손가락 클램프에 수직으로 놓고 실험실 스탠드에 고정시킵니다. 열 아래에 비커를 놓습니다.
6. 단일 채널 피펫터를 사용하여 단계 6.4에서 수득된 슬러리의 작은 부피를 유리 컬럼 내로 옮긴다. 재료를 천천히 붓고 피펫 팁을 유리 기둥 벽에 대고 있습니다. 다른 부피의 슬러리를 붓기 전에 포장재가 침전되도록 허용하십시오.
7. 패킹 공정의 속도를 높이기 위해 각 단계 사이에 마이크로피펫을 이용하여 고정층 위에서 버퍼를 제거한다. 슬러리 1mL가 포장될 때까지 이 단계를 반복한다.
8. 상단 필터를 놓고 어댑터 장치를 나사로 조여서 그림 1과 같이 고정상 위에 버퍼가 남아 있지 않도록 합니다. 어댑터 잠금 장치로 어댑터 장치의 위치를 고정합니다.
9. 컬럼을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프에 연결하고, 유량을 0.2 mL/min으로 설정하고, 아세트산암모늄 버퍼로 컬럼을 밤새 세척한다. 이제 컬럼이 특성화 단계에 대한 준비가 되었습니다. 컬럼을 사용할 때까지 4°C에서 보관한다.
   참고: 더 긴 보관(일주일 이상 사용하지 않는 컬럼)을 위해 아세트산암모늄 완충액에 0.05% 나트륨 아지드 용액으로 컬럼을 실행하고 4°C에서 보관하십시오.
   주의: 아지드 나트륨은 경구로 섭취하거나 피부를 통해 흡수될 때 매우 독성이 있습니다. 그것은 흄 후드 아래에서만 다루어야합니다. 나트륨 아지드로 작업 할 때 실험실 코트, 안전 안경 및 장갑 (니트릴 선호)을 착용하십시오.

7. CMAC 컬럼 특성화

1. 공초점 현미경 및 BDNF 결합
   1. IAM을 준비합니다. PCC. DD2 고정상 입자는 단계 1 내지 단계 6.4로부터의 지시에 따라 TrkB 및 SH-SY5Y TrkB-NULL 세포를 과발현하는 SH-SY5Y 신경모세포종 세포와 별도로 수득된 고정화된 세포막 단편을 갖는 고정화 세포이다.
   2. 항체 염색 전에 BDNF와 함께 인큐베이션될 샘플의 경우, 10μg의 BDNF를 100μL의 초순수 탈이온수에 용해시켜 BDNF 원액을 제조하였다. 용액을 -20°C에서 보관한다.
      1. IAM의 분리된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브, 100 μL 분취량으로 옮긴다. 개인용 컴퓨터. 고정화된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 가진 DD2 컬럼 패킹 물질은 TrkB 및 IAM의 100 μL 분취량을 과발현한다. 개인용 컴퓨터. 고정화된 SH-SY5Y TrkB-NULL 세포를 아세트산암모늄 완충액에 현탁시킨 DD2 컬럼 패킹 재료.
      2. 390 μL의 아세트산암모늄 완충액, 10 μL의 BDNF 원액, 및 0.5 μL의 ATP 원액(단계 3.2에서 제조됨)을 각 튜브에 첨가하고, 락킹하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 항체 염색 전에 BDNF와 함께 인큐베이션되지 않을 샘플의 경우, IAM의 100 μL 분취량을 전사한다. 개인용 컴퓨터. 고정화된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 고정화시킨 DD2 컬럼 패킹 물질을 암모늄 아세테이트에 현탁시켜 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
   4. 400 μL의 아세트산암모늄 완충액과 0.5 μL의 ATP 원액(단계 3.2에서 제조됨)을 각 튜브에 첨가하고, 흔들면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   5. 단계 7.1.2 및 7.1.4에서 제조된 샘플을 4°C에서 10,000 x g 에서 1분 동안 회전시키고 상청액을 버린다.
   6. 얻어진 펠렛을 500 μL의 아세트산암모늄 완충액으로 10분 동안 세척하고, 다시 4°C에서 10,000 x g 에서 1분 동안 스핀하고 상청액을 버린다.
   7. 각각의 펠렛에, 220 μL의 암모늄 아세테이트 완충액, 25 μL의 10% 정상 염소 혈청, 및 5 μL의 일차 항-BDNF 항체를 첨가한다. 차가운 방 (4 °C)에서 하룻밤 동안 흔들면서 배양하십시오.
   8. 인큐베이션 단계가 완료되면 혼합물을 4°C에서 10,000 x g 에서 1분 동안 스핀하고 상청액을 버린다.
   9. 생성된 펠렛을 1% 온화한 세제(예를 들어, 콜레이트나트륨)를 함유하는 아세트산암모늄 완충액으로 3회 세척하고 혼합물을 4°C에서 10,000 x g 에서 1분 동안 스핀하고 상청액을 버린다.
   10. 900 μL의 암모늄 아세테이트 완충액, 100 μL의 10% 정상 염소 혈청, 및 1 μL의 형광단 접합된 이차 항체 (1:1,000 희석액)를 혼합하여 이차 항체 용액을 제조하였다. 300 μL의 이차 항체 용액을 단계 7.1.9에서 수득된 각각의 펠렛에 첨가한다. 흔들면서 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
   11. 혼합물을 4°C에서 1분 동안 10,000 x g 으로 회전시키고 상청액을 버린다.
   12. 생성된 펠렛을 1% 온화한 세제(예를 들어, 콜레이트나트륨)를 함유하는 아세트산암모늄 완충액으로 3회 세척하고 10분 동안 혼합물을 4°C에서 10,000 x g 에서 1분 동안 스핀하고 상청액을 버린다.
   13. 생성된 펠렛을 50 μL의 암모늄 아세테이트 완충액에 재현탁시킨다. 각 혼합물 20 μL를 슬라이드 상에 놓고 커버슬립으로 덮는다.
   14. IAM을 이미지화합니다. 개인용 컴퓨터. 고정화된 세포막 단편을 갖는 DD2 입자는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 488 nm에서의 여기 및 520 nm에서의 방출을 갖는 고체 상태 레이저 시스템을 사용하여 생성된다. NA가 0.75이고 WD가 0.35mm인 20x 목표를 사용하십시오.
2. 마커 리간드로서 7,8-DHF를 이용한 전두엽 친화성 크로마토그래피
   1. CMAC 컬럼을 다이오드 어레이 검출기 및/또는 질량 분광계를 사용하여 HPLC 시스템에 연결합니다.
   2. 5% 메탄올을 함유하는 암모늄 아세테이트 완충액 중의 7,8-DHF의 1mM 용액 500 mL를 준비한다.
   3. 마커 리간드 (1 mM)의 일정한 농도를 실온에서 0.4 mL/min 유속으로 CMAC 컬럼을 통해 펌핑한다. 다이오드 어레이 검출(DAD)(파장 254nm) 검출기 또는 질량 분광계(단일 이온 모니터링 모드 사용, 음이온화 모드에서는 m/z 253 사용)를 사용하여 용출 프로파일을 모니터링합니다.
   4. 실행 완료 후 컬럼을 통해 아세트산암모늄 완충액을 실행하여 밤새 세척을 수행한다.
   5. 7.2.2단계를 반복합니다. - 7.2.4. 상이한 농도의 마커 리간드 (750 nM, 500 nM, 300 nM)를 사용하여, 각각의 실행 후에 컬럼을 밤새 세척하였다. 정면 친화성 크로마토그래피를 사용하여 다른 곳에서 자세히 검토한 바와 같이 리간드_Kd를 계산하십시오. ^24,51명
3. Centella asiatica (L.) Urb와의 변위 연구. (고투 콜라) 추출물
   1. 5% 메탄올과 0.2% 고투콜라 추출물(10mg/mL)이 들어있는 아세트산암모늄 완충액에 7,8-DHF의 500nM 용액 500mL를 준비한다.
   2. 추출물과 함께 마커 리간드 (500 nM)의 일정한 농도를 실온에서 0.4 mL/min 유속으로 컬럼을 통해 펌핑한다. DAD 검출기(파장 254nm) 또는 질량 분석기(단일 이온 모니터링 모드 사용, 음이온화 모드에서는 m/z 253 사용)를 사용하여 용출 프로파일을 모니터링합니다.
   3. 실행 완료 후 컬럼을 통해 아세트산암모늄 완충액을 실행하여 밤새 세척을 수행한다.
   4. 500 nM 7,8-DHF에 대한 용출 프로파일을 플롯하고, 마커 리간드 변위를 검사하기 위해 gotu 콜라 추출물로 용액을 실행한 후에 수득한 것이다.

8. gotu 콜라 추출물에서 잠재적 인 TrkB 바인더를 확인하기위한 피크 크로마토그래피 접근법 누락

1. CMAC 컬럼에서 gotu 콜라 추출물의 분획화
   1. CMAC TrkB 및 TrkB-NULL 컬럼을 HPLC 시스템에 별도로 연결하고 각 컬럼에 수성 gotu 콜라 추출물 (10 mg / mL) 50 μL를 주입하십시오. 5% 메탄올을 함유하는 암모늄 아세테이트 완충액 (10 mM, pH 7.4)을 실온에서 0.4 mL/min 유속으로 컬럼을 통해 펌핑한다.
   2. 다음과 같이 CMAC TrkB 및 TrkB-NULL 컬럼과 별도로 분획을 수집한다: 0-5분, 5-10분, 10-15분, 15-20분, 20-25분, 25-30분, 30-35분, 35-40분, 40-45분, 45-50분, 50-55분, 55-60분.
   3. 수득된 분획을 동결시키고 동결건조시킨다. 동결건조된 분획을 초고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석 분석을 진행하기 전에 50 μL의 메탄올에 재현탁시킨다.
2. 고투콜라 CMAC 분획의 초고성능 액체 크로마토그래피 사중극자 비행 시간 질량 분광분석법(UPLC-QTOF-MS) 분석
   1. 점 8.1.3에서 얻은 모든 분획을 분석한다. UPLC 시스템 (UPLC-MS^E 분석 모드)과 결합 된 질량 분광계를 사용합니다. C18 VanGuard 예비 컬럼 (2.1 mm x 5 mm, 1.7 μm)과 C18 VanGuard 예비 컬럼 (2.1 mm x 5 mm, 1.7 μm)을 사용하여 분획을 분석한다.
   2. 이동상 A(0.1% 포름산을 갖는 물) 및 B(0.1% 포름산을 갖는 아세토니트릴)와 함께 0.3 mL/min의 유속으로 다음 구배 용액을 사용하여 컬럼을 분리한다: 0.0분 99% A 1% B, 1.5분 84% A 16% B, 5.0분 80% A 20% B, 7.0분 75% A 25% B, 10.0 분 65 % A 35 % B, 20.0-24.0 분 1 % A 99 % B, 25.0-29.0 분 99 % A 1 % B.
   3. 각 샘플의 주입량을 3μL로 설정합니다. 분해능 포지티브 및 음이온 모드에서 MS^E 를 수행하며, 낮은 에너지의 경우 4V, 높은 에너지의 경우 20-35V에서 충돌 에너지를 사용합니다.
   4. 포지티브 이온화 모드에서 다음 ESI 소스 조건을 사용하십시오: 모세관 전압 1.5kV, 샘플링 콘 40V, 소스 오프셋 80V, 소스 온도 100°C, 탈용매화 온도 350°C, 콘 가스 유량 38.0L/h, 탈용매화 가스 400L/h.
   5. 음이온화 모드에서 모세관 전압 1.45kV, 샘플링 콘 40V, 소스 오프셋 80V, 소스 온도 110°C, 용해 온도 300°C, 콘 가스 유량 50.0L/h, 용해 가스 유량 652L/h의 ESI 소스 조건을 사용하십시오.

결과

프로토콜에 따라, 두 개의 CMAC 크로마토그래피 컬럼이 조립되었다: 하나는 과발현된 TrkB를 갖는 고정화된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포막 단편과 SH-SY5Y TrkB-NULL 세포막 단편을 갖는 것이다. 정확하게 조립된 CMAC 컬럼은 도 1 에 제시되어 있고, 세포막 단편 고정화에 관여하는 단계들은 도 2에 제시되어 있다.

이후 IAM에 TrkB 수용체를 고정?...

토론

특수 대사 산물의 복잡한 혼합물에 존재하는 활성 화합물의 확인은 매우 어려운 과제입니다²³. 전통적으로, 개별 화합물은 단리되고, 그들의 활성은 상이한 검정에서 시험된다. 이러한 접근법은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며, 종종 가장 풍부하고 잘 특성화된 화합물⁽²³)의 분리 및 동정으로 이어진다. 현재 사용되는 고처리량 스크리닝 분석은 이미 알려...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon C2 DUVb	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA