在小檗碱治疗下通过激活肌腱成纤维细胞自噬减轻糖尿病肌腱损伤

摘要

小檗碱 （BBR） 是从 黄连 中分离的异喹啉生物碱，具有有价值的药理活性，包括抗炎、抗肿瘤和缓解 2 型糖尿病 （T2DM） 的多种并发症。然而，BBR 在调节糖尿病肌腱损伤中的作用仍然知之甚少。本研究构建大鼠 T2DM 模型，通过 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记 （TUNEL） 测定和免疫组织化学分析评估 BBR 处理后肌腱组织中的细胞凋亡和自噬。从大鼠跟腱获得肌腱成纤维细胞，并使用流式细胞术、定量实时 PCR （qRT-PCR） 和 western blot 分析评估 BBR 在调节细胞凋亡、炎性细胞因子产生和自噬激活中的作用。我们证明 BBR 治疗显着增加了 T2DM 大鼠肌腱组织的自噬激活和减少细胞凋亡。在肌腱成纤维细胞中，BBR 抑制高葡萄糖 （HG） 诱导的细胞凋亡和促炎细胞因子的产生。HG 治疗导致肌腱成纤维细胞中自噬激活的减少，而 BBR 恢复了自噬激活。更重要的是，3-MA 对自噬的药理学抑制削弱了 BBR 对 HG 诱导的肌腱成纤维细胞损伤的保护作用。综上所述，目前的结果表明，BBR 通过激活肌腱成纤维细胞的自噬来帮助缓解糖尿病肌腱损伤。

引言

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种以高血糖¹ 为特征的全身性代谢紊乱。目前，糖尿病已成为威胁人类健康和预期寿命的主要疾病之一²。超过 90% 的病例是 2 型糖尿病，这是一种以慢性炎症³、胰岛素抵抗⁴ 和胰岛β细胞损伤⁵ 为特征的代谢性疾病，而且全世界的患病率每年都在增加。

2 型糖尿病带来一系列严重的并发症，对心血管系统⁶、眼睛⁷、肾脏⁷ 和神经⁸ 产生严重影响，使糖尿病患者面临多种残疾甚至危及生命的健康风险。关于肌肉骨骼系统的研究很少，尤其是关于糖尿病肌腱的病理变化。近年来，慢性肌腱病的发病率显著增加。肌腱可以动态调节其储存和传递能量的能力 ^9,10。在肌腱组织中，肌腱成纤维细胞在调节损伤后的肌腱适应和肌腱修复中起重要作用 ^9,11。目前，肌腱成纤维细胞对肌腱损伤的功能尚不清楚。

作为一种异喹啉生物碱，BBR 在多种生理过程中发挥药理作用，包括降低血糖、降血脂、降低胆固醇、抗炎作用、抗菌作用、去除活性氧和拮抗神经系统功能障碍^12,13。BBR 可以增加脂肪组织和骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用，上调肝脏和骨骼肌细胞中胰岛素受体的表达，增加肝脏中 LDL 受体的表达，并降低血浆中胆固醇和糖的水平¹⁴。尽管 BBR 在缓解 DM^15、16、17 的多种并发症方面具有有价值的药理活性，但 BBR 在调节糖尿病肌腱损伤中的作用仍然知之甚少。

自噬必须在大多数组织的基线水平发生，以撤回受损的细胞器并提供代谢物以维持代谢稳态^18,19。自噬在 β 细胞健康中起着至关重要的作用，自噬受损与β细胞功能障碍和糖尿病进展相关^20,21。新兴研究表明，BBR 诱导的自噬激活有助于改善糖尿病肾病²²。基于上述发现，我们探讨了 BBR 是否通过调节自噬有助于缓解糖尿病肌腱损伤。目前的结果表明，BBR 减少了 HG 诱导的肌腱成纤维细胞损伤和炎症反应。HG 减少了肌腱成纤维细胞的自噬激活，而 BBR 治疗恢复了自噬激活，并导致随后肌腱成纤维细胞活力增加和促炎细胞因子减少。

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研究方案

本研究经上海中医药大学岳阳中西医结合医院研究伦理委员会批准。所有动物实验均经上海中医药大学岳阳中西医结合医院伦理委员会批准（IACUC 编号：YYLAC-2019-1）。雄性 Wistar 大鼠 （200-240 g，8 周龄） 购自上海 SLAC 实验动物中心。

1. T2DM 大鼠模型

1. 将雄性 Wistar 大鼠（200-240 g，8 周龄）维持在气候受控的环境中，具有 12 小时的光照/黑暗循环（20 ± 2 °C 和 50%-60% 相对湿度）。在实验期间 随意 提供食物和水。
2. 努力尽量减少动物的痛苦，包括轻柔处理、日常笼子清洁和监测。
3. 将大鼠随机分为 3 组：对照组 （n = 5）、DM 模型组 （n = 5） 和用 BBR 治疗的糖尿病模型组 （n = 5）。
4. 根据先前的描述建立大鼠 DM 模型²³.
   1. 以 30 mg/kg 的剂量单次静脉注射溶解在新鲜制备的柠檬酸钠缓冲液 （w/v： 2%） 中的链脲佐菌素 （STZ） 给大鼠施用。用等体积的柠檬酸盐钠缓冲液腹膜内注射对照组，不含 STZ。
   2. 使用血气分析仪评估血糖。将具有指定血糖水平 （≥16.7 mmol/L，连续 10 天） 的大鼠用于 T2DM 模型。
   3. 1周后，将T2DM大鼠随机分成两组（每组n = 5）：未治疗的大鼠或通过管饲法施用200mg / kg /天的BBR的大鼠，持续4周。

2. 原发性肌腱成纤维细胞

1. 通过腹膜内注射巴比妥酸盐 （40 mg/kg） 在麻醉下处死大鼠，并获得先前报道的跟腱²⁴。
2. 从肌腱组织中分离肌腱成纤维细胞²⁵.
   1. 手动切碎肌腱组织，并将其放入含有 0.2% II 型胶原酶的 DMEM 中。在 37 °C 下剧烈搅拌 3 小时。
   2. 通过离心去除培养基，并向消化的组织中添加含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM。
   3. 用 100 μm 过滤器过滤肌腱组织，将过滤后的溶液倒入 6 孔板中，并将肌腱成纤维细胞维持在 37 °C 和 5% CO₂ 的加湿培养箱中。

3. 细胞活力检测

注：根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定法测量细胞活力。

1. 胰蛋白酶消化后，将肌腱成纤维细胞接种在 96 孔板（4 x 10³ 个细胞/孔）中，然后在存在或不存在 BBR（0、5、10、20、40 和 80 μM）的情况下用不同剂量的葡萄糖（0、5、10、20、30 和 50 mM）处理它们 48 小时。
   注：葡萄糖和 BBR 溶解在 DMEM 中。
2. 向每个孔中加入 CCK-8 溶液 （10 μL），并将细胞在 37°C 下再孵育 2 小时。
3. 随后，用酶标仪在 450 nm 的波长下测量每个孔的吸光度。

4. 细胞凋亡分析

注：碘化丙啶 （PI） 和膜联蛋白 V-FITC 流式细胞术测定法用于分析肌腱成纤维细胞的凋亡率。

1. 将肌腱成纤维细胞（5 x 10⁵ 个细胞）接种在 DMEM 中的 6 孔板中 24 小时。
2. 从每个孔中吸出并丢弃 DMEM。在存在或不存在 BBR （20 μM） 的情况下，用含有 HG （30 mM） 的新鲜 DMEM 处理细胞 24 小时。
3. 在 1x PBS 中用 0.25% 胰蛋白酶分离细胞，用 PBS 收获细胞，并以 2000 x g 离心 5 分钟。
4. 将细胞重悬于结合缓冲液（材料表）中，并在室温 （RT） 下用 10 μL FITC 缀合的膜联蛋白 V 和 5 μL PI 在黑暗中染色 15 分钟。
5. 然后，通过流式细胞仪分析细胞。

5. 定量实时聚合酶链反应 （qRT-PCR）

1. 根据制造商的建议，收获肌腱成纤维细胞并使用 RNA 提取试剂盒（材料表）进行匀浆。
2. 使用 Moloney 鼠白血病病毒逆转录酶和 Oligo （dT） 引物进行逆转录 PCR（材料表）。
3. 在实时荧光定量 PCR 系统上使用 SYBR green qPCR Mix 进行 qRT-PCR。循环条件是在 95 °C 下变性 10 分钟，在 95 °C 下变性 20 秒，55 °C 下 20 秒，在 72 °C 下 30 秒。
   注：有关 IL-1β、IL-6 和 IL-10 引物的详细信息，请参阅 材料表。β-actin 用作参考基因。
4. 使用 ^2-ΔΔCT 公式计算相对表达水平，如前所述²⁶ 。

6. 蛋白质印迹分析

1. 在存在或不存在 BBR （20 μM） 的情况下用 HG （30 mM） 处理 24 小时后，用 RIPA 缓冲液（材料表）裂解肌腱成纤维细胞，并使用二辛可宁酸测定法定量总蛋白浓度。
2. 在 RT 下通过 10% SDS-PAGE 从每个样品中分离等量的蛋白质 （50 μg），然后在 4 °C 下转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上 2 小时。
3. 在 TBST 中的 5% 脱脂奶粉中封闭膜，然后在 4 °C 下与以下一抗孵育过夜：抗 LC3B （1：1500）、抗 p62 （1：2000） 和抗 β-肌动蛋白 （1：3500） 抗体。
4. 用 TBST 洗涤后，将膜与山羊抗兔 H&L HRP 偶联的二抗 （1：5000） 在 RT 下孵育 1 小时。
5. 使用 ECL 化学发光试剂盒观察特异性印迹并通过光密度测定法定量放射自显影图。

7. 免疫组织化学分析 （IHC）

1. 将石蜡包埋的足肌腱组织切成 6 μm 厚的切片。
2. 将切片固定在 4% 福尔马林中后，将切片与抗 LC3 抗体 （1：200） 在 4 °C 下孵育过夜。
3. 使用 10 mM PBS（pH7.4 和 Tween 20）洗涤 3 次后，将所有切片与山羊抗兔 HRP 偶联的二抗 （1：1000） 在 37 °C 下孵育 1 小时，并在室温下用 DAB 和苏木精染色 60 分钟。
4. 使用倒置显微镜以 20 倍放大倍率对染色的载玻片进行成像。

8. TUNEL 测定

注：根据制造商的说明，使用 TUNEL 检测试剂盒分析肌腱组织中的细胞凋亡。

1. 将石蜡包埋的足肌腱组织切成 6 μm 厚的切片。
2. 在二甲苯中对切片进行脱蜡处理，并在分级系列乙醇中再水化。
3. 在 RT 下用 3% 过氧化氢浸泡后，将切片与 TUNEL 反应混合物在 37 °C 下孵育 1 小时。
4. 使用 DAPI 对细胞核进行复染。在荧光显微镜 （20x） 下观察染色细胞并确定 TUNEL 阳性细胞的百分比。

9. 统计分析

1. 使用适当的软件应用程序进行统计分析
   注意：在这里，数据表示为三个独立实验的平均值±标准差 （SD）。使用 SPSS 23.0 进行统计分析。采用学生 t 检验比较组间差异，多组分析采用单因素方差分析 （ANOVA）。当 p < 0.05 时，差异具有统计学意义。

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结果

为评价 BBR 在缓解糖尿病肌腱损伤中的药理作用，在存在或不存在 BBR 的情况下评估 DM 大鼠足肌腱组织中的细胞凋亡和自噬激活。 图 1A 显示，与对照大鼠相比，DM 大鼠肌腱组织中 LC3 （一种自噬标志物） 的蛋白水平降低，而 BBR 处理显着恢复了自噬激活。此外，与正常组织相比，DM 大鼠肌腱组织中的细胞凋亡升高，而 BBR 显着降低细胞凋亡 （

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讨论

肌腱损伤是 DM²⁷ 患者的常见并发症。肌腱成纤维细胞在伤口愈合过程中起重要作用^28,29。目前的研究证实，i） BBR 增加 DM 大鼠肌腱组织中的自噬激活并减少细胞凋亡，ii） BBR 减少 HG 诱导的肌腱成纤维细胞凋亡，iii） BBR 减轻 HG 诱导的肌腱成纤维细胞炎症反应，iv） BBR 恢复了 HG 处理的肌腱成纤维细胞的自噬激...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	516104-M
anti-LC3B	Abcam, CA, USA	ab48394
anti-p62	Abcam	ab91526
anti-β-actin antibody	Abcam	ab8227
Binding buffer	BD Biosciences	556454
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11965092
EVOS XL Core microscope	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodies	Abcam	ab205718
Leukemiavirus reverse transcriptase	Clontech	639574
Male Wistar rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd		200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 Primer	TaKaRa	3806
Primers	Shanghai Sangon Biotech		Synthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	20-188
RNA extraction kit (Trizol)	TaKaRa	9108Q
StepOne Realtime PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376357
TUNEL assay kit	Thermo Fisher Scientific	C10245