Soulagement des lésions du tendon diabétique par l’activation de l’autophagie des fibroblastes du tendon sous traitement à la berbérine

Résumé

La berbérine (BBR) est un alcaloïde isoquinoléine isolé de Coptis chinensis et possède des activités pharmacologiques précieuses, notamment anti-inflammatoires, antitumorales et soulageant plusieurs complications du diabète sucré de type 2 (DT2). Cependant, le rôle du BBR dans la régulation des lésions du tendon diabétique reste mal compris. Dans cette étude, un modèle de DT2 chez le rat a été construit, et l’apoptose cellulaire et l’autophagie ont été évaluées dans les tissus tendineux après un traitement BBR par le biais d’un test de marquage dUTP (TUNEL) et d’une analyse immunohistochimique. Des fibroblastes tendineux ont été obtenus à partir du tendon d’Achille du rat, et le rôle de BBR dans la régulation de l’apoptose cellulaire, la production de cytokines inflammatoires et l’activation de l’autophagie a été évalué à l’aide de la cytométrie en flux, de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et de l’analyse par western blot. Nous avons démontré que le traitement BBR augmentait significativement l’activation de l’autophagie et diminuait l’apoptose cellulaire dans les tissus tendineux des rats DT2. Dans les fibroblastes tendineux, BBR a réprimé l’apoptose cellulaire induite par l’hyperglucose (HG) et la production de cytokines pro-inflammatoires. Le traitement par HG a entraîné une diminution de l’activation de l’autophagie dans les fibroblastes tendineux, tandis que la BBR a restauré l’activation de l’autophagie. Plus important encore, l’inhibition pharmacologique de l’autophagie par la 3-MA a affaibli les effets protecteurs de la BBR contre les lésions des fibroblastes tendineux induites par HG. Dans l’ensemble, les résultats actuels démontrent que la BBR aide à soulager les lésions du tendon diabétique en activant l’autophagie des fibroblastes du tendon.

Introduction

Le diabète (diabète sucré, DM) est un trouble métabolique systémique caractérisé par une hyperglycémie¹. À l’heure actuelle, le diabète est devenu l’une des principales maladies menaçant la santé humaine et l’espérance de vie². Plus de 90 % des cas sont des diabètes de type 2, une maladie métabolique caractérisée par une inflammation chronique³, une résistance à l’insuline⁴ et des lésions des cellules β des îlots^{pancréatiques 5}, et la prévalence augmente chaque année dans le monde.

Le diabète de type 2 entraîne une série de complications graves, qui ont de graves effets sur le système cardiovasculaire⁶, l’œil⁷, les reins 7 et les nerfs⁸, exposant les patients diabétiques à de multiples handicaps et même à des risques pour la santé potentiellement mortels. Il y a eu peu d’études sur le système musculo-squelettique, en particulier sur les modifications pathologiques des tendons diabétiques. Ces dernières années, l’incidence de la tendinopathie chronique a considérablement augmenté. Les tendons peuvent réguler dynamiquement leur capacité à stocker et à fournir de l’énergie ^9,10. Dans les tissus tendineux, les fibroblastes tendineux jouent un rôle important dans la modulation de l’adaptation tendineuse et la réparation tendineuse après une blessure ^9,11. À l’heure actuelle, la fonction des fibroblastes tendineux sur les lésions tendineuses reste incertaine.

En tant qu’alcaloïde isoquinoléine, le BBR exerce des effets pharmacologiques dans une variété de processus physiologiques, notamment l’abaissement de la glycémie, l’abaissement des lipides, la réduction du cholestérol, les effets anti-inflammatoires, les effets antibactériens, l’élimination des espèces réactives de l’oxygène et l’antagonisme du dysfonctionnement du système nerveux^12,13. La BBR peut augmenter l’absorption et l’utilisation du glucose dans le tissu adipeux et les cellules musculaires squelettiques, réguler à la hausse l’expression du récepteur de l’insuline dans les cellules hépatiques et musculaires squelettiques, augmenter l’expression du récepteur LDL dans le foie et réduire les niveaux de cholestérol et de sucre dans le plasma¹⁴. Bien que la BBR possède des activités pharmacologiques précieuses dans le soulagement de plusieurs complications du DM 15,16,17, le rôle de la BBR dans la régulation des lésions du tendon diabétique reste mal compris.

L’autophagie doit se produire au niveau de base dans la plupart des tissus pour retirer les organites endommagés et fournir des métabolites pour maintenir l’homéostasie métabolique^18,19. L’autophagie joue un rôle crucial dans la santé des cellules β, et l’autophagie altérée est corrélée au dysfonctionnement des cellules β et à la progression du diabète^20,21. Des études émergentes ont démontré que l’activation de l’autophagie induite par BBR contribue à améliorer la néphropathie diabétique²². Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons exploré si le BBR est utile pour soulager les lésions du tendon diabétique en régulant l’autophagie. Les résultats actuels ont démontré que BBR réduisait les lésions des fibroblastes tendineux induites par HG et la réponse inflammatoire. HG a diminué l’activation de l’autophagie des fibroblastes tendineux, tandis que le traitement BBR a restauré l’activation de l’autophagie et a entraîné une augmentation ultérieure de la viabilité des fibroblastes tendineux et une réduction des cytokines pro-inflammatoires.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’hôpital Yueyang de médecine traditionnelle chinoise et occidentale intégrée de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital Yueyang de médecine traditionnelle chinoise et occidentale intégrée de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (numéro IACUC : YYLAC-2019-1). Des rats Wistar mâles (200-240 g, âgés de 8 semaines) ont été achetés au Shanghai SLAC Laboratory Animal Center.

1. Modèle de rat de T2DM

1. Maintenir les rats Wistar mâles (200-240 g, 8 semaines) dans un environnement climatisé avec un cycle lumière/obscurité de 12 h (20 ± 2 °C et 50 %-60 % d’humidité relative). Fournir de la nourriture et de l’eau à volonté pendant la période expérimentale.
2. Faites des efforts pour minimiser la souffrance animale, y compris une manipulation douce, le nettoyage quotidien des cages et la surveillance.
3. Répartissez au hasard les rats en 3 groupes : le groupe témoin (n = 5), le groupe modèle DM (n = 5) et le groupe modèle diabétique traité avec BBR (n = 5).
4. Etablir le modèle DM du rat selon une description précédente²³.
   1. Administrer aux rats une seule injection intraveineuse de streptozotocine (STZ) dissoute dans un tampon de citrate de sodium fraîchement préparé (p/v : 2 %) à une dose de 30 mg/kg. Injecter par voie intrapéritonéale dans le groupe témoin un volume égal de tampon de citrate de sodium sans STZ.
   2. Évaluez la glycémie à l’aide d’un analyseur de gaz sanguins. Utiliser les rats ayant la glycémie indiquée (≥16,7 mmol/L, en continu pendant 10 jours) pour le modèle de DT2.
   3. Après 1 semaine, répartissez au hasard les rats DT2 en deux groupes (n = 5 de chaque groupe) : rats non traités ou rats ayant reçu 200 mg/kg/jour de BBR par gavage pendant 4 semaines.

2. Fibroblastes tendineux primaires

1. Sacrifier les rats sous anesthésie par injection intrapéritonéale de barbiturique (40 mg/kg) et obtenir le tendon d’Achille comme indiqué précédemment²⁴.
2. Isoler les fibroblastes tendineux des tissus tendineux²⁵.
   1. Déchiquetez manuellement les tissus tendineux et placez-les dans du DMEM contenant 0,2 % de collagénase de type II. Agiter vigoureusement pendant 3 h à 37 °C.
   2. Retirer le milieu par centrifugation et ajouter du DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine au tissu digéré.
   3. Filtrer les tissus tendineux à l’aide d’une passoire de 100 μm, verser la solution filtrée dans des plaques à 6 puits et maintenir les fibroblastes tendineux dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂.

3. Essai de viabilité cellulaire

REMARQUE : Le test du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire conformément aux instructions du fabricant.

1. Après la trypsinisation, plaquez les fibroblastes tendineux dans des plaques de 96 puits (4 x 10³ cellules/puits), puis traitez-les avec différentes doses de glucose (0, 5, 10, 20, 30 et 50 mM) en présence ou en l’absence de BBR (0, 5, 10, 20, 40 et 80 μM) pendant 48 h.
   REMARQUE : Le glucose et le BBR ont été dissous dans le DMEM.
2. Ajouter une solution de CCK-8 (10 μL) dans chaque puits et incuber les cellules pendant 2 h supplémentaires à 37 °C.
3. Par la suite, mesurez l’absorbance de chaque puits à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 450 nm.

4. Analyse de l’apoptose cellulaire

REMARQUE : Un test de cytométrie en flux à l’iodure de propidium (PI) et à l’annexine V-FITC a été utilisé pour analyser le taux d’apoptose des fibroblastes tendineux.

1. Ensemencez les fibroblastes tendineux (5 x 10⁵ cellules) dans des plaques de 6 puits dans du DMEM pendant 24 h.
2. Aspirez et jetez le DMEM de chaque puits. Traiter les cellules avec du DMEM frais contenant HG (30 mM) en présence ou en absence de BBR (20 μM) pendant 24 h.
3. Détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine dans 1 fois PBS, récoltez les cellules avec du PBS et centrifugez-les à 2000 x g pendant 5 min.
4. Remettre les cellules en suspension dans un tampon de liaison (tableau des matériaux) et les colorer avec 10 μL d’annexine V conjuguée à la FITC et 5 μL de PI dans l’obscurité pendant 15 min à température ambiante (RT).
5. Ensuite, analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.

5. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR)

1. Récoltez les fibroblastes tendineux et homogénéisez-les à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN (Table des Matériaux) selon les recommandations du fabricant.
2. Effectuez une PCR transcriptionnelle inverse avec la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney et des amorces Oligo (dT) (Table des matériaux).
3. Effectuez une qRT-PCR à l’aide de SYBR green qPCR Mix sur le système de PCR en temps réel. Les conditions de cycle sont la dénaturation à 95 °C pendant 10 min et 45 cycles à 95 °C pendant 20 s, 55 °C pendant 20 s et 72 °C pendant 30 s.
   REMARQUE : Pour plus de détails sur les amorces pour IL-1β, IL-6 et IL-10, reportez-vous au tableau des matériaux. β-actine a été utilisée comme gène de référence.
4. Calculer le niveau d’expression relatif à l’aide de la formule ^2-ΔΔCT , comme décrit précédemment²⁶ .

6. Analyse par transfert Western

1. Après un traitement par HG (30 mM) en présence ou en absence de BBR (20 μM) pendant 24 h, lyser les fibroblastes tendineux avec un tampon RIPA (Table of Materials), et quantifier la concentration totale en protéines à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique.
2. Séparer des quantités équivalentes de protéines (50 μg) de chaque échantillon par 10 % de SDS-PAGE à RT, puis transférer sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à 4 °C pendant 2 h.
3. Bloquez les membranes dans du lait écrémé en poudre à 5 % dans du TBST, puis incubez pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-LC3B (1:1500), anti-p62 (1:2000) et anticorps anti-β-actine (1:3500).
4. Après avoir été lavées avec du TBST, incuber les membranes avec des anticorps secondaires conjugués à H&L HRP de chèvre (1:5000) à RT pendant 1 h.
5. Utilisez un kit de chimiluminescence ECL pour visualiser les taches spécifiques et quantifier les autoradiogrammes par densitométrie.

7. Analyse immunohistochimique (IHC)

1. Coupez les tissus tendineux du pied incrustés de paraffine en sections de 6 μm d’épaisseur.
2. Après avoir fixé les sections dans du formol à 4 %, incubez les sections avec l’anticorps anti-LC3 (1:200) pendant la nuit à 4 °C.
3. Après avoir lavé trois fois avec 10 mM de PBS (pH 7,4 avec Tween 20), incuber toutes les sections avec un anticorps secondaire conjugué à HRP de chèvre (1:1000) pendant 1 h à 37 °C et colorer avec du DAB et de l’hématoxyline pendant 60 min à RT.
4. Imagez les lames colorées à un grossissement de 20x à l’aide d’un microscope inversé.

8. Dosage TUNEL

REMARQUE : L’apoptose cellulaire dans le tissu tendineux a été analysée à l’aide d’un kit de test TUNEL conformément aux instructions du fabricant.

1. Coupez les tissus tendineux du pied incrustés de paraffine en sections de 6 μm d’épaisseur.
2. Déparaffiner les sections dans du xylène et les réhydrater dans une série graduée d’éthanol.
3. Après immersion avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % à RT, incuber les sections avec le mélange réactionnel TUNEL pendant 1 h à 37 °C.
4. Contre-colorez les noyaux à l’aide de DAPI. Observez les cellules colorées au microscope à fluorescence (20x) et déterminez le pourcentage de cellules positives à TUNEL.

9. Analyse statistique

1. Utiliser des applications logicielles appropriées pour effectuer des analyses statistiques
   REMARQUE : Ici, les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’écart-type (ET) de trois expériences indépendantes. Les analyses statistiques ont été effectuées avec SPSS 23.0. Le test t de Student a été effectué pour comparer les différences entre les groupes, et l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été effectuée pour les analyses de plusieurs groupes. La différence était statistiquement significative lorsque p < 0,05.

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Résultats

Pour évaluer le rôle pharmacologique de la BBR dans le soulagement des lésions du tendon diabétique, l’apoptose cellulaire et l’activation de l’autophagie dans les tissus du tendon du pied de rats DM ont été évaluées en présence ou en l’absence de BBR. La figure 1A a montré que le niveau de protéine LC3 (un marqueur de l’autophagie) était diminué dans les tissus des tendons des rats DM par rapport aux rats témoins, tandis que le trait...

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Discussion

La lésion tendineuse est une complication fréquente chez les patients atteints de DM²⁷. Les fibroblastes tendineux jouent un rôle important dans le processus de cicatrisation des plaies^28,29. L’étude actuelle a vérifié que i) BBR a augmenté l’activation de l’autophagie et diminué l’apoptose cellulaire dans les tissus tendineux des rats DM, ii) BBR a diminué l’apoptose induite par HG des ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	516104-M
anti-LC3B	Abcam, CA, USA	ab48394
anti-p62	Abcam	ab91526
anti-β-actin antibody	Abcam	ab8227
Binding buffer	BD Biosciences	556454
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11965092
EVOS XL Core microscope	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodies	Abcam	ab205718
Leukemiavirus reverse transcriptase	Clontech	639574
Male Wistar rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd		200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 Primer	TaKaRa	3806
Primers	Shanghai Sangon Biotech		Synthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	20-188
RNA extraction kit (Trizol)	TaKaRa	9108Q
StepOne Realtime PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376357
TUNEL assay kit	Thermo Fisher Scientific	C10245