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En este artículo

  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La berberina (BBR) es un alcaloide isoquinolina aislado de Coptis chinensis y posee valiosas actividades farmacológicas, que incluyen actividades antiinflamatorias, antitumorales y el alivio de varias complicaciones de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Sin embargo, el papel de la BBR en la regulación de la lesión del tendón diabético sigue siendo poco conocido. En este estudio, se construyó un modelo de rata de T2DM y se evaluó la apoptosis y la autofagia celular en los tejidos tendinosos después del tratamiento con BBR mediante el ensayo de marcaje de dUTP mediado por TdT (TUNEL) y análisis inmunohistoquímico. Los fibroblastos tendinosos se obtuvieron del tendón de Aquiles de la rata, y se evaluó el papel de la BBR en la regulación de la apoptosis celular, la producción de citocinas inflamatorias y la activación de la autofagia mediante citometría de flujo, PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y análisis de Western blot. Demostramos que el tratamiento con BBR aumentó significativamente la activación de la autofagia y disminuyó la apoptosis celular en los tejidos tendinosos de ratas con DM2. En los fibroblastos tendinosos, BBR reprimió la apoptosis celular inducida por la glucosa alta (HG) y la producción de citocinas proinflamatorias. El tratamiento con HG resultó en una disminución de la activación de la autofagia en los fibroblastos tendinosos, mientras que la BBR restauró la activación de la autofagia. Más importante aún, la inhibición farmacológica de la autofagia por 3-MA debilitó los efectos protectores de BBR contra la lesión de fibroblastos tendinosos inducida por HG. En conjunto, los resultados actuales demuestran que la BBR ayuda a aliviar la lesión del tendón diabético al activar la autofagia de los fibroblastos del tendón.

Introducción

La diabetes (diabetes mellitus, DM) es un trastorno metabólico sistémico caracterizado por hiperglucemia1. En la actualidad, la diabetes se ha convertido en una de las principales enfermedades que amenazan la salud humana y la esperanza de vida2. Más del 90% de los casos son diabetes tipo 2, una enfermedad metabólica caracterizada por inflamación crónica3, resistencia a la insulina4 y daño a las células de los β de los islotes5, y la prevalencia aumenta cada año en todo el mundo.

La diabetes tipo 2 conlleva una serie de complicaciones graves, que tienen efectos graves en el sistema cardiovascular6, el ojo7, el riñón7 y los nervios8, lo que pone a los pacientes diabéticos en riesgo de múltiples discapacidades e incluso riesgos de salud potencialmente mortales. Ha habido pocos estudios sobre el sistema musculoesquelético, especialmente sobre los cambios patológicos en los tendones diabéticos. En los últimos años, la incidencia de la tendinopatía crónica ha aumentado significativamente. Los tendones pueden regular dinámicamente su capacidad para almacenar y suministrar energía 9,10. En los tejidos tendinosos, los fibroblastos tendinosos juegan un papel importante en la modulación de la adaptación del tendón y la reparación del tendón después de una lesión 9,11. En la actualidad, la función de los fibroblastos tendinosos en la lesión tendinosa sigue sin estar clara.

Como alcaloide de isoquinolina, BBR ejerce efectos farmacológicos en una variedad de procesos fisiológicos, incluida la disminución de la glucosa en sangre, la disminución de lípidos, la disminución del colesterol, efectos antiinflamatorios, efectos antibacterianos, eliminación de especies reactivas de oxígeno y antagonizante disfunción del sistema nervioso12,13. BBR puede aumentar la absorción y utilización de glucosa en el tejido adiposo y las células del músculo esquelético, regular al alza la expresión del receptor de insulina en las células del hígado y del músculo esquelético, aumentar la expresión del receptor de LDL en el hígado y reducir los niveles de colesterol y azúcar en el plasma14. A pesar de que la BBR posee actividades farmacológicas valiosas en el alivio de varias complicaciones de la DM 15,16,17, el papel de la BBR en la regulación de la lesión del tendón diabético sigue siendo poco conocido.

La autofagia debe ocurrir a nivel basal en la mayoría de los tejidos para extraer los orgánulos dañados y proporcionar metabolitos para mantener la homeostasis metabólica18,19. La autofagia desempeña un papel crucial en la salud de las células β, y el deterioro de la autofagia se correlaciona con la disfunción de las células β y la progresión de la diabetes20,21. Estudios emergentes han demostrado que la activación de la autofagia inducida por BBR contribuye a mejorar la nefropatía diabética22. Con base en los hallazgos anteriores, exploramos si la BBR es útil para aliviar la lesión del tendón diabético a través de la regulación de la autofagia. Los resultados actuales demostraron que BBR redujo la lesión de los fibroblastos tendinosos inducida por HG y la respuesta inflamatoria. La HG disminuyó la activación de la autofagia de los fibroblastos tendinosos, mientras que el tratamiento con BBR restauró la activación de la autofagia y dio lugar a un aumento posterior de la viabilidad de los fibroblastos tendinosos y a la reducción de las citocinas proinflamatorias.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación del Hospital Yueyang de Medicina Tradicional Integrada China y Occidental de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Yueyang de Medicina Tradicional Integrada China y Occidental, Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (número IACUC: YYLAC-2019-1). Se compraron ratas Wistar macho (200-240 g, 8 semanas de edad) en el Centro de Animales de Laboratorio SLAC de Shanghai.

1. Modelo de rata de T2DM

  1. Mantener ratas Wistar macho (200-240 g, 8 semanas de edad) en un ambiente climatizado con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (20 ± 2 °C y 50%-60% de humedad relativa). Proporcionar alimento y agua ad libitum durante el período experimental.
  2. Esfuércese por minimizar el sufrimiento de los animales, incluido el manejo suave, la limpieza diaria de la jaula y el monitoreo.
  3. Asigne aleatoriamente las ratas a 3 grupos: el grupo control (n = 5), el grupo modelo DM (n = 5) y el grupo diabético tratado con BBR (n = 5).
  4. Establecer el modelo de DM de rata de acuerdo con una descripción previa23.
    1. Administrar a las ratas una única inyección intravenosa de estreptozotocina (STZ) disuelta en tampón de citrato sódico recién preparado (p/v: 2%) a una dosis de 30 mg/kg. Inyectar al grupo de control por vía intraperitoneal un volumen igual de tampón de citrato sódico sin STZ.
    2. Evalúe la glucosa en sangre con un analizador de gases en sangre. Utilizar las ratas con el nivel de glucosa en sangre indicado (≥16,7 mmol/L, de forma continua durante 10 días) para el modelo T2DM.
    3. Después de 1 semana, divida aleatoriamente las ratas T2DM en dos grupos (n = 5 de cada grupo): ratas no tratadas o ratas a las que se les administró 200 mg/kg/día de BBR por sonda nasogástrica durante 4 semanas.

2. Fibroblastos tendinosos primarios

  1. Sacrificar las ratas bajo anestesia mediante inyección intraperitoneal de barbitúrico (40 mg/kg) y obtener el tendón de Aquiles como se informó previamente24.
  2. Aislar los fibroblastos tendinosos de los tejidos tendinosos25.
    1. Triturar los tejidos tendinosos manualmente y colocarlos en DMEM que contenga un 0,2% de colagenasa tipo II. Agitar enérgicamente durante 3 h a 37 °C.
    2. Retire el medio por centrifugación y agregue DMEM que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina al tejido digerido.
    3. Filtrar los tejidos tendinosos con un colador de 100 μm, verter la solución filtrada en placas de 6 pocillos y mantener los fibroblastos tendinosos en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.

3. Ensayo de viabilidad celular

NOTA: Se utilizó el ensayo del kit de recuento de células 8 (CCK-8) para medir la viabilidad de las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

  1. Después de la tripsinización, coloque los fibroblastos tendinosos en placas de 96 pocillos (4 x 103 células/pocillo) y luego trátelos con diferentes dosis de glucosa (0, 5, 10, 20, 30 y 50 mM) en presencia o ausencia de BBR (0, 5, 10, 20, 40 y 80 μM) durante 48 h.
    NOTA: La glucosa y el BBR se disolvieron en DMEM.
  2. Agregue la solución de CCK-8 (10 μL) a cada pocillo e incube las células durante otras 2 h a 37 ° C.
  3. Posteriormente, mida la absorbancia de cada pocillo con un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm.

4. Análisis de apoptosis celular

NOTA: Se utilizó un ensayo de citometría de flujo V-FITC con yoduro de propidio (PI) y anexina para analizar la tasa de apoptosis de los fibroblastos tendinosos.

  1. Siembrar los fibroblastos tendinosos (5 x 105 células) en placas de 6 pocillos en DMEM durante 24 h.
  2. Aspire y deseche el DMEM de cada pocillo. Tratar las células con DMEM fresco que contenga HG (30 mM) en presencia o ausencia de BBR (20 μM) durante 24 h.
  3. Separe las células con tripsina al 0,25% en 1x PBS, recoja las células con PBS y centrifugue a 2000 x g durante 5 min.
  4. Vuelva a suspender las células en un tampón aglutinante (Tabla de materiales) y tiña con 10 μL de anexina V conjugada con FITC y 5 μL de PI en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
  5. A continuación, analice las células con un citómetro de flujo.

5. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

  1. Recolectar los fibroblastos tendinosos y homogeneizar mediante un kit de extracción de ARN (Tabla de Materiales) según las recomendaciones del fabricante.
  2. Realice una PCR con transcripción inversa del virus de la leucemia murina de Moloney con cebadores de Oligo (dT) (Tabla de materiales).
  3. Lleve a cabo qRT-PCR utilizando SYBR green qPCR Mix en el sistema de PCR en tiempo real. Las condiciones de ciclo son desnaturalización a 95 °C durante 10 min y 45 ciclos a 95 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s y 72 °C durante 30 s.
    NOTA: Para obtener detalles de los cebadores para IL-1β, IL-6 e IL-10, consulte la Tabla de materiales. Se utilizó β-actina como gen de referencia.
  4. Calcule el nivel de expresión relativa utilizando la fórmula 2-ΔΔCT , como se describió anteriormente26 .

6. Análisis de Western blot

  1. Después del tratamiento con HG (30 mM) en presencia o ausencia de BBR (20 μM) durante 24 h, lisar los fibroblastos tendinosos con tampón RIPA (Tabla de Materiales) y cuantificar la concentración total de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinconínico.
  2. Separe las cantidades equivalentes de proteínas (50 μg) de cada muestra en un 10% de SDS-PAGE a RT y luego transfiéralas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) a 4 °C durante 2 h.
  3. Bloquear las membranas en leche en polvo descremada al 5% en TBST y luego incubar durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-LC3B (1:1500), anti-p62 (1:2000) y anti-β-actina (1:3500).
  4. Después de lavar con TBST, incubar las membranas con anticuerpos secundarios conjugados H&L HRP anti-conejo de cabra (1:5000) a RT durante 1 h.
  5. Utilice un kit de quimioluminiscencia ECL para visualizar las transferencias específicas y cuantificar los autorradiogramas mediante densitometría.

7. Análisis inmunohistoquímico (IHQ)

  1. Corta los tejidos del tendón del pie incrustados en parafina en secciones de 6 μm de grosor.
  2. Después de fijar las secciones en formol al 4%, incubar las secciones con el anticuerpo anti-LC3 (1:200) durante la noche a 4 °C.
  3. Después de lavar tres veces con 10 mM de PBS (pH 7,4 con Tween 20), incubar todas las secciones con anticuerpo secundario conjugado HRP anti-conejo de cabra (1:1000) durante 1 h a 37 °C y teñir con DAB y hematoxilina durante 60 min a RT.
  4. Tome imágenes de los portaobjetos teñidos con un aumento de 20x utilizando un microscopio invertido.

8. Ensayo TUNEL:

NOTA: La apoptosis celular en el tejido tendinoso se analizó utilizando un kit de ensayo TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

  1. Corta los tejidos del tendón del pie incrustados en parafina en secciones de 6 μm de grosor.
  2. Desparafinar las secciones en xileno y rehidratarlas en una serie graduada de etanol.
  3. Después de sumergir con peróxido de hidrógeno al 3% en RT, incubar las secciones con la mezcla de reacción TUNEL durante 1 h a 37 °C.
  4. Contratinción de los núcleos mediante DAPI. Observe las células teñidas bajo un microscopio de fluorescencia (20x) y determine el porcentaje de células TUNEL-positivas.

9. Análisis estadístico

  1. Utilizar aplicaciones de software adecuadas para realizar análisis estadísticos
    NOTA: Aquí, los datos se presentan como la media ± la desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 23.0. Se realizó la prueba t de Student para comparar las diferencias entre los grupos, y se realizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para los análisis de múltiples grupos. La diferencia fue estadísticamente significativa cuando p < 0,05.

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Resultados

Para evaluar el papel farmacológico de la BBR en el alivio de la lesión del tendón diabético, se evaluó la apoptosis celular y la activación de la autofagia en los tejidos del tendón del pie de ratas DM en presencia o ausencia de BBR. La Figura 1A mostró que el nivel de proteína de LC3 (un marcador de autofagia) disminuyó en los tejidos tendinosos de las ratas DM en comparación con las ratas control, mientras que el tratamiento con BBR restauró s...

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Discusión

La lesión tendinosa es una complicación frecuente en los pacientes con DM27. Los fibroblastos tendinosos juegan un papel importante en el proceso de cicatrización de heridas28,29. El estudio actual verificó que i) BBR aumentó la activación de la autofagia y disminuyó la apoptosis celular en tejidos tendinosos de ratas DM, ii) BBR disminuyó la apoptosis inducida por HG de fibroblastos tendinosos, ii...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar relevantes para el contenido de este artículo.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Proyecto del Plan de Acción de tres años de Shanghái para acelerar aún más el desarrollo de la medicina tradicional china [ZY (2018-2020)-CCCX-4005]

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA516104-M
anti-LC3BAbcam, CA, USAab48394
anti-p62Abcamab91526
anti-β-actin antibodyAbcamab8227
Binding bufferBD Biosciences556454
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA11965092
EVOS XL Core microscopeThermo Fisher ScientificAMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodiesAbcamab205718
Leukemiavirus reverse transcriptaseClontech639574
Male Wistar ratsShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 PrimerTaKaRa3806
PrimersShanghai Sangon BiotechSynthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis BufferThermo Fisher Scientific20-188
RNA extraction kit (Trizol)TaKaRa9108Q
StepOne Realtime PCR SystemThermo Fisher Scientific4376357
TUNEL assay kitThermo Fisher ScientificC10245

Referencias

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