Alívio da lesão do tendão diabético por meio da ativação da autofagia de fibroblastos do tendão sob tratamento com berberina

Resumo

A berberina (BBR) é um alcalóide de isoquinolina isolado de Coptis chinensis e possui atividades farmacológicas valiosas, incluindo anti-inflamatórias, antitumorais e alívio de várias complicações do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). No entanto, o papel do BBR na regulação da lesão do tendão diabético permanece pouco compreendido. Neste estudo, um modelo de DM2 em ratos foi construído, e a apoptose celular e a autofagia foram avaliadas em tecidos tendinosos após o tratamento com BBR por meio de ensaio de marcação nick-end (TUNEL) dUTP mediada por TdT e análise imuno-histoquímica. Os fibroblastos tendinosos foram obtidos do tendão de Aquiles de ratos, e o papel do BBR na regulação da apoptose celular, a produção de citocinas inflamatórias e a ativação da autofagia foram avaliados por citometria de fluxo, PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e análise de western blot. Demonstramos que o tratamento com BBR aumentou significativamente a ativação da autofagia e diminuiu a apoptose celular nos tecidos tendinosos de ratos DM2. Nos fibroblastos tendinosos, o BBR reprimiu a apoptose celular induzida por glicose alta (HG) e a produção de citocinas pró-inflamatórias. O tratamento com HG resultou em uma diminuição da ativação da autofagia nos fibroblastos tendinosos, enquanto o BBR restaurou a ativação da autofagia. Mais importante, a inibição farmacológica da autofagia por 3-MA enfraqueceu os efeitos protetores do BBR contra lesões de fibroblastos tendinosos induzidos por HG. Em conjunto, os resultados atuais demonstram que o BBR ajuda a aliviar a lesão do tendão diabético, ativando a autofagia dos fibroblastos do tendão.

Introdução

O diabetes (diabetes mellitus, DM) é um distúrbio metabólico sistêmico caracterizado por hiperglicemia¹. Atualmente, o diabetes tornou-se uma das principais doenças que ameaçam a saúde humana e a expectativa de vida². Mais de 90% dos casos são diabetes tipo 2, uma doença metabólica caracterizada por inflamação crônica³, resistência à insulina⁴ e danos às células β ilhotas⁵, e a prevalência está aumentando a cada ano em todo o mundo.

O diabetes tipo 2 traz uma série de complicações graves, que têm sérios efeitos^{no sistema} cardiovascular6, no^olho7, no^rim7 e nos nervos8, colocando os pacientes diabéticos em risco de múltiplas deficiências e até mesmo riscos à saúde com risco de vida. Existem poucos estudos sobre o sistema musculoesquelético, especialmente sobre as alterações patológicas nos tendões diabéticos. Nos últimos anos, a incidência de tendinopatia crônica aumentou significativamente. Os tendões podem regular dinamicamente sua capacidade de armazenar e fornecer energia ^9,10. Nos tecidos tendinosos, os fibroblastos tendinosos desempenham um papel importante na modulação da adaptação tendínea e no reparo tendíneo após a lesão ^9,11. Atualmente, a função dos fibroblastos tendinosos na lesão do tendão permanece obscura.

Como um alcalóide isoquinolina, o BBR exerce efeitos farmacológicos em uma variedade de processos fisiológicos, incluindo redução da glicose no sangue, redução de lipídios, redução do colesterol, efeitos anti-inflamatórios, efeitos antibacterianos, remoção de espécies reativas de oxigênio e antagonização da disfunção do sistema nervoso^12,13. O BBR pode aumentar a captação e utilização de glicose no tecido adiposo e nas células musculares esqueléticas, regular positivamente a expressão do receptor de insulina no fígado e nas células musculares esqueléticas, aumentar a expressão do receptor de LDL no fígado e reduzir os níveis de colesterol e açúcar no plasma¹⁴. Embora a BBR possua atividades farmacológicas valiosas no alívio de várias complicações do DM 15,16,17, o papel da BBR na regulação da lesão do tendão diabético permanece pouco compreendido.

A autofagia deve ocorrer no nível basal na maioria dos tecidos para retirar organelas danificadas e fornecer metabólitos para manter a homeostase metabólica^18,19. A autofagia atua como um papel crucial na saúde das células β, e a autofagia prejudicada está correlacionada com a disfunção das células β e a progressão do diabetes^20,21. Novos estudos demonstraram que a ativação da autofagia induzida pela BBR contribui para melhorar a nefropatia diabética²². Com base nas descobertas acima, exploramos se o BBR é útil no alívio da lesão do tendão diabético por meio da regulação da autofagia. Os resultados atuais demonstraram que o BBR reduziu a lesão de fibroblastos tendinosos induzida por HG e a resposta inflamatória. O HG diminuiu a ativação da autofagia dos fibroblastos tendinosos, enquanto o tratamento com BBR restaurou a ativação da autofagia e resultou em um aumento subsequente da viabilidade dos fibroblastos tendinosos e redução das citocinas pró-inflamatórias.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Yueyang de Medicina Tradicional Chinesa e Ocidental Integrada, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Yueyang de Medicina Tradicional Chinesa e Ocidental Integrada, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (número IACUC: YYLAC-2019-1). Ratos Wistar machos (200-240 g, 8 semanas de idade) foram comprados no Shanghai SLAC Laboratory Animal Center.

1. Modelo de rato de DM2

1. Manter ratos Wistar machos (200-240 g, 8 semanas de idade) em um ambiente climatizado com um ciclo claro/escuro de 12 h (20 ± 2 °C e 50%-60% de umidade relativa). Fornecer comida e água ad libitum durante o período experimental.
2. Faça esforços para minimizar o sofrimento dos animais, incluindo manuseio suave, limpeza diária da gaiola e monitoramento.
3. Atribua aleatoriamente os ratos a 3 grupos: o grupo controle (n = 5), o grupo modelo DM (n = 5) e o modelo diabético tratado com o grupo BBR (n = 5).
4. Estabelecer o modelo de MS de rato de acordo com uma descrição prévia²³.
   1. Administrar os ratos com uma única injeção intravenosa de estreptozotocina (STZ) dissolvida em tampão citrato de sódio recém-preparado (p / v: 2%) na dose de 30 mg / kg. Injete o grupo controle por via intraperitoneal com um volume igual de tampão citrato de citrato de sódio sem STZ.
   2. Avalie a glicose no sangue usando um analisador de gases sanguíneos. Use os ratos com o nível de glicose no sangue indicado (≥16,7 mmol / L, continuamente por 10 dias) para o modelo DM2.
   3. Após 1 semana, dividir aleatoriamente os ratos DM2 em dois grupos (n = 5 de cada grupo): ratos não tratados ou ratos que receberam 200 mg/kg/dia de BBR por gavagem por 4 semanas.

2. Fibroblastos primários do tendão

1. Sacrificar os ratos sob anestesia por meio de injeção intraperitoneal de barbitúrico (40 mg/kg) e obter o tendão de Aquiles conforme relatado anteriormente²⁴.
2. Isole os fibroblastos tendinosos dos tecidos tendinosos²⁵.
   1. Triture os tecidos tendinosos manualmente e coloque-os em DMEM contendo 0,2% de colagenase tipo II. Agitar vigorosamente durante 3 h a 37 °C.
   2. Remova o meio por centrifugação e adicione DMEM contendo 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina ao tecido digerido.
   3. Filtre os tecidos tendinosos com um filtro de 100 μm, despeje a solução filtrada em placas de 6 poços e mantenha os fibroblastos do tendão em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO₂.

3. Ensaio de viabilidade celular

NOTA: O ensaio do kit de contagem de células-8 (CCK-8) foi usado para medir a viabilidade celular de acordo com as instruções do fabricante.

1. Após a tripsinização, plaquear os fibroblastos tendinosos em placas de 96 poços (4 x 10³ células/poço) e, em seguida, tratá-los com diferentes doses de glicose (0, 5, 10, 20, 30 e 50 mM) na presença ou ausência de BBR (0, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) por 48 h.
   NOTA: A glicose e o BBR foram dissolvidos em DMEM.
2. Adicione a solução de CCK-8 (10 μL) a cada poço e incube as células por mais 2 h a 37 ° C.
3. Em seguida, medir a absorvância de cada alvéolo com um leitor de microplacas no comprimento de onda de 450 nm.

4. Análise de apoptose celular

NOTA: Um ensaio de citometria de fluxo de iodeto de propídio (PI) e anexina V-FITC foi usado para analisar a taxa de apoptose dos fibroblastos tendinosos.

1. Semeie os fibroblastos do tendão (5 x 10⁵ células) em placas de 6 poços em DMEM por 24 h.
2. Aspire e descarte o DMEM de cada poço. Trate as células com DMEM fresco contendo HG (30 mM) na presença ou ausência de BBR (20 μM) por 24 h.
3. Separe as células com 0,25% de tripsina em 1x PBS, colha as células com PBS e centrifugue a 2000 x g por 5 min.
4. Ressuspenda as células em tampão de ligação (Tabela de Materiais) e cove com 10 μL de anexina V conjugada com FITC e 5 μL de PI no escuro por 15 min em temperatura ambiente (RT).
5. Em seguida, analise as células por um citômetro de fluxo.

5. Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

1. Colha os fibroblastos do tendão e homogeneize usando um kit de extração de RNA (Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações do fabricante.
2. Realize PCR transcricional reversa com transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney e primers Oligo (dT) (Tabela de Materiais).
3. Realize qRT-PCR usando SYBR green qPCR Mix no sistema de PCR em tempo real. As condições do ciclo são desnaturação a 95 °C por 10 min e 45 ciclos a 95 °C por 20 s, 55 °C por 20 s e 72 °C por 30 s.
   NOTA: Para obter detalhes sobre os primers para IL-1β, IL-6 e IL-10, consulte a Tabela de Materiais. β-actina foi usada como gene de referência.
4. Calcule o nível de expressão relativa usando a fórmula ^2-ΔΔCT , conforme descrito anteriormente²⁶ .

6. Análise de Western blot

1. Após o tratamento com HG (30 mM) na presença ou ausência de BBR (20 μM) por 24 h, lisar os fibroblastos tendinosos com tampão RIPA (Tabela de Materiais) e quantificar a concentração de proteína total usando o ensaio de ácido bicinconínico.
2. Separe as quantidades equivalentes de proteínas (50 μg) de cada amostra em 10% de SDS-PAGE em RT e, em seguida, transfira para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) a 4 °C por 2 h.
3. Bloqueie as membranas em leite em pó desnatado a 5% em TBST e, em seguida, incube durante a noite a 4 ° C com os seguintes anticorpos primários: anti-LC3B (1: 1500), anti-p62 (1: 2000) e anti-β-actina (1: 3500).
4. Depois de ser lavado com TBST, incubar as membranas com anticorpos secundários conjugados com HRP de cabra anti-coelho (1:5000) em RT por 1 h.
5. Use um kit de quimioluminescência ECL para visualizar os borrões específicos e quantificar os auto-radiogramas por densitometria.

7. Análise imuno-histoquímica (IHQ)

1. Corte os tecidos do tendão do pé embebidos em parafina em seções de 6 μm de espessura.
2. Depois de fixar as seções em formalina a 4%, incubar as seções com anticorpo anti-LC3 (1:200) durante a noite a 4 ° C.
3. Depois de lavar três vezes usando PBS 10 mM (pH 7,4 com Tween 20), incubar todas as seções com anticorpo secundário conjugado com HRP de cabra anti-coelho (1:1000) por 1 h a 37 ° C e corar com DAB e hematoxilina por 60 min em RT.
4. Visualize as lâminas coradas com ampliação de 20x usando um microscópio invertido.

8. Ensaio TUNEL

NOTA: A apoptose celular no tecido tendíneo foi analisada usando um kit de ensaio TUNEL de acordo com as instruções do fabricante.

1. Corte os tecidos do tendão do pé embebidos em parafina em seções de 6 μm de espessura.
2. Desparafinizar as seções em xileno e reidratá-las em uma série graduada de etanol.
3. Após imersão com peróxido de hidrogênio a 3% em RT, incubar as seções com a mistura de reação TUNEL por 1 h a 37 °C.
4. Contra-corar os núcleos usando DAPI. Observe as células coradas em um microscópio de fluorescência (20x) e determine a porcentagem de células positivas para TUNEL.

9. Análise estatística

1. Use aplicativos de software apropriados para realizar análises estatísticas
   NOTA: Aqui, os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. As análises estatísticas foram realizadas com o SPSS 23.0. O teste t de Student foi realizado para comparar as diferenças entre os grupos, e a análise de variância (ANOVA) de uma via foi realizada para análises de múltiplos grupos. A diferença foi estatisticamente significativa quando p < 0,05.

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Resultados

Para avaliar o papel farmacológico do BBR no alívio da lesão do tendão diabético, a apoptose celular e a ativação da autofagia em tecidos tendinosos do pé de ratos com DM foram avaliadas na presença ou ausência de BBR. A Figura 1A mostrou que o nível de proteína de LC3 (um marcador de autofagia) diminuiu nos tecidos dos tendões de ratos com DM em comparação com ratos controle, enquanto o tratamento com BBR restaurou significativamente a ativa?...

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Discussão

A lesão tendínea é uma complicação comum em pacientes com^DM27. Os fibroblastos tendinosos desempenham um papel importante no processo de cicatrização de feridas^28,29. O presente estudo verificou que i) o BBR aumentou a ativação da autofagia e diminuiu a apoptose celular em tecidos tendinosos de ratos com DM, ii) o BBR diminuiu a apoptose induzida por HG de fibroblastos tendinosos, iii) o BBR alivi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	516104-M
anti-LC3B	Abcam, CA, USA	ab48394
anti-p62	Abcam	ab91526
anti-β-actin antibody	Abcam	ab8227
Binding buffer	BD Biosciences	556454
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11965092
EVOS XL Core microscope	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodies	Abcam	ab205718
Leukemiavirus reverse transcriptase	Clontech	639574
Male Wistar rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd		200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 Primer	TaKaRa	3806
Primers	Shanghai Sangon Biotech		Synthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	20-188
RNA extraction kit (Trizol)	TaKaRa	9108Q
StepOne Realtime PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376357
TUNEL assay kit	Thermo Fisher Scientific	C10245