הקלה על פגיעה בגידים סוכרתיים באמצעות הפעלת אוטופגיה של פיברובלסטים בגידים תחת טיפול בברברין

Abstract

ברברין (BBR) הוא אלקלואיד איזוקווינולין המבודד מ-Coptis chinensis ובעל פעילויות פרמקולוגיות יקרות ערך, כולל נוגדי דלקת, נוגדי גידולים והקלה על מספר סיבוכים של סוכרת מסוג 2 (T2DM). עם זאת, תפקידו של BBR בוויסות פגיעה בגידים סוכרתיים נותר לא מובן היטב. במחקר זה, נבנה מודל חולדה של T2DM, ואפופטוזיס תאים ואוטופגיה הוערכו ברקמות הגידים לאחר טיפול ב-BBR באמצעות בדיקת תיוג קצה ניק-קצה (TUNEL) בתיווך TdT, וניתוח אימונוהיסטוכימי. פיברובלסטים של גידים התקבלו מגיד אכילס של החולדה, ותפקידו של BBR בוויסות אפופטוזיס של תאים, ייצור ציטוקינים דלקתיים והפעלת אוטופגיה הוערך באמצעות ציטומטריית זרימה, PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) וניתוח כתמים מערביים. הראינו שטיפול ב-BBR הגביר משמעותית את הפעלת האוטופגיה והפחית את האפופטוזיס של התאים ברקמות הגידים של חולדות T2DM. בפיברובלסטים של גידים, BBR דיכא אפופטוזיס תאים המושרה על ידי גלוקוז גבוה (HG) וייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים. טיפול ב-HG הביא לירידה בהפעלת האוטופגיה בפיברובלסטים של הגידים, בעוד ש-BBR החזיר את הפעלת האוטופגיה. חשוב מכך, עיכוב פרמקולוגי של אוטופגיה על ידי 3-MA החליש את ההשפעות המגנות של BBR מפני פגיעה בפיברובלסטים בגידים הנגרמת על ידי HG. יחד, התוצאות הנוכחיות מראות כי BBR מסייע בהקלה על פגיעה בגידים סוכרתיים על ידי הפעלת אוטופגיה של פיברובלסטים בגידים.

Introduction

סוכרת (סוכרת) היא הפרעה מטבולית מערכתית המאופיינת בהיפרגליקמיה¹. נכון לעכשיו, סוכרת הפכה לאחת המחלות העיקריות המאיימות על בריאות האדם ותוחלת החיים². יותר מ-90% מהמקרים הם סוכרת מסוג 2, מחלה מטבולית המאופיינת בדלקת כרונית³, תנגודת לאינסולין⁴ ונזק לאי β התאים⁵, והשכיחות עולה מדי שנה ברחבי העולם.

סוכרת מסוג 2 מביאה סדרה של סיבוכים חמורים, שיש להם השפעות חמורות על מערכת הלב וכלי הדם⁶, העין⁷, הכליות⁷ והעצבים⁸, מה שמציב חולי סוכרת בסיכון לנכויות מרובות ואף לסיכונים בריאותיים מסכני חיים. היו מעט מחקרים על מערכת השלד והשרירים, במיוחד על השינויים הפתולוגיים בגידים סוכרתיים. בשנים האחרונות שכיחות גידים כרוניים עלתה משמעותית. גידים יכולים לווסת באופן דינמי את יכולתם לאגור ולספק אנרגיה ^9,10. ברקמות הגידים, פיברובלסטים של גידים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות הסתגלות הגידים ותיקון הגידים לאחר פציעה ^9,11. נכון לעכשיו, תפקידם של פיברובלסטים בגידים על פגיעה בגידים נותר לא ברור.

כאלקלואיד איזוקינולין, BBR מפעיל השפעות פרמקולוגיות במגוון תהליכים פיזיולוגיים, כולל הורדת רמת הגלוקוז בדם, הורדת שומנים, הורדת כולסטרול, השפעות אנטי דלקתיות, השפעות אנטיבקטריאליות, הסרת מיני חמצן תגובתיים ואנטגוניזציה של תפקוד לקוי של מערכת העצבים^12,13. BBR יכול להגביר את הספיגה והניצול של גלוקוז ברקמת השומן ובתאי שריר השלד, לווסת את ביטוי קולטן האינסולין בתאי הכבד ושרירי השלד, להגביר את ביטוי קולטן ה-LDL בכבד ולהפחית את רמות הכולסטרול והסוכר בפלזמה¹⁴. למרות של-BBR יש פעילויות פרמקולוגיות חשובות בהקלה על מספר סיבוכים של DM 15,16,17, תפקידו של BBR בוויסות פגיעה בגידים סוכרתיים נותר לא מובן היטב.

אוטופגיה חייבת להתרחש ברמת הבסיס ברוב הרקמות כדי למשוך אברונים פגומים ולספק מטבוליטים לשמירה על הומאוסטזיס מטבולי^18,19. אוטופגיה משמשת כתפקיד מכריע בבריאות תאי β, ואוטופגיה לקויה קשורה לתפקוד לקוי של תאי β והתקדמות סוכרת^20,21. מחקרים חדשים הראו כי הפעלה של אוטופגיה הנגרמת על ידי BBR תורמת לשיפור נפרופתיה סוכרתית²². בהתבסס על הממצאים לעיל, בדקנו האם BBR מועיל בהקלה על פגיעה בגיד סוכרתי באמצעות ויסות אוטופגיה. התוצאות הנוכחיות הראו כי BBR הפחית את הפגיעה בפיברובלסטים בגידים הנגרמת על ידי HG ואת התגובה הדלקתית. HG הפחית את הפעלת האוטופגיה של פיברובלסטים בגידים, בעוד שטיפול BBR החזיר את הפעלת האוטופגיה והביא לעלייה לאחר מכן בכדאיות הפיברובלסטים של הגידים והפחתת הציטוקינים הפרו-דלקתיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר בבית החולים יואיאנג לרפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת, אוניברסיטת שנחאי לרפואה סינית מסורתית. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים Yueyang לרפואה סינית מסורתית ומערבית משולבת, אוניברסיטת שנחאי לרפואה סינית מסורתית (מספר IACUC: YYLAC-2019-1). חולדות וויסטאר זכרות (200-240 גרם, בנות 8 שבועות) נרכשו ממרכז חיות המעבדה SLAC בשנחאי.

1. דגם חולדה של T2DM

1. שמרו על חולדות Wistar זכרות (200-240 גרם, בנות 8 שבועות) בסביבה מבוקרת אקלים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות (20 ± 2 מעלות צלזיוס ו-50%-60% לחות יחסית). לספק מזון ומים אד ליביטום במהלך תקופת הניסוי.
2. עשו מאמצים למזער את סבלם של בעלי החיים, כולל טיפול עדין, ניקוי יומיומי של כלובים וניטור.
3. הקצה את החולדות באופן אקראי ל-3 קבוצות: קבוצת הביקורת (n = 5), קבוצת מודל DM (n = 5) ומודל הסוכרת שטופל בקבוצת BBR (n = 5).
4. קבע את מודל ה-DM של החולדה על פי תיאור קודם²³.
   1. יש לתת את החולדות בזריקה תוך-ורידית אחת של סטרפטוזוטוצין (STZ) מומס במאגר נתרן ציטראט טרי (w/v: 2%) במינון של 30 מ"ג/ק"ג. הזרקו לקבוצת הביקורת תוך צפקית נפח שווה של מאגר נתרן ציטראט ציטראט ללא STZ.
   2. העריכו את רמת הגלוקוז בדם באמצעות מנתח גזי דם. השתמש בחולדות עם רמת הגלוקוז בדם המצוינת (≥16.7 ממול/ליטר, ברציפות במשך 10 ימים) עבור דגם T2DM.
   3. לאחר שבוע אחד, חלקו באופן אקראי את החולדות עם סוכרת מסוג 2 לשתי קבוצות (n = 5 מכל קבוצה): חולדות או חולדות שלא טופלו קיבלו 200 מ"ג/ק"ג/יום של BBR על ידי גבאג' במשך 4 שבועות.

2. פיברובלסטים ראשוניים של גידים

1. להקריב את החולדות בהרדמה באמצעות הזרקה תוך-צפקית של ברביטורט (40 מ"ג/ק"ג) ולהשיג את גיד אכילס כפי שדווח קודם לכן²⁴.
2. לבודד פיברובלסטים של גידים מרקמות הגידים²⁵.
   1. גרסו את רקמות הגידים באופן ידני והניחו אותן ב-DMEM המכיל 0.2% קולגנאז מסוג II. יש לערבב במרץ במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   2. הסר את המדיום על ידי צנטריפוגה והוסף DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין לרקמה המעוכלת.
   3. מסננים את רקמות הגידים על ידי מסננת של 100 מיקרומטר, יוצקים את התמיסה המסוננת לצלחות של 6 בארות, ושומרים על הפיברובלסטים של הגידים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.

3. בדיקת כדאיות תאים

הערה: בדיקת ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8) שימשה למדידת כדאיות התאים בהתאם להוראות היצרן.

1. לאחר הטריפסיניזציה, צלחת את הפיברובלסטים של הגידים בצלחות של 96 בארות (4 x 10³ תאים / באר) ולאחר מכן טפל בהם במינונים שונים של גלוקוז (0, 5, 10, 20, 30 ו- 50 מ"מ) בנוכחות או היעדר BBR (0, 5, 10, 20, 40 ו- 80 מיקרומטר) למשך 48 שעות.
   הערה: גלוקוז ו-BBR הומסו ב-DMEM.
2. הוסיפו תמיסת CCK-8 (10 מיקרוליטר) לכל באר, ודגרו על התאים למשך שעתיים נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. לאחר מכן, מדוד את הספיגה של כל באר בעזרת קורא מיקרו-פלטות באורך גל של 450 ננומטר.

4. ניתוח אפופטוזיס תאים

הערה: נעשה שימוש בבדיקת ציטומטריית זרימה של פרופידיום יודיד (PI) ונספח V-FITC כדי לנתח את קצב האפופטוזיס של פיברובלסטים בגידים.

1. זרע את הפיברובלסטים של הגידים (5 x 10⁵ תאים) בצלחות של 6 בארות ב- DMEM למשך 24 שעות.
2. שאפו והשליכו DMEM מכל באר. טפל בתאים עם DMEM טרי המכיל HG (30 מ"מ) בנוכחות או היעדר BBR (20 מיקרומטר) למשך 24 שעות.
3. נתק את התאים עם 0.25% טריפסין ב-1x PBS, קצור את התאים עם PBS וצנטריפוגה ב-2000 x גרם למשך 5 דקות.
4. השעו מחדש את התאים במאגר מחייב (טבלת חומרים) והכתים עם 10 מיקרוליטר של נספח V מצומד FITC ו-5 מיקרוליטר של PI בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
5. לאחר מכן, נתח את התאים על ידי ציטומטר זרימה.

5. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qRT-PCR)

1. קצרו את הפיברובלסטים של הגידים והומוגניזציה באמצעות ערכת מיצוי RNA (טבלת חומרים) בהתאם להמלצות היצרן.
2. בצע PCR שעתוק הפוך עם נגיף הלוקמיה העכברי של מולוני, טרנסקריפטאז הפוך ופריימרים של אוליגו (dT) (טבלת חומרים).
3. בצע qRT-PCR באמצעות SYBR ירוק qPCR Mix במערכת PCR בזמן אמת. תנאי המחזור הם דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו-45 מחזורים ב-95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
   הערה: לפרטים על הפריימרים עבור IL-1β, IL-6 ו-IL-10 עיין בטבלת החומרים. β-אקטין שימש כגן הייחוס.
4. חשב את רמת הביטוי היחסית באמצעות נוסחת ^2-ΔΔCT , כפי שתואר קודם לכן²⁶ .

6. ניתוח כתמים מערביים

1. לאחר טיפול ב-HG (30 מ"מ) בנוכחות או היעדר BBR (20 מיקרומטר) למשך 24 שעות, יש לכמת את הפיברובלסטים של הגידים עם מאגר RIPA (טבלת חומרים), ולכמת את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית.
2. הפרד כמויות שוות ערך של חלבונים (50 מיקרוגרם) מכל דגימה ב-10% SDS-PAGE ב-RT ולאחר מכן העביר לממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
3. יש לחסום את הממברנות בחלב מיובש 5% ללא שומן ב-TBST ולאחר מכן לדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם הנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדנים נגד LC3B (1:1500), נוגדנים נגד p62 (1:2000) ונוגדנים נגד β-אקטין (1:3500).
4. לאחר שטיפה עם TBST, דגרו את הממברנות עם נוגדנים משניים מצומדים H&L HRP נגד ארנב עזים (1:5000) ב-RT למשך שעה.
5. השתמש בערכת כימילומינסנציה ECL כדי לדמיין את הכתמים הספציפיים ולכמת את האוטורדיוגרמות על ידי צפיפות.

7. ניתוח אימונוהיסטוכימי (IHC)

1. חותכים את רקמות גיד כף הרגל המוטבעות בפרפין לחלקים בעובי 6 מיקרומטר.
2. לאחר קיבוע החלקים בפורמלין 4%, יש לדגור את החלקים עם נוגדן נגד LC3 (1:200) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. לאחר שטיפה שלוש פעמים באמצעות PBS של 10 מ"מ (pH7.4 עם Tween 20), יש לדגור על כל החלקים עם נוגדן משני מצומד HRP נגד ארנב עז (1:1000) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ולהכתים עם DAB והמטוקסילין למשך 60 דקות ב-RT.
4. דמיין את השקופיות המוכתמות בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

8. בדיקת TUNEL

הערה: אפופטוזיס תאים ברקמת הגיד נותח באמצעות ערכת בדיקת TUNEL בהתאם להוראות היצרן.

1. חותכים את רקמות גיד כף הרגל המוטבעות בפרפין לחלקים בעובי 6 מיקרומטר.
2. הסר את הפרפין של החלקים בקסילן והחזר אותם ליבש אותם בסדרה מדורגת של אתנול.
3. לאחר טבילה עם 3% מי חמצן ב-RT, דגרו את החלקים בתערובת תגובת TUNEL למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס.
4. כתם את הגרעינים באמצעות DAPI. התבונן בתאים המוכתמים במיקרוסקופ פלואורסצנטי (פי 20) וקבע את אחוז התאים החיוביים ל- TUNEL.

9. ניתוח סטטיסטי

1. השתמש ביישומי תוכנה מתאימים לביצוע ניתוח סטטיסטי
   הערה: כאן, הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD) של שלושה ניסויים בלתי תלויים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם SPSS 23.0. מבחן t של התלמיד בוצע כדי להשוות הבדלים בין קבוצות, וניתוח שונות חד כיווני (ANOVA) בוצע עבור ניתוחים מרובי קבוצות. ההבדל היה מובהק סטטיסטית כאשר p < 0.05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להעריך את התפקיד הפרמקולוגי של BBR בהקלה על פגיעה בגיד סוכרתי, הוערכו אפופטוזיס תאים והפעלת אוטופגיה ברקמות גיד כף הרגל של חולדות DM בנוכחות או בהיעדר BBR. איור 1A הראה שרמת החלבון של LC3 (סמן אוטופגיה) ירדה ברקמות הגידים של חולדות DM בהשוואה לחולדות ביקורת, ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פגיעה בגידים היא סיבוך שכיח בחולים עם DM²⁷. פיברובלסטים של גידים ממלאים תפקיד חשוב בתהליך ריפוי הפצעים^28,29. המחקר הנוכחי אימת כי א) BBR הגביר את הפעלת האוטופגיה והפחית את האפופטוזיס של התאים ברקמות הגידים של חולדות DM, ב) BBR הפחית את ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	516104-M
anti-LC3B	Abcam, CA, USA	ab48394
anti-p62	Abcam	ab91526
anti-β-actin antibody	Abcam	ab8227
Binding buffer	BD Biosciences	556454
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11965092
EVOS XL Core microscope	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodies	Abcam	ab205718
Leukemiavirus reverse transcriptase	Clontech	639574
Male Wistar rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd		200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 Primer	TaKaRa	3806
Primers	Shanghai Sangon Biotech		Synthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	20-188
RNA extraction kit (Trizol)	TaKaRa	9108Q
StepOne Realtime PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376357
TUNEL assay kit	Thermo Fisher Scientific	C10245