Alleviamento della lesione tendinea diabetica attraverso l'attivazione dell'autofagia dei fibroblasti tendinei in trattamento con berberina

Abstract

La berberina (BBR) è un alcaloide isochinolina isolato da Coptis chinensis e possiede preziose attività farmacologiche, tra cui antinfiammatorie, antitumorali e allevianti diverse complicanze del diabete mellito di tipo 2 (T2DM). Tuttavia, il ruolo della BBR nella regolazione della lesione tendinea diabetica rimane poco compreso. In questo studio, è stato costruito un modello di ratto di T2DM e l'apoptosi cellulare e l'autofagia sono state valutate nei tessuti tendinei dopo il trattamento BBR attraverso il test di marcatura nick-end dUTP mediata da TdT (TUNEL) e l'analisi immunoistochimica. I fibroblasti tendinei sono stati ottenuti dal tendine d'Achille di ratto e il ruolo della BBR nella regolazione dell'apoptosi cellulare, nella produzione di citochine infiammatorie e nell'attivazione dell'autofagia è stato valutato utilizzando la citometria a flusso, la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e l'analisi western blot. Abbiamo dimostrato che il trattamento BBR aumenta significativamente l'attivazione dell'autofagia e diminuisce l'apoptosi cellulare nei tessuti tendinei dei ratti T2DM. Nei fibroblasti tendinei, la BBR ha represso l'apoptosi cellulare indotta da glucosio elevato (HG) e la produzione di citochine proinfiammatorie. Il trattamento con HG ha determinato una diminuzione dell'attivazione dell'autofagia nei fibroblasti tendinei, mentre la BBR ha ripristinato l'attivazione dell'autofagia. Ancora più importante, l'inibizione farmacologica dell'autofagia da parte della 3-MA ha indebolito gli effetti protettivi della BBR contro il danno dei fibroblasti tendinei indotto da HG. Nel loro insieme, i risultati attuali dimostrano che la BBR aiuta ad alleviare le lesioni tendinee diabetiche attivando l'autofagia dei fibroblasti tendinei.

Introduzione

Il diabete (diabete mellito, DM) è una malattia metabolica sistemica caratterizzata da iperglicemia¹. Attualmente, il diabete è diventato una delle principali malattie che minacciano la salute umana e l'aspettativa di vita². Più del 90% dei casi sono diabete di tipo 2, una malattia metabolica caratterizzata da infiammazione cronica³, insulino-resistenza⁴ e danni alle cellule β delle isole⁵, e la prevalenza è in aumento ogni anno in tutto il mondo.

Il diabete di tipo 2 porta una serie di gravi complicanze, che hanno gravi effetti sul sistema cardiovascolare⁶, sull'occhio⁷,^{sul rene} 7 e sui nervi⁸, mettendo i pazienti diabetici a rischio di disabilità multiple e persino di rischi per la salute potenzialmente letali. Ci sono stati pochi studi sull'apparato muscolo-scheletrico, soprattutto sulle alterazioni patologiche dei tendini diabetici. Negli ultimi anni, l'incidenza della tendinopatia cronica è aumentata in modo significativo. I tendini possono regolare dinamicamente la loro capacità di immagazzinare ed erogare energia ^9,10. Nei tessuti tendinei, i fibroblasti tendinei svolgono un ruolo importante nella modulazione dell'adattamento tendineo e della riparazione tendinea dopo un infortunio ^9,11. Attualmente, la funzione dei fibroblasti tendinei sulla lesione tendinea rimane poco chiara.

Come alcaloide isochinolino, il BBR esercita effetti farmacologici in una varietà di processi fisiologici, tra cui l'abbassamento della glicemia, l'abbassamento dei lipidi, l'abbassamento del colesterolo, gli effetti antinfiammatori, gli effetti antibatterici, la rimozione delle specie reattive dell'ossigeno e l'antagonismo della disfunzione del sistema nervoso^12,13. La BBR può aumentare l'assorbimento e l'utilizzo del glucosio nel tessuto adiposo e nelle cellule muscolari scheletriche, sovraregolare l'espressione del recettore dell'insulina nel fegato e nelle cellule muscolari scheletriche, aumentare l'espressione del recettore LDL nel fegato e ridurre i livelli di colesterolo e zucchero nel plasma¹⁴. Sebbene la BBR possieda preziose attività farmacologiche nell'alleviare diverse complicanze del DM 15,16,17, il ruolo della BBR nella regolazione del danno tendineo diabetico rimane poco compreso.

L'autofagia deve avvenire a livello basale nella maggior parte dei tessuti per prelevare gli organelli danneggiati e fornire metaboliti per mantenere l'omeostasi metabolica^18,19. L'autofagia svolge un ruolo cruciale nella salute delle cellule β e l'autofagia compromessa è correlata alla disfunzione β cellulare e alla progressione del diabete^20,21. Studi emergenti hanno dimostrato che l'attivazione dell'autofagia indotta da BBR contribuisce a migliorare la nefropatia diabetica²². Sulla base dei risultati di cui sopra, abbiamo esplorato se la BBR è utile nell'alleviare le lesioni del tendine diabetico attraverso la regolazione dell'autofagia. I risultati attuali hanno dimostrato che la BBR ha ridotto la lesione dei fibroblasti tendinei indotta da HG e la risposta infiammatoria. L'HG ha diminuito l'attivazione dell'autofagia dei fibroblasti tendinei, mentre il trattamento BBR ha ripristinato l'attivazione dell'autofagia e ha portato a un conseguente aumento della vitalità dei fibroblasti tendinei e alla riduzione delle citochine proinfiammatorie.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca presso l'Ospedale Yueyang di Medicina Tradizionale Cinese e Occidentale Integrata, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Yueyang di Medicina Tradizionale Cinese e Occidentale Integrata, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (numero IACUC: YYLAC-2019-1). I ratti maschi Wistar (200-240 g, 8 settimane) sono stati acquistati dallo Shanghai SLAC Laboratory Animal Center.

1. Modello di ratto di T2DM

1. Mantenere i ratti Wistar maschi (200-240 g, 8 settimane di età) in un ambiente climatizzato con un ciclo luce/buio di 12 ore (20 ± 2 °C e 50%-60% di umidità relativa). Fornire cibo e acqua ad libitum durante il periodo sperimentale.
2. Sforzarsi di ridurre al minimo la sofferenza degli animali, tra cui una manipolazione delicata, la pulizia quotidiana della gabbia e il monitoraggio.
3. Assegna casualmente i ratti a 3 gruppi: il gruppo di controllo (n = 5), il gruppo modello DM (n = 5) e il modello diabetico trattato con il gruppo BBR (n = 5).
4. Stabilire il modello DM del ratto secondo una descrizione precedente²³.
   1. Somministrare ai ratti una singola iniezione endovenosa di streptozotocina (STZ) disciolta in tampone citrato di sodio appena preparato (p/v: 2%) alla dose di 30 mg/kg. Iniettare il gruppo di controllo per via intraperitoneale con un volume uguale di tampone citrato di sodio citrato senza STZ.
   2. Valutare la glicemia utilizzando un analizzatore di gas nel sangue. Utilizzare i ratti con il livello di glucosio nel sangue indicato (≥16,7 mmol/L, ininterrottamente per 10 giorni) per il modello T2DM.
   3. Dopo 1 settimana, dividere casualmente i ratti T2DM in due gruppi (n = 5 di ciascun gruppo): ratti non trattati o ratti a cui sono stati somministrati 200 mg/kg/die di BBR per sonda gastrica per 4 settimane.

2. Fibroblasti tendinei primari

1. Sacrificare i ratti sotto anestesia mediante iniezione intraperitoneale di barbiturico (40 mg/kg) e ottenere il tendine d'Achille come precedentemente riportato²⁴.
2. Isolare i fibroblasti tendinei dai tessuti tendinei²⁵.
   1. Triturare manualmente i tessuti tendinei e inserirli in DMEM contenente lo 0,2% di collagenasi di tipo II. Agitare energicamente per 3 ore a 37 °C.
   2. Rimuovere il terreno mediante centrifugazione e aggiungere DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina al tessuto digerito.
   3. Filtrare i tessuti tendinei con un colino da 100 μm, versare la soluzione filtrata in piastre a 6 pozzetti e mantenere i fibroblasti tendinei in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂.

3. Saggio di vitalità cellulare

NOTA: Il test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è stato utilizzato per misurare la vitalità cellulare secondo le istruzioni del produttore.

1. Dopo la tripsinizzazione, placcare i fibroblasti tendinei in piastre a 96 pozzetti (4 x 10³ cellule/pozzetto) e quindi trattarli con diverse dosi di glucosio (0, 5, 10, 20, 30 e 50 mM) in presenza o assenza di BBR (0, 5, 10, 20, 40 e 80 μM) per 48 ore.
   NOTA: Il glucosio e la BBR sono stati disciolti nel DMEM.
2. Aggiungere la soluzione di CCK-8 (10 μL) a ciascun pozzetto e incubare le cellule per altre 2 ore a 37°C.
3. Successivamente, misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto con un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nm.

4. Analisi dell'apoptosi cellulare

NOTA: Per analizzare il tasso di apoptosi dei fibroblasti tendinei è stato utilizzato un test di citometria a flusso con ioduro di propidio (PI) e annessina V-FITC.

1. Seminare i fibroblasti tendinei (5 x 10⁵ cellule) in piastre a 6 pozzetti in DMEM per 24 ore.
2. Aspirare e scartare il DMEM da ogni pozzetto. Trattare le cellule con DMEM fresco contenente HG (30 mM) in presenza o assenza di BBR (20 μM) per 24 ore.
3. Staccare le cellule con tripsina allo 0,25% in 1x PBS, raccogliere le cellule con PBS e centrifugare a 2000 x g per 5 minuti.
4. Risospendere le cellule nel tampone di legame (Tabella dei materiali) e colorare con 10 μL di annessina V coniugata con FITC e 5 μL di PI al buio per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
5. Quindi, analizzare le cellule con un citometro a flusso.

5. Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)

1. Raccogliere i fibroblasti tendinei e omogeneizzarli utilizzando un kit di estrazione dell'RNA (Tabella dei materiali) secondo le raccomandazioni del produttore.
2. Eseguire la PCR trascrizionale inversa con la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina di Moloney e i primer Oligo (dT) (Tabella dei materiali).
3. Eseguire qRT-PCR utilizzando la miscela qPCR verde SYBR sul sistema PCR in tempo reale. Le condizioni del ciclo sono la denaturazione a 95 °C per 10 minuti e 45 cicli a 95 °C per 20 s, 55 °C per 20 s e 72 °C per 30 s.
   NOTA: Per i dettagli sui primer per IL-1β, IL-6 e IL-10 fare riferimento alla Tabella dei materiali. La β-actina è stata utilizzata come gene di riferimento.
4. Calcolare il livello di espressione relativo utilizzando la formula ^2-ΔΔCT , come descritto in precedenza²⁶ .

6. Analisi del Western blot

1. Dopo il trattamento con HG (30 mM) in presenza o assenza di BBR (20 μM) per 24 ore, lisare i fibroblasti tendinei con tampone RIPA (Table of Materials) e quantificare la concentrazione proteica totale utilizzando il test dell'acido bicinconinnico.
2. Separare quantità equivalenti di proteine (50 μg) da ciascun campione mediante SDS-PAGE al 10% a RT e quindi trasferire su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) a 4 °C per 2 ore.
3. Bloccare le membrane in latte in polvere scremato al 5% in TBST e quindi incubare per una notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari: anticorpi anti-LC3B (1:1500), anti-p62 (1:2000) e anti-β-actina (1:3500).
4. Dopo essere stati lavati con TBST, incubare le membrane con anticorpi secondari coniugati H&L HRP-di capra anti-coniglio (1:5000) a RT per 1 ora.
5. Utilizzare un kit di chemiluminescenza ECL per visualizzare i blot specifici e quantificare gli autoradiogrammi mediante densitometria.

7. Analisi immunoistochimica (IHC)

1. Tagliare i tessuti tendinei del piede inclusi in paraffina in sezioni spesse 6 μm.
2. Dopo aver fissato le sezioni in formalina al 4%, incubare le sezioni con anticorpo anti-LC3 (1:200) per una notte a 4 °C.
3. Dopo aver lavato tre volte con 10 mM di PBS (pH 7,4 con Tween 20), incubare tutte le sezioni con l'anticorpo secondario coniugato HRP anti-coniglio di capra (1:1000) per 1 ora a 37 °C e colorare con DAB ed ematossilina per 60 minuti a RT.
4. Visualizzare i vetrini colorati con un ingrandimento 20x utilizzando un microscopio invertito.

8. Saggio TUNEL

NOTA: L'apoptosi cellulare nel tessuto tendineo è stata analizzata utilizzando un kit di test TUNEL secondo le istruzioni del produttore.

1. Tagliare i tessuti tendinei del piede inclusi in paraffina in sezioni spesse 6 μm.
2. Deparaffinare le sezioni in xilene e reidratarle in una serie graduata di etanolo.
3. Dopo l'immersione con perossido di idrogeno al 3% a RT, incubare le sezioni con la miscela di reazione TUNEL per 1 ora a 37 °C.
4. Controcolorare i nuclei utilizzando DAPI. Osservare le cellule colorate al microscopio a fluorescenza (20x) e determinare la percentuale di cellule TUNEL-positive.

9. Analisi statistica

1. Utilizzare applicazioni software appropriate per eseguire analisi statistiche
   NOTA: Qui, i dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti. Le analisi statistiche sono state eseguite con SPSS 23.0. Il t-test di Student è stato eseguito per confrontare le differenze tra i gruppi ed è stata eseguita l'analisi della varianza a una via (ANOVA) per analisi di più gruppi. La differenza era statisticamente significativa quando p < 0,05.

Risultati

Per valutare il ruolo farmacologico della BBR nell'alleviare il danno tendineo diabetico, l'apoptosi cellulare e l'attivazione dell'autofagia nei tessuti tendinei del piede dei ratti DM sono state valutate in presenza o assenza di BBR. La Figura 1A ha mostrato che il livello proteico di LC3 (un marcatore autofagico) era diminuito nei tessuti tendinei dei ratti DM rispetto ai ratti di controllo, mentre il trattamento BBR ripristinava significativamente l'atti...

Discussione

La lesione tendinea è una complicanza comune nei pazienti con DM²⁷. I fibroblasti tendinei svolgono un ruolo importante nel processo di guarigione delle ferite^28,29. L'attuale studio ha verificato che i) la BBR ha aumentato l'attivazione dell'autofagia e diminuito l'apoptosi cellulare nei tessuti tendinei dei ratti DM, ii) la BBR ha diminuito l'apoptosi indotta da HG dei fibroblasti tendinei, iii) la BBR ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	516104-M
anti-LC3B	Abcam, CA, USA	ab48394
anti-p62	Abcam	ab91526
anti-β-actin antibody	Abcam	ab8227
Binding buffer	BD Biosciences	556454
DMEM	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11965092
EVOS XL Core microscope	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000
Goat anti-rabbit H&L HRP-conjugated secondary antibodies	Abcam	ab205718
Leukemiavirus reverse transcriptase	Clontech	639574
Male Wistar rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd		200–240 g, 8 weeks
Oligo (dT)18 Primer	TaKaRa	3806
Primers	Shanghai Sangon Biotech		Synthesized primers for IL-1β, IL-6 and IL-10
RIPA Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	20-188
RNA extraction kit (Trizol)	TaKaRa	9108Q
StepOne Realtime PCR System	Thermo Fisher Scientific	4376357
TUNEL assay kit	Thermo Fisher Scientific	C10245