立体定位手术方法 ，通过 大水池在小鼠中显微注射尾部脑干和上颈椎脊髓

摘要

针对小鼠大脑部位的立体定向手术通常涉及通过颅骨进入，并由颅骨特征引导。在这里，我们概述了一种替代立体定位方法， 通过 大水箱靶向尾部脑干和上颈椎脊髓，该方法依赖于脑干特征的直接可视化。

摘要

靶向小鼠大脑部位的立体定位手术通常由颅骨标志物引导。然后 通过 钻入颅骨的毛刺孔获得通道。由于特定的解剖学挑战，这种标准方法对于尾部脑干和上颈带的靶标可能具有挑战性，因为这些部位远离颅骨标志物，导致不精确。在这里，我们概述了一种 通过 大蓄水池的替代立体定位方法，该方法已用于靶向尾脑干和上颈髓中感兴趣的离散区域。大池从枕骨延伸到图谱（即第二椎骨），充满脑脊液，并被硬脑膜覆盖。这种方法为选择中枢神经系统（CNS）结构提供了一条可重复的途径，这些结构由于解剖学障碍而难以到达。此外，它允许直接可视化靠近目标部位的脑干特征，提高将小注射量输送到尾部脑干和上颈髓中受限的感兴趣区域时的准确性。最后，这种方法提供了避免小脑的机会，小脑对运动和感觉运动研究很重要。

引言

针对小鼠¹ 的大脑部位的标准立体定位手术通常涉及使用一组耳杆和嘴条固定颅骨。然后根据参考图集^2，3和颅骨特征估计坐标，即前颌骨（额骨和顶骨缝合在一起的点）或λ（顶骨和枕骨缝合在一起的点; 图1A、B）。通过进入估计目标上方颅骨的毛刺孔，然后可以到达目标区域，用于传递显微注射或带有插管或光纤的仪器。由于这些缝合线的解剖结构的变化以及bregma或lambda^4，5定位的错误，零点相对于大脑的位置因动物而异。虽然由于这种变异性而导致的小目标误差对于大型或附近的目标来说不是问题，但对于远离前后或背阴平面零点的较小感兴趣区域和/或研究由于年龄，菌株和/或性别而不同大小的动物时，它们的影响更大。延髓和上颈髓还有几个独特的挑战。首先，由于小脑的位置和形状，前后坐标的微小变化与背腹坐标相对于硬脑膜的显着变化有关（图1Bi）^2，6，7。其次，上颈带不包含在颅骨²内。第三，枕骨和颈部肌肉² 的上覆层的倾斜位置使得标准立体定位方法对于位于脑干和脊髓之间过渡附近的结构更具挑战性（图1Bi）。最后，尾部脑干和颈带中许多感兴趣的靶标是小²，需要精确和可重复的注射^8，9。

通过大蓄水池的另一种方法规避了这些问题。大水箱是从枕骨延伸到图谱的大空间（图1A，即第二椎骨）¹⁰。它充满脑脊液，并由硬脑膜¹⁰覆盖。枕骨和图谱之间的这个空间在头部前屈时打开。它可以通过在长头炎肌肉的上覆成对的腹部之间导航来访问，暴露尾部脑干的背表面。然后，如果感兴趣区域位于背表面附近，则可以根据这些区域本身的地标来定位这些区域;或者通过使用obex，即中央管通向IV心室的点，作为坐标到达更深结构的零点。这种方法已成功用于多种物种，包括大鼠¹¹，猫¹²，小鼠^8，9和非人灵长类动物¹³ ，以靶向腹侧呼吸组，髓质内侧网状结构，孤束核，区域后或舌下核。然而，这种方法并未得到广泛使用，因为与标准立体定位方法相比，它需要解剖学知识，专门的工具包和更高级的手术技能。

在这里，我们描述了一种循序渐进的手术方法， 通过 大水箱到达脑干和上颈髓，可视化标志点，设置零点（图2），并估计和优化目标坐标，以便将显微注射物立体定向传递到感兴趣的离散脑干和脊髓区域（图3）。然后，我们讨论与此方法相关的优缺点。

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研究方案

作者声明，该协议遵循Beth Israel Deaconess医疗中心机构动物护理和使用委员会的指导方针。

1. 手术器械和立体定位框架的准备

注意:手术是在无菌条件下进行的。使用无菌尖端技术保持无菌状态。

1. 在立体定位框架上安装带有微量移液管或注射器的立体定位臂，其中装有所选注射剂（腺相关病毒（AAV）或常规示踪剂），并准备鼠标适配器（图2A）。
2. 准备高压灭菌的手术器械（材料表）并将其放置在无菌表面上。

2. 麻醉诱导和小鼠制备

1. 以0.5 L/min的速度打开O₂ ，并将异氟醚汽化器设置为4.0，确保O₂ 流向感应箱。
   注意:确保将异氟醚诱导盒放在罩子中，并且异氟醚从手术部位清除。
2. 将小鼠（10周龄男性C57BL / 6J）置于诱导室中。
3. 呼吸减慢后，打开诱导室，轻轻抬起鼠标。使用剪刀去除头到肩的毛发。

3. 鼠标在立体定位框架中的定位

1. 将鼠标移动到立体定位框架，并将鼻子放在柔性鼻锥中。在此阶段，确保O₂ 流量现在指向鼻锥。
2. 仅使用耳条将鼠标放入立体定位框架中。
   注意:确保耳杆均匀且头部水平。
3. 通过手动引导鼻子将鼠标头部向90°角弯曲。要固定此位置，请在鼠标适配器的耳杆支柱之间放置一个塑料屏障，与支柱平行。颅骨的扁平部分作为参考，类似于传统立体定位手术中的扁平颅骨方法。
   注意:不要过度弯曲头部（即额颅骨平面与工作台表面平面之间的90°角以上），因为这会阻碍气流通过上气道。如果气流受阻，请重新定位鼠标，确保身体支撑在躯干下方，并将塑料卡设置为额颅骨平面和表表面平面之间的90°，如图 2A，C所示。
4. 将加热垫放在鼠标下方，然后确保颈部和身体的其他部分位于同一水平（即，与桌子约180°或平行）。握住弹簧剪刀的工具箱可用于将身体提升到此位置。
   注意:这一步很重要，因为尾部脑干和上颈带根据位置移动，与颅骨固定的中枢神经系统的更多喙部相反。
5. 以2μL / g体重的体积皮下注射单剂量4mg / kg美洛昔康缓释（SR）（s.c.），并将润滑剂放在眼睛上。
6. 首先用70%酒精制备垫清洁手术切口部位，然后用betadine准备垫清洁手术切口部位，然后用酒精准备垫再次清洁并晾干。
7. 在身体下方放置一个垂坠物。
8. 消毒双手并戴上无菌手套。
9. 在手术部位放置一个悬垂物。

4. 手术进入大水池

1. 通过捏脚趾或检查角膜反射，确保对鼠标进行适当的麻醉。
2. 将异氟醚降低到维持水平 （2.0）。
3. 用手术刀片#10从枕骨边缘向肩部做一个1-1.2厘米的切口，一次平稳的运动。
4. 在斜方肌的中线缝合处做一个切口。这暴露了成对的长头炎肌肉。
   注意:在小鼠中，斜方肌是非常薄的，几乎透明的肌肉。确保保持在中线，不要切入下面的肌肉，因为这会导致不必要的出血。
5. 将两个牵开器钩放在成对的长头炎肌肉之间，一个朝向左侧，另一个面向右侧。止血器的重量为牵开器钩提供张力，可以通过重新调整止血器的位置来修改。
6. 将手术显微镜放置在适当的位置，以更好地可视化手术区域。
7. 使用钝性椎板切除术镊子分离成对的头长肌的左腹和右腹，从枕骨开始，中线很容易看到。引导钝镊子穿过中线的枕骨，直到它与蓄水池硬脑膜相遇的地方，然后继续穿过硬脑膜到图集。
   注意:没有必要切开成对的长头炎肌肉，因为没有任何东西将它们固定在中线;这样做会导致不必要的出血。
8. 重新定位收紧器，并通过重新定位止血器来调整张力，打开大水箱的视野。
9. 使用钝性椎板切除术镊子在中线进一步分离肌肉，以获得脑干和小脑的良好观察窗。
10. 根据需要重复步骤4.7-4.9，直到小脑和脑干进入硬脑膜下方。
11. 使用钝性椎板切除术镊子，通过将镊子从中线向横向移动来清除结缔组织小链的硬脑膜，直到有清晰的脑干视图并根据需要为目标创造更多的横向空间。

5. 打开蓄水池膜

1. 使用倾斜的杜蒙镊子（#4/45）抓住从枕骨延伸到图谱的硬脑膜。抓住枕骨附近的硬脑膜，用弹簧剪刀在硬脑膜上做一个小开口（~0.5至1.5毫米）。
   注意:在这个骨架位置，脑干和上覆硬脑膜之间的空间最宽，为安全操作硬脑膜提供了充足的空间。
2. 使用弹簧剪刀抬起硬脑膜并进一步打开硬脑膜。窗口的大小取决于目标。
   注意:进行多次纵向注射或双侧注射时，需要更大的窗口;在进行单侧或中线注射时，一个小窗口就足够了。
3. 一旦硬脑膜打开，用无菌提示尖端排出多余的脑脊液。

6. 地标和零点的识别

1. 通过开放的硬脑膜查看脑干的背表面，并附上详细的地标。obex，即中央管通入静脉输液室的点，是标准的前后和中外零点。

7. 目标坐标

注意:对于各种目标，我们列出了一个标准坐标列表，其前后坐标（AP）和中外（ML）坐标相对于零点前后（AP）和中外（ML）坐标相对于零点前后角和大水池坐标，AP和ML坐标相对于零点obex，以促进方法之间的转换（表1）。背动脉 （DV） 坐标相对于 AP 和 ML 入口点处的脑或小脑表面（标准入路）或脑干或上颈带表面（大水池入路）。手术前应进行计划。

1. 使用三组坐标来确定目标:AP、ML 和 DV。由于头部位置，脑干结构的相对方向因位置而异。
   1. 对于从尾部到obex的目标距离>0.4 mm（图1B，绿色），请执行以下操作。
      1. AP:使用任何标准的立体定位参考图集（例如，Paxinos和Franklin atlas²）或在横向平面上切割的组织序列来估计obex和目标之间的AP距离。
      2. ML:使用在横向平面上切割的任何标准立体定位参考图集或组织序列来估计obex和目标之间的ML距离。
      3. DV:估计AP和ML目标点相对于大脑或小脑表面的坐标。使用在横向平面上切割的任何标准立体定位参考图集或组织序列来估计所需AP和ML坐标处的脑干表面与目标之间的距离。
   2. 对于从尾部到尾部<0.4 mm的目标距离（图1B，橙色），请执行以下操作。
      1. AP:调整坐标以考虑脑干的前屈。对于腹侧和腹骨坐标，AP脑干入口点相对于标准平面中的目标 AP 坐标将更具尾部。
      2. ML:从横向平面上切割的标准立体定位参考图集或组织序列中获取目标坐标。坐标将相对于目标 AP 级别的可视化中线。
      3. DV:估计相对于 AP 和 ML 目标点处脑干表面的坐标。调整 DV 以考虑脑干的前屈。对于腹侧和腹骨坐标，DV坐标将大于标准平面中脑干背表面的距离。

8. 注射靶标

1. 使用立体定位臂将移液器或注射器降低到目标，并像标准立体定位方法一样注射溶液。注射后留在原位1-5分钟，以避免在3-50nL之间使用体积时出现针头痕迹。然后，使用立体定位臂提起移液器或注射器。
2. 重复步骤 8.1。用于多个目标。

9. 手术场的封闭

1. 小心地从手术场上取下钩子。成对的长头炎肌肉将落回中立位置，完全覆盖大水池。不要在中线关闭斜方肌和硬脑膜，因为它们太脆弱而无法容纳缝合线。
2. 用三根尼龙或聚丙烯缝合线（5-0或6-0）闭合皮肤。

10. 术后护理

1. 关闭异氟醚，然后从立体定位框架中取出鼠标。将鼠标放在加热垫上的干净笼子中，观察直到醒来并移动。
2. 监测术后第1-3天的健康状况，体重和缝合线。如果尚未移除，请在第10天移除缝合线。

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结果

大水池方法可以靶向尾部脑干和上颈带结构，否则这些结构很难通过标准立体定位方法到达或容易靶向不一致。到达大水池的手术需要切口皮肤，薄薄的梯形肌层和硬脑膜的开口，因此小鼠耐受性良好。当针对多个（纵向分散或双侧）地点时，它特别有效且侵入性更小，因为它不需要像标准立体定位方法那样钻多个毛刺孔。在小鼠中，我们使用大水池方法常规靶向^{结构，例如<...}

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讨论

标准立体定向手术通常依靠颅骨特征来计算中枢神经系统¹中靶位点的坐标。然后 通过 钻入颅骨¹的毛刺孔进入目标部位。这种方法对于尾部脑干来说并不理想，因为靶点位于前后平面和背腹平面2中远离颅骨标志点^， 并且颅骨和上覆肌肉的解剖结构使得进入具有挑战性⁶ （图1Bi）。我们的研究描?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window