Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

Riepilogo

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l'accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.

Abstract

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi è comunemente guidata da punti di riferimento del cranio. L'accesso è quindi ottenuto tramite fori di bava praticati attraverso il cranio. Questo approccio standard può essere difficile per gli obiettivi nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore a causa di specifiche sfide anatomiche in quanto questi siti sono lontani dai punti di riferimento del cranio, portando all'imprecisione. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo tramite la cisterna magna che è stato utilizzato per indirizzare regioni discrete di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. La cisterna magna si estende dall'osso occipitale all'atlante (cioè il secondo osso vertebrale), è piena di liquido cerebrospinale ed è ricoperta da dura madre. Questo approccio fornisce una via di accesso riproducibile a strutture selezionate del sistema nervoso centrale (SNC) che sono altrimenti difficili da raggiungere a causa delle barriere anatomiche. Inoltre, consente la visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale in prossimità dei siti target, aumentando la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale superiore. Infine, questo approccio offre l'opportunità di evitare il cervelletto, che può essere importante per gli studi motori e sensomotori.

Introduzione

La chirurgia stereotassica standard per colpire i siti cerebrali nei topi¹ comporta comunemente la fissazione del cranio utilizzando una serie di barre auricolari e una barra della bocca. Le coordinate vengono quindi stimate in base agli atlanti^{di riferimento 2,3} e ai punti di riferimento del cranio, vale a dire, bregma (il punto in cui le suture delle ossa frontali e parietali si uniscono) o lambda (il punto in cui le suture delle ossa parietale e occipitale si uniscono; Figura 1A,B). Attraverso un foro di bava nel cranio sopra il bersaglio stimato, la regione target può quindi essere raggiunta, sia per la consegna di microiniezioni che per la strumentazione con cannule o fibre ottiche. A causa della variazione nell'anatomia di queste suture e degli errori nella localizzazione di bregma o lambda ^4,5, la posizione dei punti zero in relazione al cervello varia da animale ad animale. Mentre piccoli errori nel targeting, che derivano da questa variabilità, non sono un problema per bersagli grandi o vicini, il loro impatto è maggiore per aree di interesse più piccole che sono lontane dai punti zero nei piani anteroposterior o dorsoventral e / o quando si studiano animali di dimensioni variabili a causa dell'età, della tensione e / o del sesso. Ci sono diverse sfide aggiuntive che sono uniche per il midollo allungato e il cordone cervicale superiore. In primo luogo, piccoli cambiamenti nelle coordinate anteroposteriore sono associati a cambiamenti significativi nelle coordinate dorsoventrali rispetto alla dura, a causa della posizione e della forma del cervelletto (Figura 1Bi)^2,6,7. In secondo luogo, il cordone cervicale superiore non è contenuto all'interno del cranio². In terzo luogo, la posizione obliqua dell'osso occipitale e lo strato sovrastante dei muscoli del collo² rendono l'approccio stereotassico standard ancora più impegnativo per le strutture situate vicino alla transizione tra il tronco cerebrale e il midollo spinale (Figura 1Bi). Infine, molti bersagli di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale sono piccoli², che richiedono iniezioni precise e riproducibili ^8,9.

Un approccio alternativo attraverso la cisterna magna aggira questi problemi. La cisterna magna è un grande spazio che si estende dall'osso occipitale all'atlante (Figura 1A, cioè il secondo osso vertebrale)¹⁰. È riempito con liquido cerebrospinale e coperto da dura madre¹⁰. Questo spazio tra l'osso occipitale e l'atlante si apre quando si anterofisce la testa. È possibile accedervi navigando tra le pance accoppiate sovrastanti del muscolo longus capitis, esponendo la superficie dorsale del tronco cerebrale caudale. Le regioni di interesse possono quindi essere prese di mira in base ai punti di riferimento di queste regioni stesse se si trovano vicino alla superficie dorsale; o usando l'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, come punto zero per le coordinate per raggiungere strutture più profonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo in una varietà di specie, tra cui il ratto¹¹, il gatto¹², il topo ^8,9 e il primate non umano¹³ per colpire il gruppo respiratorio ventrale, la formazione reticolare mediale midollare, il nucleo del tratto solitario, l'area postrema o il nucleo ipoglosso. Tuttavia, questo approccio non è ampiamente utilizzato in quanto richiede conoscenze di anatomia, un toolkit specializzato e competenze chirurgiche più avanzate rispetto all'approccio stereotassico standard.

Qui descriviamo un approccio chirurgico passo-passo per raggiungere il tronco cerebrale e il cordone cervicale superiore attraverso la cisterna magna, visualizzare i punti di riferimento, impostare il punto zero (Figura 2) e stimare e ottimizzare le coordinate target per la consegna stereotassica di microiniezioni nelle regioni discrete del tronco cerebrale e del midollo spinale di interesse (Figura 3). Discutiamo quindi i vantaggi e gli svantaggi legati a questo approccio.

Protocollo

L'autore dichiara che il protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparazione di strumenti chirurgici e telaio stereotassico

NOTA: L'intervento viene eseguito in condizioni asettiche. La sterilità viene mantenuta utilizzando la tecnica della punta sterile.

1. Installare il braccio stereotassico con una micropipetta o una siringa riempita con un iniettabile di scelta (virus adeno-associato (AAV) o tracciante convenzionale) sul telaio stereotassico e preparare l'adattatore per mouse (Figura 2A).
2. Preparare strumenti chirurgici autoclavati (Tabella dei materiali) e posizionarli su una superficie sterile.

2. Induzione dell'anestesia e preparazione del topo

1. Accendere O₂ a 0,5 L/min e impostare il vaporizzatore isoflurano a 4.0, assicurandosi che il flusso di O₂ sia alla scatola di induzione.
   ATTENZIONE: Assicurarsi che la scatola di induzione dell'isoflurano sia collocata in un cappuccio e che l'isoflurano sia rimosso dal sito chirurgico.
2. Posizionare il mouse (maschio di 10 settimane C57BL/6J) nella camera di induzione.
3. Una volta che la respirazione è rallentata, aprire la camera di induzione e sollevare leggermente il mouse. Usa i tagliacapelli per rimuovere i peli dalla testa alle spalle.

3. Posizionamento del mouse nel frame stereotassico

1. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile. In questa fase, assicurarsi che il flusso di O₂ sia ora diretto al cono del naso.
2. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari.
   NOTA: Assicurarsi che le barre auricolari siano uniformi e che la testa sia in piano.
3. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90° guidando manualmente il naso. Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti del padiglione auricolare dell'adattatore del mouse, parallelamente ai pilastri. La parte piatta del cranio funge da riferimento, simile all'approccio del cranio piatto nella chirurgia stereotassica convenzionale.
   NOTA: Non flettere eccessivamente la testa (cioè oltre un angolo di 90° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo) in quanto ciò impedisce il flusso d'aria attraverso le vie aeree superiori. Se il flusso d'aria è ostacolato, riposizionare il mouse, assicurandosi che il corpo sia supportato sotto il tronco e che una carta di plastica sia posizionata a 90 ° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo come indicato nella Figura 2A, C.
4. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse, quindi assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati allo stesso livello (cioè a circa 180 ° o parallelamente al tavolo). La cassetta degli attrezzi che contiene le forbici a molla può essere utilizzata per sollevare il corpo in questa posizione.
   NOTA: Questo passaggio è importante in quanto il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore si muovono a seconda della posizione, in contrasto con più parti rostrali del SNC che sono tenute in posizione dal cranio.
5. Iniettare una singola dose di 4 mg/kg di Meloxicam a lento rilascio (SR) per via sottocutanea (s.c.) ad un volume di 2 μL/g di peso corporeo e posizionare il lubrificante sugli occhi.
6. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione betadine, e poi di nuovo con un tampone di preparazione dell'alcol e lasciare asciugare.
7. Posiziona un drappo sotto il corpo.
8. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili.
9. Posizionare un drappo nel sito chirurgico.

4. Chirurgia per accedere alla cisterna magna

1. Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale.
2. Ridurre l'isoflurano a livelli di manutenzione (2.0).
3. Fai un'incisione di 1-1,2 cm con la lama chirurgica #10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.
4. Fai un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio. Questo espone i muscoli longus capitis accoppiati.
   NOTA: Nei topi, il muscolo trapezio è un muscolo molto sottile, quasi trasparente. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti in quanto ciò causerà sanguinamento inutile.
5. Posiziona entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Il peso degli emostati fornisce tensione ai ganci di riavvolgimento che possono essere modificati regolando nuovamente la posizione degli emostati.
6. Posizionare il microscopio chirurgico in posizione per visualizzare meglio il campo chirurgico.
7. Utilizzare la pinza smussata per laminectomia per separare il ventre sinistro e destro del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite, dove la linea mediana è facilmente visibile. Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale, quindi continua attraverso la dura madre fino all'atlante.
   NOTA: Non è necessario tagliare i muscoli longus capitis accoppiati poiché nulla li tiene insieme nella linea mediana; in questo modo causerà sanguinamento inutile.
8. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati, aprendo la vista della cisterna magna.
9. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona finestra di visualizzazione del tronco cerebrale e del cervelletto.
10. Ripetere i passaggi 4.7-4.9 secondo necessità fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale vengono visualizzati sotto la dura.
11. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli fili di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale, fino a quando non vi è una visione chiara del tronco cerebrale e creare più spazio laterale, se necessario per il bersaglio.

5. Apertura della membrana cisternale

1. Usa la pinza Dumont angolata (#4/45) per afferrare la dura, che si estende dall'osso occipitale all'atlante. Afferrare la dura vicino all'osso occipitale e utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura (~ 0,5 a 1,5 mm) nella dura.
   NOTA: In questa posizione rostrale, lo spazio tra il tronco cerebrale e la dura sovrastante è più ampio, fornendo ampio spazio per la manipolazione sicura della dura.
2. Utilizzare le forbici a molla per sollevare la dura e aprire ulteriormente la dura. La dimensione della finestra dipende dalla destinazione.
   NOTA: Sarà necessaria una finestra più grande quando si effettuano iniezioni longitudinali multiple o iniezioni bilaterali; una piccola finestra sarà sufficiente quando si effettuano iniezioni unilaterali o intermedie singole.
3. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta sterile.

6. Identificazione dei punti di riferimento e del punto zero

1. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, è il punto zero anteriore-posteriore e mediolaterale standard.

7. Coordinate target

NOTA: Per vari target, abbiamo incluso un elenco di coordinate standard con coordinate anteriori posteriori (AP) e mediolaterali (ML) relative alle coordinate bregma e cisterna magna a punto zero con coordinate AP e ML relative all'obex a punto zero per facilitare la transizione tra le metodologie (Tabella 1). Le coordinate dorsoventrali (DV) sono relative alla superficie del cervello o del cervelletto (approccio standard) o alla superficie del tronco cerebrale o del cordone cervicale superiore (approccio cisterna magna) nel punto di ingresso AP e ML. La pianificazione dovrebbe essere fatta prima dell'intervento chirurgico.

1. Utilizzare i tre set di coordinate per determinare la destinazione: AP, ML e DV. A causa della posizione della testa, l'orientamento relativo delle strutture del tronco cerebrale varia in base alla posizione.
   1. Per la distanza target >0,4 mm dall'ombelico all'obex (Figura 1B, verde) eseguire le seguenti operazioni.
      1. AP: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard (ad esempio, Paxinos e Franklin atlas²) o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza AP tra obex e il bersaglio.
      2. ML: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza ML tra obex e il bersaglio.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del cervello o del cervelletto nel punto target AP e ML. Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza tra la superficie del tronco cerebrale alle coordinate AP e ML desiderate e il bersaglio.
   2. Per la distanza target <0,4 mm dall'caudale all'obex (Figura 1B, arancione) eseguire quanto segue.
      1. AP: Regola le coordinate per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, il punto di ingresso del tronco cerebrale AP sarà più caudale rispetto alla coordinata AP target nel piano standard.
      2. ML: Derivare le coordinate target da un atlante di riferimento stereotassico standard o da una serie di tessuti tagliati nel piano trasversale. Le coordinate saranno relative alla linea mediana visualizzata a livello di AP di destinazione.
      3. DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del tronco cerebrale nel punto target AP e ML. Regola DV per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, le coordinate DV saranno maggiori della distanza dalla superficie dorsale del tronco cerebrale nel piano standard.

8. Iniezione del bersaglio

1. Abbassare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico e iniettare la soluzione come per gli approcci stereotassici standard. Lasciare in posa per 1-5 minuti dopo l'iniezione, per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra 3-50 nL. Quindi, sollevare la pipetta o la siringa utilizzando il braccio stereotassico.
2. Ripetere il passaggio 8.1. per obiettivi multipli.

9. Chiusura del campo chirurgico

1. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico. I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra, coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture.
2. Chiudere la pelle con tre punti di sutura in nylon o polipropilene (5-0 o 6-0).

10. Assistenza post-operatoria

1. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Metti il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante e osserva fino a quando non sei sveglio e in movimento.
2. Monitorare lo stato di salute, il peso e le suture nei giorni post-operatori 1-3. Rimuovere le suture il giorno 10 se non sono già state rimosse.

Risultati

L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. L'intervento chirurgico per raggiungere la cisterna magna richiede incisioni della pelle, un sottile strato di muscolo trapezio e l'apertura della dura madre ed è quindi ben tollerato dai topi. È particolarmente efficiente e meno invasivo quando si prendono di mira pi?...

Discussione

La chirurgia stereotassica standard si basa comunemente sui punti di riferimento del cranio per calcolare le coordinate dei siti target nel SNC¹. I siti bersaglio sono quindi accessibili tramite fori di bava che vengono perforati attraverso il cranio¹. Questo metodo non è ideale per il tronco cerebrale caudale in quanto i siti bersaglio si trovano distanti dai punti di riferimento del cranio nei piani anteroposteriore e dorsoventrale² e poi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window