Стереотаксический хирургический подход к микроинъекции каудального ствола головного и верхнего шейного отдела спинного мозга через Cisterna Magna у мышей

Резюме

Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно включает доступ через кости черепа и руководствуется ориентирами черепа. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход для нацеливания на хвостовой ствол мозга и верхний шейный отдел спинного мозга с помощью cisterna magna, который опирается на прямую визуализацию ориентиров ствола мозга.

Аннотация

Стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей обычно руководствуется ориентирами черепа. Затем доступ осуществляется через отверстия заусенца, просверленные через череп. Этот стандартный подход может быть сложным для целей в хвостовом стволе мозга и верхней части шейного канатика из-за специфических анатомических проблем, поскольку эти участки удалены от ориентиров черепа, что приводит к неточности. Здесь мы излагаем альтернативный стереотаксический подход с помощью cisterna magna, который использовался для нацеливания на дискретные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Cisterna magna простирается от затылочной кости до атласа (т. е. второй позвоночной кости), заполнена спинномозговой жидкостью и покрыта твердой мозговой оболочкой. Этот подход обеспечивает воспроизводимый путь доступа к выбранным структурам центральной нервной системы (ЦНС), которые в противном случае трудно достичь из-за анатомических барьеров. Кроме того, он позволяет напрямую визуализировать ориентиры ствола мозга в непосредственной близости от целевых участков, повышая точность при доставке небольших объемов инъекций в ограниченные области, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и верхней части шейного канатика. Наконец, такой подход дает возможность избежать мозжечка, что может быть важно для моторных и сенсомоторных исследований.

Введение

Стандартная стереотаксическая хирургия для нацеливания на участки мозга у мышей¹ обычно включает фиксацию черепа с использованием набора ушных перекладин и ротовой панели. Затем координаты оцениваются на основе справочных атласов ^2,3 и ориентиров черепа, а именно: брегма (точка, где швы лобной и теменной костей сходятся) или лямбда (точка, где швы теменной и затылочной костей сходятся; Рисунок 1А,В). Через отверстие в черепе над предполагаемой целью может быть достигнута целевая область, либо для доставки микроинъекций, либо для инструментов с помощью канюль или оптических волокон. Из-за вариации анатомии этих швов и ошибок в локализации брегмы или лямбды ^4,5 положение нулевых точек по отношению к мозгу варьируется от животного к животному. Хотя небольшие ошибки в нацеливании, которые являются результатом этой изменчивости, не являются проблемой для крупных или близлежащих целей, их воздействие больше для небольших областей интереса, которые удалены от нулевых точек в переднезадней или дорсовентральной плоскостях и / или при изучении животных различного размера из-за возраста, деформации и / или пола. Существует несколько дополнительных проблем, которые являются уникальными для продолговатого мозга и верхней части шейного канатика. Во-первых, небольшие изменения переднезадных координат связаны со значительными изменениями дорсовентральных координат относительно твердой мозговой оболочки, обусловленными положением и формой мозжечка (рисунок 1Bi)^2,6,7. Во-вторых, верхний шейный канатик не содержится в черепе². В-третьих, наклонное положение затылочной кости и вышележащего слоя мышц шеи² делает стандартный стереотаксический подход еще более сложным для структур, расположенных вблизи перехода между стволом головного и спинного мозга (рисунок 1Bi). Наконец, многие мишени, представляющие интерес в каудальном стволе мозга и^шейном канатике, являются небольшими 2, требующими точных и воспроизводимых инъекций ^8,9.

Альтернативный подход через cisterna magna обходит эти проблемы. Cisterna magna представляет собой большое пространство, которое простирается от затылочной кости до атласа (рисунок 1A, т. е. вторая позвоночная кость)¹⁰. Он заполнен спинномозговой жидкостью и покрыт твердой мозговой оболочкой¹⁰. Это пространство между затылочной костью и атласом открывается при антерофлексе головы. К нему можно получить доступ, перемещаясь между вышележащими парными животами мышцы longus capitis, обнажая дорсальную поверхность хвостового ствола мозга. Затем можно ориентироваться на области, представляющие интерес, на основе ориентиров самих этих регионов, если они расположены вблизи дорсальной поверхности; или с помощью obex, точки, где центральный канал открывается в IV желудочек, в качестве нулевой точки для координат, чтобы достичь более глубоких структур. Этот подход был успешно использован у различных видов, включая крысу¹¹, кошку¹², мышь ^8,9 и нечеловеческого примата¹³ для нацеливания на вентральную респираторную группу, медуллярную медиальную ретикулярную формацию, ядро одиночных путей, область постремы или подъязычное ядро. Однако этот подход широко не используется, поскольку он требует знания анатомии, специализированного инструментария и более продвинутых хирургических навыков по сравнению со стандартным стереотаксическим подходом.

Здесь мы описываем пошаговый хирургический подход к достижению ствола мозга и верхней части шейного мозга через cisterna magna, визуализации ориентиров, установке нулевой точки (рисунок 2), а также оценке и оптимизации целевых координат для стереотаксической доставки микроинъекций в дискретные области ствола мозга и спинного мозга, представляющие интерес (рисунок 3). Затем мы обсудим преимущества и недостатки, связанные с этим подходом.

протокол

Автор заявляет, что протокол следует руководящим принципам Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Бет Исраэль Диаконисс.

1. Подготовка хирургических инструментов и стереотаксического каркаса

ПРИМЕЧАНИЕ: Операция проводится в асептических условиях. Стерильность поддерживается с помощью метода стерильного наконечника.

1. Установите стереотаксическую руку с микропипеткой или шприцем, заполненным инъекционным препаратом по выбору (аденоассоциированный вирус (AAV) или обычный индикатор) на стереотаксическую рамку и подготовьте адаптер мыши (рисунок 2A).
2. Подготовьте автоклавные хирургические инструменты (Таблицу материалов) и поместите их на стерильную поверхность.

2. Индукция анестезии и подготовка мышей

1. Включите O₂ со скоростью 0,5 л/мин и установите испаритель изофлурана на 4,0, убедившись, что поток O₂ поступает в индукционную коробку.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что индукционная коробка изофлунана помещена в капюшон и что изофлуран удаляется от места операции.
2. Поместите мышь (10-недельный самец C57BL/6J) в индукционную камеру.
3. Как только дыхание замедлится, откройте индукционную камеру и слегка приподнимите мышь. Используйте машинки для стрижки для удаления волос с головы на плечи.

3. Позиционирование мыши в стереотаксическом кадре

1. Переместите мышь к стереотаксической рамке и поместите нос в гибкий носовой конус. На этом этапе убедитесь, что поток O₂ теперь направлен к носовому конусу.
2. Поместите мышь в стереотаксическую рамку, используя только наушники.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова ровная.
3. Антерофлекс головку мыши под углом 90° путем ручного наведения носа. Чтобы закрепить это положение, поместите пластиковый барьер между стойками ушной перекладины адаптера мыши, параллельно стойкам. Плоская часть черепа служит ориентиром, подобно подходу плоского черепа в обычной стереотаксической хирургии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует чрезмерно сгибать головку (т.е. за пределы угла 90° между плоскостью лобной кости черепа и плоскостью поверхности стола), так как это препятствует потоку воздуха через верхние дыхательные пути. Если воздушный поток затруднен, переместите мышь, убедившись, что тело поддерживается под туловищем, а пластиковая карта установлена на 90° между плоскостью лобной кости черепа и плоскостью поверхности стола, как показано на рисунке 2A, C.
4. Поместите грелку под мышь, а затем убедитесь, что шея и остальная часть тела расположены на одном уровне (то есть примерно на 180° или параллельно столу). Набор инструментов, который удерживает пружинные ножницы, можно использовать для подъема тела в это положение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, так как хвостовой ствол мозга и верхний шейный канатик движутся в зависимости от положения, в отличие от более ростральных частей ЦНС, которые удерживаются на месте черепом.
5. Вводят однократную дозу 4 мг/кг мелоксикама с медленным высвобождением (SR) подкожно (s.c.) при объеме 2 мкл/г массы тела и наносят смазку на глаза.
6. Очистите место хирургического разреза сначала с помощью 70% спиртовой прокладки для приготовления, затем с помощью прокладки для подготовки бетадина, а затем снова с помощью прокладки для подготовки спирта и дайте высохнуть.
7. Поместите драпировку под корпус.
8. Продезинфицируйте руки и наденьте стерильные перчатки.
9. Поместите драпировку в месте операции.

4. Операция по доступу к cisterna magna

1. Убедитесь, что мышь соответствующим образом обезболена, зажав пальцы ног или проверив рефлекс роговицы.
2. Снизить уровень изофлурана до уровня технического обслуживания (2,0).
3. Сделайте разрез 1-1,2 см хирургическим лезвием No10 от края затылочной кости по направлению к плечам одним плавным движением.
4. Сделайте разрез в средней линии трапециевидной мышцы. Это обнажает парные мышцы longus capitis.
   ПРИМЕЧАНИЕ: У мышей трапециевидная мышца представляет собой очень тонкую, почти прозрачную мышцу. Убедитесь, что вы остаетесь в средней линии и не врезаетесь в нижележащие мышцы, так как это вызовет ненужное кровотечение.
5. Поместите оба втягивающих крючка между парными мышцами longus capitis, один из которых ориентирован влево, а другой вправо. Вес гемостатов обеспечивает натяжение втягивающих крючков, которые могут быть изменены путем повторной регулировки положения гемостатов.
6. Расположите хирургический микроскоп на месте, чтобы лучше визуализировать хирургическое поле.
7. Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы отделить левый и правый живот парной мышцы longus capitis, начиная с затылка, где хорошо видна средняя линия. Направьте тупые щипцы через кость затылка по средней линии вниз к тому месту, где она встречается с цистерной твердой мозговой оболочки, а затем продолжайте через твердую мозговую оболочку к атласу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости разрезать парные мышцы longus capitis, так как ничто не удерживает их вместе в средней линии; это вызовет ненужное кровотечение.
8. Переставьте втягивающие устройства и отрегулируйте напряжение, переместив гемостаты, открыв вид cisterna magna.
9. Используйте тупые щипцы ламинэктомии, чтобы отделить мышцы дальше по средней линии, чтобы получить хорошее окно обзора ствола мозга и мозжечка.
10. Повторяйте шаги 4.7-4.9 по мере необходимости, пока мозжечок и ствол мозга не попадут ниже твердой мозговой оболочки.
11. Используя тупые щипцы ламинэктомии, очищают твердую мозговую оболочку от мелких нитей соединительной ткани, перемещая щипцы от средней линии в боковом направлении, пока не появится четкое представление ствола мозга и создают больше бокового пространства, как это необходимо для цели.

5. Открытие цистернальной мембраны

1. Используйте угловые щипцы Дюмона (#4/45), чтобы захватить твердую мозговую оболочку, которая простирается от затылочной кости до атласа. Возьмите твердое тело вблизи затылочной кости и используйте пружинные ножницы, чтобы сделать небольшое отверстие (~ 0,5-1,5 мм) в твердой мозговой оболочке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом ростральном расположении пространство между стволом мозга и вышележащей твердой мозговой оболочкой является самым широким, что обеспечивает достаточно места для безопасных манипуляций с твердой мозговой оболочкой.
2. Используйте пружинные ножницы, чтобы поднять твердую мозговую оболочку и открыть твердую мозговую оболочку дальше. Размер окна зависит от целевого объекта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При многократных продольных инъекциях или двусторонних инъекциях потребуется большее окно; небольшого окошка будет достаточно при совершении одиночных односторонних или среднелинейных инъекций.
3. Как только твердая мозговая оболочка будет открыта, слейте избыток спинномозговой жидкости стерильным кончиком сигнала.

6. Идентификация ориентиров и нулевой точки

1. Посмотрите на дорсальную поверхность ствола мозга с подробными ориентирами через открытую твердую мозговую оболочку. Обекс, точка, где центральный канал открывается в IV желудочек, является стандартной передне-задней и медиолатеральной нулевой точкой.

7. Координаты цели

ПРИМЕЧАНИЕ: Для различных целей мы включили список стандартных координат с передними задними (AP) и медиолатеральными (ML) координатами относительно координат брегмы нулевой точки и cisterna magna с координатами AP и ML относительно нулевой точки obex для облегчения перехода между методологиями (таблица 1). Координаты дорсовентрального (DV) относятся к поверхности мозга или мозжечка (стандартный подход) или поверхности ствола мозга или верхней части шейного канатика (cisterna magna approach) в точке входа AP и ML. Планирование должно быть сделано до операции.

1. Используйте три набора координат для определения цели: AP, ML и DV. Из-за положения головы относительная ориентация структур ствола мозга варьируется в зависимости от местоположения.
   1. Для целевого расстояния >0,4 мм от каудального до обекса (рисунок 1B, зеленый) выполните следующие действия.
      1. AP: Используйте любой стандартный стереотаксический справочный атлас (например, Paxinos и Franklin atlas²) или серии тканей, вырезанные в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние AP между obex и целью.
      2. ML: Используйте любой стандартный стереотаксический эталонный атлас или серию тканей, вырезанную в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние ML между obex и мишенью.
      3. Д.В.: Оцените координаты относительно поверхности мозга или мозжечка в целевой точке AP и ML. Используйте любой стандартный стереотаксический эталонный атлас или серии тканей, вырезанные в поперечной плоскости, чтобы оценить расстояние между поверхностью ствола мозга по желаемым координатам AP и ML и целью.
   2. Для целевого расстояния <0,4 мм от каудального до обекса (рисунок 1B, оранжевый) выполните следующие действия.
      1. АП: Скорректируйте координаты, чтобы учесть антерофлексию ствола мозга. Для вентральных и ростральных координат точка входа ствола мозга AP будет более каудальной относительно координаты AP цели в стандартной плоскости.
      2. МЛ: Получение координат цели из стандартного стереотаксического эталонного атласа или тканевого ряда, вырезанного в поперечной плоскости. Координаты будут относительно визуализированной средней линии на целевом уровне точки доступа.
      3. Д.В.: Оцените координаты относительно поверхности ствола мозга в целевой точке AP и ML. Отрегулируйте DV с учетом антерофлексии ствола мозга. Для вентральных и ростральных координат координат DV будут больше, чем расстояние от дорсальной поверхности ствола мозга в стандартной плоскости.

8. Инъекция мишени

1. Опустите пипетку или шприц к мишени с помощью стереотаксического рычага и введите раствор как для стандартных стереотаксических подходов. Оставить на месте на 1-5 мин после инъекции, чтобы избежать следа иглы при использовании объемов между 3-50 нл. Затем поднимите пипетку или шприц с помощью стереотаксической руки.
2. Повторите шаг 8.1. для нескольких целей.

9. Закрытие хирургического поля

1. Осторожно снимите крючки с хирургического поля. Парные мышцы longus capitis будут возвращаться в нейтральное положение, полностью покрывая cisterna magna. Не закрывайте трапециевидную мышцу и твердую мозговую оболочку в средней линии, так как они слишком хрупкие, чтобы удерживать швы.
2. Закройте кожу тремя нейлоновыми или полипропиленовыми швами (5-0 или 6-0).

10. Послеоперационный уход

1. Выключите изофлуран и извлеките мышь из стереотаксической рамки. Поместите мышь в чистую клетку на грелку и наблюдайте, пока не проснетесь и не пошевелитесь.
2. Следите за состоянием здоровья, весом и швами в послеоперационные дни 1-3. Снимите швы на 10-й день, если они еще не сняты.

Результаты

Подход cisterna magna позволяет нацеливаться на каудальный ствол мозга и верхние структуры шейного канатика, которые в противном случае трудно достичь с помощью стандартных стереотаксических подходов или склонны к непоследовательному нацеливанию. Операция по достижению cisterna magna требу...

Обсуждение

Стандартная стереотаксическая хирургия обычно полагается на ориентиры черепа для расчета координат целевых участков в ЦНС¹. Затем доступ к целевым участкам осуществляется через отверстия для заусенцев, которые просверливаются через череп¹. Этот метод н?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window