마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

요약

생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 뼈를 통한 접근을 포함하며 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 여기서 우리는 뇌간 랜드 마크의 직접적인 시각화에 의존하는 cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부 척수를 목표로하는 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다.

초록

생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 그런 다음 두개골을 통해 뚫린 버 구멍을 통해 접근이 이루어집니다. 이 표준 접근법은 특정 해부학 적 문제로 인해 인과 관계 뇌간 및 상부 자궁 경부의 표적에 도전 할 수 있습니다.이 부위는 두개골 랜드 마크에서 멀리 떨어져 있기 때문에 부정확 함을 초래합니다. 여기서 우리는 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부에서 관심의 개별 영역을 목표로하는 데 사용 된 cisterna magna를 통한 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다. cisterna magna는 후두골에서 아틀라스 (즉, 두 번째 척추 뼈)까지 연장되며, 뇌척수액으로 채워지며 경막으로 덮여 있습니다. 이 접근법은 해부학 적 장벽으로 인해 도달하기 어려운 중추 신경계 (CNS) 구조에 대한 재현 가능한 접근 경로를 제공합니다. 또한, 표적 부위와 가까운 곳에 있는 뇌간(brainstem) 랜드마크를 직접 시각화할 수 있어 인과성 뇌간이나 상부 자궁경부의 제한된 관심 영역에 작은 주사량을 전달할 때 정확도가 높아집니다. 마지막으로,이 접근법은 소뇌를 피할 수있는 기회를 제공하며, 이는 모터 및 감각 운동 연구에 중요 할 수 있습니다.

서문

생쥐¹의 뇌 부위를 표적으로 삼는 표준 입체 택시 수술은 일반적으로 귀 막대 세트와 입 막대를 사용하여 두개골을 고정시키는 것을 포함합니다. 좌표는 참조 아틀라스 ^2,3 및 두개골 랜드 마크, 즉 bregma (정면과 정수리 뼈의 봉합사가 함께 모이는 지점) 또는 람다 (정수리 및 후두부 뼈의 봉합사가 함께 모이는 지점)를 기반으로 추정됩니다. 그림 1A, B). 추정 된 목표 위의 두개골에 버 구멍을 통해 미세 주사를 전달하거나 캐뉼라 또는 광섬유로 계측하기 위해 목표 영역에 도달 할 수 있습니다. 이러한 봉합사의 해부학의 변화와 브레그마 또는 람다 ^4,5의 국소화의 오류로 인해 뇌와 관련하여 영점의 위치는 동물마다 다릅니다. 이러한 가변성으로 인한 타겟팅의 작은 오류는 크거나 가까운 대상에게는 문제가되지 않지만 전후 또는 등쪽 비행기의 영점에서 멀리 떨어져있는 작은 관심 영역 및 / 또는 나이, 변형 및 / 또는 성별로 인해 다양한 크기의 동물을 연구 할 때 그 영향이 더 큽니다. 수질 oblongata와 상부 자궁 경부에 독특한 몇 가지 추가 문제가 있습니다. 첫째, 전후 좌표의 작은 변화는 소뇌의 위치와 모양으로 인해 듀라에 비해 등복부 좌표의 중요한 변화와 관련이 있습니다 (그림 1Bi)^2,6,7. 둘째, 상부 자궁 경부는 두개골² 내에 포함되어 있지 않습니다. 셋째, 후두골의 기울어진 위치와 목 근육의 겹쳐진 층(2)은 뇌간과 척수 사이의 전이 근처에 위치한 구조물에 대해 표준 입체택시 접근법을 더욱 어렵게 만든다⁽그림 1Bi). 마지막으로, 인과 관계 뇌간과 자궁 경부에 관심이있는 많은 표적은 작고²이며, 정확하고 재현 가능한 주사 ^8,9가 필요합니다.

cisterna magna를 통한 대안적인 접근법은 이러한 문제를 우회합니다. cisterna magna는 후두골에서 아틀라스까지 확장되는 넓은 공간입니다 (그림 1A, 즉 두 번째 척추 뼈)¹⁰. 그것은 뇌척수액으로 채워지고 경막¹⁰으로 덮여 있습니다. 후두골과 아틀라스 사이의이 공간은 머리를 전향 굴곡 할 때 열립니다. 그것은 장수 인두염 근육의 위에 놓인 쌍을 이루는 배꼽 사이를 탐색하여 꼬리 뇌간의 등쪽 표면을 노출시킴으로써 접근 할 수 있습니다. 관심 영역은 등쪽 표면 근처에 위치하는 경우 이러한 지역 자체의 랜드 마크를 기반으로 타겟팅 될 수 있습니다. 또는 중앙 운하가 IV 심실로 열리는 점을 좌표가 더 깊은 구조에 도달하는 영점으로 obex를 사용합니다. 이러한 접근법은 래트¹¹, 고양이¹², 마우스^8,9, 및 비인간 영장류¹³을 포함하는 다양한 종에서 성공적으로 사용되어 복부 호흡기, 수질 내측 망상 형성^, 독방의 핵, 부위 후술, 또는 저광택 핵을 표적으로 한다. 그러나이 접근법은 해부학에 대한 지식, 전문 툴킷 및 표준 입체 택시 접근법에 비해 고급 수술 기술이 필요하기 때문에 널리 활용되지 않습니다.

여기서는 cisterna magna를 통해 뇌간과 상부 자궁 경부에 도달하고, 랜드 마크를 시각화하고, 영점을 설정하고(그림 2), 미세주사를 관심 있는 개별 뇌간 및 척수 영역으로 입체적으로 전달하기 위한 목표 좌표를 추정 및 최적화하는 단계별 수술 방법을 설명합니다(그림 3). 그런 다음이 접근법과 관련된 장단점에 대해 논의합니다.

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프로토콜

저자는이 프로토콜이 Beth Israel Deaconess Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따른다고 선언합니다.

1. 수술기구 및 입체형 프레임의 제조

참고 : 수술은 무균 상태에서 수행됩니다. 멸균은 멸균 팁 기술을 사용하여 유지된다.

1. 입체택시 프레임에 원하는 주사제(아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 기존 트레이서)가 채워진 마이크로피펫 또는 주사기가 있는 입체형 암을 설치하고 마우스 어댑터를 준비합니다(그림 2A).
2. 오토클레이브 수술 도구 (재료 표)를 준비하고 멸균 된 표면에 놓습니다.

2. 마취 유도 및 마우스 준비

1. 0.5 L/min에서 O2를 켜고 이소플루란 기화기를 4.0으로 설정하여_O2 흐름이 유도 박스에 있는지 확인합니다.
   주의: 이소플루란 유도 박스가 후드에 놓여 있고 이소플루란이 수술 부위에서 제거되었는지 확인하십시오.
2. 마우스(10주령 수컷 C57BL/6J)를 유도 챔버에 놓는다.
3. 호흡이 느려지면 유도 챔버를 열고 마우스를 약간 들어 올립니다. 클리퍼를 사용하여 머리에서 어깨까지 머리카락을 제거하십시오.

3. 스테레오 택시 프레임에서 마우스의 위치 지정

1. 마우스를 입체 택시 프레임으로 이동하고 코를 유연한 코 콘에 놓습니다. 이 단계에서_O2 흐름이 이제 코 원뿔으로 향하는지 확인하십시오.
2. 이어 바만 사용하여 마우스를 스테레오택시 프레임에 놓습니다.
   참고: 이어 바가 고르고 머리가 평평한지 확인하십시오.
3. 수동으로 코를 안내하여 마우스의 머리를 90 ° 각도로 Anteroflex하십시오. 이 위치를 확보하려면 마우스 어댑터의 이어 바 기둥 사이에 플라스틱 장벽을 기둥과 평행하게 배치하십시오. 두개골의 평평한 부분은 기존의 입체 택시 수술에서 평평한 두개골 접근법과 유사한 참조 역할을합니다.
   참고: 머리를 과도하게 구부리지 마십시오(즉, 전두엽 두개골 뼈의 평면과 테이블 표면의 평면 사이의 각도 90° 이상)는 상부 기도를 통과하는 공기 흐름을 방해합니다. 공기 흐름이 방해 당하면 마우스를 재배치하여 몸체가 트렁크 아래를지지하고 플라스틱 카드가 그림 2A, C에 설명 된대로 전두엽 두개골 뼈의 평면과 테이블 표면의 평면 사이의 90 °로 설정되었는지 확인하십시오.
4. 가열 패드를 마우스 아래에 놓은 다음 목과 신체의 나머지 부분이 같은 수준(즉, 약 180° 또는 테이블과 평행)에 위치하는지 확인합니다. 스프링 가위를 고정하는 도구 상자는 신체를이 위치로 들어 올리는 데 사용할 수 있습니다.
   참고 :이 단계는 두개골에 의해 제자리에 고정되어있는 CNS의 더 많은 rostral 부분과는 달리 위치에 따라 꼬리 뇌 줄기와 상부 자궁 경부가 움직이기 때문에 중요합니다.
5. 4 mg/kg Meloxicam 저속방출(SR)의 단일 용량을 2 μL/g 체중의 부피로 피하(s.c.)로 주사하고 눈에 윤활제를 바르십시오.
6. 수술 절개 부위를 먼저 70 % 알코올 준비 패드로 닦은 다음 베타 딘 준비 패드로 닦은 다음 다시 알코올 준비 패드로 말리십시오.
7. 몸 아래에 드레이프를 놓습니다.
8. 손을 소독하고 멸균 장갑을 착용하십시오.
9. 수술 부위에 커튼을 놓습니다.

4. 시스테르나 마그나에 접근하는 수술

1. 발가락을 꼬집거나 각막 반사를 확인하여 마우스를 적절하게 마취했는지 확인하십시오.
2. 이소플루란을 유지보수 수준으로 줄입니다(2.0).
3. 수술 블레이드 # 10으로 1-1.2cm 절개를하십시오 후두부 뼈의 가장자리에서 어깨쪽으로 한 번의 부드러운 움직임으로.
4. 사다리꼴 근육의 중간 선 랩을 절개하십시오. 이것은 짝을 이룬 장수염 근육을 노출시킵니다.
   참고 : 생쥐에서 사다리꼴 근육은 매우 얇고 거의 투명한 근육입니다. 중간 선에 머물러 있어야하며 불필요한 출혈을 일으킬 수 있으므로 기본 근육을 자르지 마십시오.
5. 두 리트랙터 후크를 쌍을 이룬 장수염 근육 사이에 놓고, 하나는 왼쪽으로, 다른 하나는 오른쪽으로 향하게합니다. 지혈제의 무게는 지혈제의 위치를 다시 조정하여 수정할 수있는 리트랙터 후크에 장력을 제공합니다.
6. 수술 현미경을 제자리에 배치하여 수술 현장을보다 잘 시각화하십시오.
7. 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여 쌍을 이룬 긴 capitis 근육의 왼쪽 및 오른쪽 배를 분리하고, 중간 선이 쉽게 보이는 후두부에서 시작합니다. 중간 선에서 후두부의 뼈를 가로 질러 무딘 포셉을 안내하여 cisternal dura mater와 만나는 곳으로 안내 한 다음 경막을 가로 질러 아틀라스까지 계속하십시오.
   참고 : 짝을 이룬 장수염 근육을 통해 절단 할 필요가 없습니다. 그렇게하면 불필요한 출혈이 발생합니다.
8. 리트랙터의 위치를 변경하고 지혈제의 위치를 변경하여 장력을 조정하여 cisterna magna의 시야를 엽니 다.
9. 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여 중간 선에서 근육을 더 분리하여 뇌간과 소뇌의 좋은 시야 창을 얻으십시오.
10. 소뇌와 뇌간이 두라 아래에 보일 때까지 필요에 따라 4.7-4.9 단계를 반복하십시오.
11. 무딘 laminectomy 포셉을 사용하여, 뇌간을 명확하게 볼 수있을 때까지 중간 선에서 횡방향으로 포셉을 이동하여 결합 조직의 작은 가닥의 경막을 지우고 대상에 필요에 따라 더 많은 측면 공간을 만듭니다.

5. 흉골 막의 개방

1. 각진 Dumont 포셉 (# 4/45)을 사용하여 후두부에서 아틀라스까지 뻗어있는 듀라를 잡으십시오. 후두부 뼈 근처의 경막을 잡고 봄 가위를 사용하여 두라에 작은 개구부 (~ 0.5 ~ 1.5mm)를 만듭니다.
   참고 :이 로스트랄 위치에서는 뇌간과 위에 놓인 경막 사이의 공간이 가장 넓어 두라를 안전하게 조작 할 수있는 충분한 공간을 제공합니다.
2. 봄 가위를 사용하여 경막을 들어 올리고 경막을 더 엽니 다. 창의 크기는 대상에 따라 다릅니다.
   참고 : 여러 개의 세로 주사 또는 양측 주사를 할 때 더 큰 창이 필요합니다. 작은 창은 단일 일방적 또는 중간 선 주입을 할 때 충분합니다.
3. 경막이 열리면 멸균 큐 팁으로 과도한 뇌척수액을 배출하십시오.

6. 랜드마크와 영점의 식별

1. 열린 두라를 통해 상세한 랜드 마크가있는 뇌간의 등쪽 표면을보십시오. 중앙 운하가 IV 심실로 열리는 지점 인 외면은 표준 전후 및 평측 영점입니다.

7. 목표 좌표

참고: 다양한 대상에 대해 방법론 간의 전환을 용이하게 하기 위해 영점 브레그마를 기준으로 한 전방후(AP) 및 평측(ML) 좌표를 갖는 표준 좌표 목록과 영점 오벡스를 기준으로 AP 및 ML 좌표를 사용하는 시스테르나 마그나 좌표를 포함시켰습니다(표 1). Dorsoventral (DV) 좌표는 AP 및 ML 진입 지점에서 뇌 또는 소뇌의 표면 (표준 접근법) 또는 뇌간 또는 상부 경추 (cisterna magna approach)의 표면에 상대적입니다. 계획은 수술 전에해야합니다.

1. 세 가지 좌표 집합을 사용하여 대상인 AP, ML 및 DV를 결정합니다. 머리 위치로 인해 뇌간 구조의 상대적 방향은 위치에 따라 다릅니다.
   1. 꼬리에서 오벡스까지의 목표 거리 >0.4mm(그림 1B, 녹색)의 경우 다음을 수행합니다.
      1. AP: 표준 입체형 참조 아틀라스(예: Paxinos 및 Franklin atlas²) 또는 횡단면에서 절단된 조직 계열을 사용하여 오벡스와 타겟 사이의 AP 거리를 추정합니다.
      2. ML: 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 참조 아틀라스 또는 조직 시리즈를 사용하여 오벡스와 표적 사이의 ML 거리를 추정합니다.
      3. DV: AP 및 ML 목표 지점에서 뇌 또는 소뇌의 표면을 기준으로 좌표를 추정합니다. 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 기준 아틀라스 또는 조직 계열을 사용하여 원하는 AP 및 ML 좌표와 대상에서 뇌간 표면 사이의 거리를 추정합니다.
   2. 꼬리에서 오벡스까지의 목표 거리 <0.4mm(그림 1B, 주황색)의 경우 다음을 수행합니다.
      1. AP: 뇌간을 전치하도록 좌표를 조정합니다. 복부 및 로스트랄 좌표의 경우, AP 뇌간 진입점은 표준 평면의 대상 AP 좌표에 비해 더 인과적일 것입니다.
      2. ML: 횡단면에서 절단된 표준 입체택시 기준 아틀라스 또는 조직 계열에서 목표 좌표를 도출합니다. 좌표는 대상 AP 레벨에서 시각화된 중간선에 상대적입니다.
      3. DV: AP 및 ML 목표 지점에서 뇌간 표면을 기준으로 좌표를 추정합니다. 뇌간을 전치 굴곡하도록 DV를 조정하십시오. 복부 및 로스트랄 좌표의 경우, DV 좌표는 표준 평면에서 뇌간장의 등쪽 표면으로부터의 거리보다 큽니다.

8. 표적의 주입

1. 입체택시 암을 사용하여 피펫 또는 주사기를 표적에 내리고 표준 입체택시 접근법과 같이 용액을 주입한다. 주사 후 1-5 분 동안 제자리에 두어 3-50 nL 사이의 부피를 사용할 때 바늘 트랙을 피하십시오. 그런 다음 입체 택시 암을 사용하여 피펫 또는 주사기를 들어 올립니다.
2. 8.1단계를 반복합니다. 여러 대상에 대해.

9. 수술장 폐쇄

1. 수술 현장에서 후크를 조심스럽게 제거하십시오. 쌍을 이룬 장수염 근육은 중립 위치로 되돌아 가서 시스테르나 마그나를 완전히 덮을 것입니다. 봉합사를 잡기에는 너무 약하기 때문에 중간 선의 사다리꼴 근육과 경막은 닫지 마십시오.
2. 세 개의 나일론 또는 폴리프로필렌 봉합사(5-0 또는 6-0)로 피부를 닫습니다.

10. 수술 후 관리

1. 이소플루란을 끄고 스테레오택시 프레임에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 가열 패드의 깨끗한 케이지에 놓고 깨어 있고 움직일 때까지 관찰하십시오.
2. 수술 후 1-3 일에 건강 상태, 체중 및 봉합사를 모니터링하십시오. 아직 제거하지 않은 경우 10 일째에 봉합사를 제거하십시오.

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결과

cisterna magna 접근법은 표준 입체 택시 접근법을 통해 도달하기 어렵거나 일관성없는 타겟팅에 취약한 인과 관계 뇌간 및 상부 자궁 경부 구조 구조를 타겟팅 할 수있게합니다. cisterna magna에 도달하는 수술은 피부 절개, 사다리꼴 근육의 얇은 층 및 경막 매트의 개방을 필요로하므로 생쥐가 잘 견뎌냅니다. 표준 입체 택시 접근법에서와 같이 여러 개의 버 구멍을 뚫을 필요가 없기 때문에 여러...

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토론

표준 입체 택시 수술은 일반적으로 CNS¹에서 표적 부위의 좌표를 계산하기 위해 두개골 랜드 마크에 의존합니다. 그런 다음 대상 사이트는 두개골¹을 통해 뚫린 버 구멍을 통해 액세스됩니다. 이 방법은 표적 부위가 전후 및 등쪽 평면(2)의 두개골 랜드마크로부터 멀리 떨어져 있고 두개골의 해부학 및 근육의 해부학이^{접근에 도전}하기 때...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window