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Neste Artigo

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Resumo

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.

Resumo

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos é comumente guiada por marcos do crânio. O acesso é então obtido através de orifícios de rebarba perfurados através do crânio. Esta abordagem padrão pode ser desafiadora para alvos no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior devido a desafios anatômicos específicos, pois esses locais são distantes de marcos do crânio, levando à imprecisão. Aqui descrevemos uma abordagem estereutílica alternativa através da cisterna magna que tem sido usada para atingir regiões discretas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. A cisterna magna estende-se do osso occipital até o atlas (ou seja, o segundo osso vertebral), é preenchida com fluido cefalorraquidiano, e é coberta por dura mater. Esta abordagem fornece uma rota reprodutível de acesso a estruturas selecionadas do sistema nervoso central (CNS) que são de outra forma difíceis de alcançar devido a barreiras anatômicas. Além disso, permite a visualização direta de marcos do tronco cerebral nas proximidades dos locais alvo, aumentando a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Por fim, essa abordagem oferece uma oportunidade de evitar o cerebelo, que pode ser importante para estudos motores e sensoriais.

Introdução

Cirurgia estereotaxa padrão para atingir locais cerebrais em camundongos1 geralmente envolve fixação do crânio usando um conjunto de barras de ouvido e uma barra de boca. As coordenadas são então estimadas com base em atlas de referência 2,3, e marcos do crânio, ou seja, bregma (o ponto onde as suturas dos ossos frontais e parietal se unem) ou lambda (o ponto onde as suturas dos ossos parietal e occipital se unem; Figura 1A,B). Através de um orifício de rebarba no crânio acima do alvo estimado, a região alvo pode então ser alcançada, seja p....

Protocolo

O autor declara que o protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e quadro estereotaxic

NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. A esterilidade é mantida usando a técnica de ponta estéril.

  1. Instale o braço estereotaxic com uma micropipette ou seringa preenchida com uma opção injetável (vírus associado ao Adeno (AAV) ou rastreador convencional) no quadro estereotaxico e prepare o adaptador do mouse (Figura 2A).
  2. Prepar....

Resultados

A abordagem cisterna magna torna possível atingir estruturas cerebrais caudais e cordões cervicais superiores que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. A cirurgia para chegar à cisterna magna requer incisões da pele, uma fina camada de músculo trapézio, e abertura da dura mater e, portanto, bem tolerada por camundongos. É especialmente eficiente e menos invasivo ao atingir múltiplos locais (longitudinalmente disper.......

Discussão

A cirurgia estereóxica padrão geralmente depende de marcos do crânio para calcular as coordenadas dos locais alvo no CNS1. Os locais alvo são então acessados através de orifícios de rebarba que são perfurados através do crânio1. Este método não é ideal para o tronco cerebral caudal, pois os locais alvo estão localizados distantes dos marcos do crânio nos planos anteroposterior e dorsoventral2 e como a anatomia do crânio e mú.......

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por R01 NS079623, P01 HL149630 e P01 HL095491.

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcohol padMed-Vet InternationalSKU: MDS090735Zskin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45FST11251-35only to grab dura
Betadine padMed-Vet InternationalSKU:PVP-PADskin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugateThermo Fisher Scientific488: C34775, 594: C22842Fluorescent tracer
ClippersWahlModel MC3, 28915-10for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clampKopf1770to hold glass pipette
FlowmeterGilmont instrumentsmodel # 65 MMto regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyreneThermo Fisher ScientificF13080Fluorescent tracer
Heating padStoelting53800Mthermoregulation
Induction chamber with port hook up kitMidmark Inc93805107 92800131chamber providing initial anasthesia
Insulin SyringeExelint International26028to administer saline and analgesic
IsofluraneMed-Vet InternationalSKU:RXISO-250inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizerMidmark Inc91305430apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2FST11223-20only to clean dura
Medical air, compressedLindeUN 1002used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SRZoo Pharm LLCLot # MSR2-211201analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tubeGlobe Scientific Inc51628for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptorStoelting0051625 adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito HemostatsFST91308-12for suturing
Oxygen regulatorLife Support ProductsS/N 909328, lot 092109regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressedLindeUSP UN 1072provided along with isoflurane anasthesia
Plastic cardnot applicablenot applicableany firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)World Precision Instruments (WPI)SYS-PV820For precision solution injection
Saline, sterileMountainside Medical EquipmentH04888-10to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3FST10003-12to hold scalpel
Scissors, WagnerFST14070-12to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying boxFST15002-08scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulatorKopf1760-61attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plateKopf1730-B, 1711frame for surgery
Sterile cotton tipped applicatorsPuritan25-806 10WCabsorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapesHenry Schein9004686for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointmentPuralubeP1490ocular lubricant
Stimulator & TubingGrass Medical InstrumentsS44to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10Med-Vet InternationalSKU: 10SSfor skin incision
Surgical forceps, Extra fine GraefeFST11153-10to hold skin
Surgical glovesMed-Vet InternationalMSG2280Zfor asceptic surgery
Surgical microscopeLeicaModel M320/ F12for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropyleneOasisMV-8661to close the skin
Tegaderm3M3M ID 70200749250provides sterile barrier
Universal Clamp and stand postKopf1725attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostatsFST18200-09, 13003-10to separate muscles and provide surgical window

Referências

  1. JoVE. Rodent Stereotaxic Surgery. JoVE Science Education Database. , (2021).
  2. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
  3. Lein, E. S., et al.

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