Abordagem Cirúrgica Estereotaxic para Microinpor o Tronco Cerebral Caudal e Medula Espinhal Cervical Superior através da Cisterna Magna em Camundongos

Resumo

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos geralmente envolve acesso através dos ossos do crânio e é guiada por marcos do crânio. Aqui descrevemos uma abordagem estereotaxa alternativa para atingir o tronco cerebral caudal e a medula espinhal cervical superior através da cisterna magna que se baseia na visualização direta de marcos do tronco cerebral.

Resumo

A cirurgia estereotaxa para atingir locais cerebrais em camundongos é comumente guiada por marcos do crânio. O acesso é então obtido através de orifícios de rebarba perfurados através do crânio. Esta abordagem padrão pode ser desafiadora para alvos no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior devido a desafios anatômicos específicos, pois esses locais são distantes de marcos do crânio, levando à imprecisão. Aqui descrevemos uma abordagem estereutílica alternativa através da cisterna magna que tem sido usada para atingir regiões discretas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. A cisterna magna estende-se do osso occipital até o atlas (ou seja, o segundo osso vertebral), é preenchida com fluido cefalorraquidiano, e é coberta por dura mater. Esta abordagem fornece uma rota reprodutível de acesso a estruturas selecionadas do sistema nervoso central (CNS) que são de outra forma difíceis de alcançar devido a barreiras anatômicas. Além disso, permite a visualização direta de marcos do tronco cerebral nas proximidades dos locais alvo, aumentando a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Por fim, essa abordagem oferece uma oportunidade de evitar o cerebelo, que pode ser importante para estudos motores e sensoriais.

Introdução

Cirurgia estereotaxa padrão para atingir locais cerebrais em camundongos^{1 geralmente} envolve fixação do crânio usando um conjunto de barras de ouvido e uma barra de boca. As coordenadas são então estimadas com base em atlas de referência ^2,3, e marcos do crânio, ou seja, bregma (o ponto onde as suturas dos ossos frontais e parietal se unem) ou lambda (o ponto onde as suturas dos ossos parietal e occipital se unem; Figura 1A,B). Através de um orifício de rebarba no crânio acima do alvo estimado, a região alvo pode então ser alcançada, seja para entrega de microinjeções ou instrumentação com cânulas ou fibras ópticas. Devido à variação na anatomia dessas suturas e erros na localização de bregma ou lambda ^4,5, a posição de zero pontos em relação ao cérebro varia de animal para animal. Embora pequenos erros de segmentação, que resultem dessa variabilidade, não sejam um problema para alvos grandes ou próximos, seu impacto é maior para áreas menores de interesse que são distantes dos pontos zero nos planos anteroposterior ou dorsoventral e/ou ao estudar animais de tamanho variado devido à idade, tensão e/ou sexo. Existem vários desafios adicionais que são únicos para a medula oblongata e a corda cervical superior. Em primeiro lugar, pequenas alterações nas coordenadas anteroposterioras estão associadas a mudanças significativas nas coordenadas dorsoventra em relação à dura, devido à posição e forma do cerebelo (Figura 1Bi)^2,6,7. Segundo, a corda cervical superior não está contida no crânio². Em terceiro lugar, a posição inclinada do osso occipital e a camada excessiva dos músculos do pescoço² torna a abordagem estereotaxic padrão ainda mais desafiadora para estruturas localizadas perto da transição entre o tronco cerebral e a medula espinhal (Figura 1Bi). Finalmente, muitos alvos de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical são pequenos², exigindo injeções precisas e reprodutíveis ^8,9.

Uma abordagem alternativa através da cisterna magna contorna esses problemas. A cisterna magna é um grande espaço que se estende do osso occipital até o atlas (Figura 1A, ou seja, o segundo osso vertebral)¹⁰. É preenchido com fluido cefalorraquidiano e coberto por dura mater¹⁰. Este espaço entre o osso occipital e o atlas abre quando a anteroflexão da cabeça. Ele pode ser acessado navegando entre as barrigas emparelhadas excessivamente do músculo longus capitis, expondo a superfície dorsal do tronco cerebral caudal. Regiões de interesse podem então ser alvo com base nos marcos dessas regiões se estiverem localizadas perto da superfície dorsal; ou usando o obex, o ponto onde o canal central se abre no ventrículo IV, como ponto zero para que as coordenadas alcancem estruturas mais profundas. Esta abordagem tem sido usada com sucesso em uma variedade de espécies, incluindo o rato¹¹, gato¹², rato ^8,9, e primata não humano¹³ para atingir o grupo respiratório ventral, formação reticular medial medular, o núcleo do trato solitário, área pós-orssal. No entanto, essa abordagem não é amplamente utilizada, pois requer conhecimento de anatomia, um kit de ferramentas especializado e habilidades cirúrgicas mais avançadas em comparação com a abordagem estereotaxa padrão.

Aqui descrevemos uma abordagem cirúrgica passo a passo para alcançar o tronco cerebral e a medula cervical superior através da cisterna magna, visualizamos marcos, definimos o ponto zero (Figura 2), e estimamos e otimizamos coordenadas-alvo para a entrega estereotaxa de microinjeções nas discretas regiões de tronco cerebral e medula espinhal (Figura 3). Em seguida, discutimos as vantagens e desvantagens relacionadas a essa abordagem.

Protocolo

O autor declara que o protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparação de instrumentos cirúrgicos e quadro estereotaxic

NOTA: A cirurgia é realizada em condições assépticas. A esterilidade é mantida usando a técnica de ponta estéril.

1. Instale o braço estereotaxic com uma micropipette ou seringa preenchida com uma opção injetável (vírus associado ao Adeno (AAV) ou rastreador convencional) no quadro estereotaxico e prepare o adaptador do mouse (Figura 2A).
2. Prepare instrumentos cirúrgicos autoclavados (Tabela de materiais) e coloque-os em uma superfície estéril.

2. Indução de anestesia e preparação do rato

1. Ligue O₂ a 0,5 L/min e coloque o vaporizador isoflurane em 4.0, certificando-se de que o fluxo O₂ está na caixa de indução.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que a caixa de indução de isoflurane seja colocada em um capô e que o isoflurane seja retirado do local cirúrgico.
2. Coloque o mouse (C57BL/6J masculino de 10 semanas) na câmara de indução.
3. Uma vez que a respiração tenha diminuído, abra a câmara de indução e levante o rato ligeiramente. Use cortadores para remover o cabelo da cabeça aos ombros.

3. Posicionamento do mouse no quadro estereotaxic

1. Mova o mouse para a estrutura estereotaxa e coloque o nariz em um cone de nariz flexível. Nesta fase, certifique-se de que o fluxo O₂ agora seja direcionado para o cone do nariz.
2. Coloque o mouse no quadro estereotaxic usando apenas barras de ouvido.
   NOTA: Certifique-se de que as barras de ouvido estão uniformes e a cabeça está nivelada.
3. Anteroflexe a cabeça do mouse para um ângulo de 90° guiando manualmente o nariz. Para fixar essa posição, coloque uma barreira plástica entre os pilares da barra de ouvido do adaptador do mouse, paralelamente aos pilares. A parte plana do crânio serve como referência, semelhante à abordagem do crânio plano na cirurgia estereotaxica convencional.
   NOTA: Não flexione sobre a cabeça (ou seja, além de um ângulo de 90° entre o plano do osso frontal do crânio e o plano da superfície da mesa) pois isso impede o fluxo de ar através das vias aéreas superiores. Se o fluxo de ar for impedido, reposicione o mouse, certificando-se de que o corpo esteja suportado sob o porta-malas e uma placa de plástico seja fixado em 90° entre o plano do osso frontal do crânio e o plano da superfície da mesa, conforme descrito na Figura 2A,C.
4. Coloque a almofada de aquecimento por baixo do mouse e, em seguida, certifique-se de que o pescoço e o resto do corpo estão posicionados no mesmo nível (ou seja, aproximadamente 180° ou paralelo à mesa). A caixa de ferramentas que segura a tesoura de mola pode ser usada para levantar o corpo para esta posição.
   NOTA: Este passo é importante à medida que o tronco cerebral caudal e o cordão cervical superior se movem dependendo da posição, em contraste com partes mais rostrais do CNS que são mantidas no lugar pelo crânio.
5. Injete uma única dose de 4 mg/kg meloxicam de liberação lenta (RS) subcutânea (s.c.) a um volume de 2 μL/g de peso corporal e coloque lubrificante nos olhos.
6. Limpe o local de incisão cirúrgica primeiro com uma almofada de preparação de 70% de álcool, depois com uma almofada de preparação betadina, e depois novamente com uma almofada de preparação para álcool e deixe secar.
7. Coloque uma cortina debaixo do corpo.
8. Desinfete as mãos e coloque luvas estéreis.
9. Coloque uma cortina no local cirúrgico.

4. Cirurgia para acesso à cisterna magna

1. Certifique-se de que o mouse está apropriadamente anestesiado, apertando os dedos dos dedos ou verificando o reflexo da córnea.
2. Reduza o isoflurane aos níveis de manutenção (2.0).
3. Faça uma incisão de 1-1,2 cm com lâmina cirúrgica #10 da borda do osso occipital em direção aos ombros em um movimento suave.
4. Faça uma incisão no raphe da linha média do músculo trapézio. Isso expõe os músculos longus capitis emparelhados.
   NOTA: Em camundongos, o músculo trapézio é um músculo muito fino, quase transparente. Certifique-se de ficar na linha média e não cortar nos músculos subjacentes, pois isso causará sangramento desnecessário.
5. Coloque ambos os ganchos retraídos entre os músculos longus capitis emparelhados, um orientado para a esquerda e outro para a direita. O peso dos hemostatas proporciona tensão aos ganchos retráteis que podem ser modificados reajustando a posição dos hemostates.
6. Posicione o microscópio cirúrgico no lugar para visualizar melhor o campo cirúrgico.
7. Use os fórceps de laminectomia contundente para separar as barrigas esquerda e direita do músculo longus capitis emparelhado, a partir da occiput, onde a linha média é prontamente visível. Guie os fórceps contundentes através do osso da occiput na linha média até onde ele encontra a dura gêmea cisterna, e, em seguida, continuar através da dura mater para o atlas.
   NOTA: Não há necessidade de cortar os músculos longus capitis emparelhados, pois nada os mantém unidos na linha média; fazendo isso causará sangramento desnecessário.
8. Reposicione os retratores e ajuste a tensão reposicionando os hemostatos, abrindo a visão da cisterna magna.
9. Use os fórceps de laminectomia contundente para separar os músculos ainda mais na linha média para obter uma boa janela de visualização do tronco cerebral e cerebelo.
10. Repita os passos 4.7-4.9 conforme necessário até que o cerebelo e o tronco cerebral venham em vista abaixo da dura.
11. Usando fórceps de laminectomia contundente, limpe a dura dura dos pequenos fios do tecido conjuntivo movendo os fórceps da linha média em direção lateral, até que haja uma visão clara do tronco cerebral e para criar mais espaço lateral, conforme necessário para o alvo.

5. Abertura da membrana cisterna

1. Use as fórceps Dumont angulares (#4/45) para pegar a dura, que se estende do osso occipital até o atlas. Pegue a dura dura perto do osso occipital e use a tesoura de mola para fazer uma pequena abertura (~0,5 a 1,5 mm) na dura.
   NOTA: Neste local rostral, o espaço entre o tronco cerebral e a dura sobrelaçada é mais amplo, proporcionando amplo espaço para uma manipulação segura da dura.
2. Use a tesoura de mola para levantar a dura e abrir ainda mais a dura. O tamanho da janela depende do alvo.
   NOTA: Uma janela maior será necessária ao fazer múltiplas injeções longitudinais ou injeções bilaterais; uma pequena janela será suficiente ao fazer injeções unilaterais ou médias únicas.
3. Uma vez aberto o dura, escorra o excesso de fluido cefalorraquidiano com uma ponta de sinalização estéril.

6. Identificação de marcos e ponto zero

1. Veja a superfície dorsal do tronco cerebral com marcos detalhados através da dura abertura. O obex, o ponto onde o canal central se abre para o ventrículo IV, é o ponto zero anterior-posterior e mediolateral padrão.

7. Coordenadas de alvo

NOTA: Para vários alvos, incluímos uma lista de coordenadas padrão com coordenadas posteriores anteriores (AP) e mediolateral (ML) relativas às coordenadas bregma e cisterna magna de ponto zero com coordenadas AP e ML relativas a zero ponto obex para facilitar a transição entre metodologias (Tabela 1). As coordenadas dorsoventral (DV) são relativas à superfície do cérebro ou cerebelo (abordagem padrão) ou à superfície do tronco cerebral ou da cordão cervical superior (abordagem cisterna magna) no ponto de entrada de AP e ML. O planejamento deve ser feito antes da cirurgia.

1. Use os três conjuntos de coordenadas para determinar o alvo: AP, ML e DV. Devido à posição da cabeça, a orientação relativa das estruturas do tronco cerebral varia de acordo com a localização.
   1. Para a distância alvo >0,4 mm de caudal para o obex (Figura 1B, verde) realizar o seguinte.
      1. AP: Use qualquer atlas de referência estereotaxic padrão (por exemplo, Paxinos e Franklin atlas²) ou série de tecido cortado no plano transversal para estimar a distância AP entre o obex e o alvo.
      2. ML: Use qualquer atlas de referência estereotaxic padrão ou corte de tecido no plano transversal para estimar a distância ML entre o obex e o alvo.
      3. DV: Estimar coordenadas relativas à superfície do cérebro ou cerebelo no ponto alvo AP e ML. Use qualquer atlas de referência estereóxica padrão ou série de tecido cortado no plano transversal para estimar a distância entre a superfície do tronco cerebral nas coordenadas AP e ML desejadas e no alvo.
   2. Para a distância alvo <0,4 mm de caudal para o obex (Figura 1B, laranja) realizar o seguinte.
      1. AP: Ajuste as coordenadas para explicar a anteroflexão do tronco cerebral. Para coordenadas ventral e rostral, o ponto de entrada do brainstem AP será mais caudal em relação à coordenada AP alvo no plano padrão.
      2. ML: Obtenha coordenadas de destino de um atlas de referência estereóxica padrão ou corte de série de tecidos no plano transversal. As coordenadas serão relativas à linha média visualizada no nível AP alvo.
      3. DV: Estimar coordenadas relativas à superfície do tronco cerebral no ponto alvo AP e ML. Ajuste DV para explicar a anteroflexão do tronco cerebral. Para coordenadas ventral e rostral, as coordenadas DV serão maiores do que a distância da superfície dorsal do tronco cerebral no plano padrão.

8. Injeção do alvo

1. Abaixe a pipeta ou a seringa para o alvo usando o braço estereotaxic e injete solução como para abordagens estereotaxas padrão. Deixe no lugar por 1-5 minutos após a injeção, para evitar uma pista de agulha ao usar volumes entre 3-50 nL. Em seguida, levante a pipeta ou a seringa usando o braço estereotaxic.
2. Repita o passo 8.1. para vários alvos.

9. Encerramento do campo cirúrgico

1. Remova os ganchos cuidadosamente do campo cirúrgico. Os músculos longus capitis emparelhados cairão de volta em uma posição neutra, cobrindo totalmente a cisterna magna. Não feche o músculo trapézio e a dura-costura na linha média, pois eles são muito frágeis para segurar suturas.
2. Feche a pele com três suturas de nylon ou polipropileno (5-0 ou 6-0).

10. Cuidados pós-operatórios

1. Desligue isoflurane e remova o mouse do quadro estereotaxic. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento e observe até acordar e se mover.
2. Monitore o estado de saúde, o peso e as suturas nos dias pós-operatórios 1-3. Remova as suturas no dia 10 se ainda não for removido.

Resultados

A abordagem cisterna magna torna possível atingir estruturas cerebrais caudais e cordões cervicais superiores que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. A cirurgia para chegar à cisterna magna requer incisões da pele, uma fina camada de músculo trapézio, e abertura da dura mater e, portanto, bem tolerada por camundongos. É especialmente eficiente e menos invasivo ao atingir múltiplos locais (longitudinalmente disper...

Discussão

A cirurgia estereóxica padrão geralmente depende de marcos do crânio para calcular as coordenadas dos locais alvo no CNS¹. Os locais alvo são então acessados através de orifícios de rebarba que são perfurados através do crânio¹. Este método não é ideal para o tronco cerebral caudal, pois os locais alvo estão localizados distantes dos marcos do crânio nos planos anteroposterior e dorsoventral² e como a anatomia do crânio e mú...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window