Farelerde Cisterna Magna ile Kaudal Beyin Sapı ve Üst Servikal Omuriliğin Mikroenjekte Edilmesine Stereotaksik Cerrahi Yaklaşım

Özet

Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için stereotaksik cerrahi genellikle kafatası kemiklerinden erişimi içerir ve kafatası yer işaretleri tarafından yönlendirilir. Burada, beyin sapı yer işaretlerinin doğrudan görselleştirilmesine dayanan sarnıç magna aracılığıyla kaudal beyin sapı ve üst servikal omuriliği hedeflemek için alternatif bir stereotaksik yaklaşımı özetlemekteyiz.

Özet

Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için stereotaksik cerrahi genellikle kafatası yer işaretleri tarafından yönlendirilir. Erişim daha sonra kafatasından delinmiş çapak delikleri aracılığıyla elde edilir. Bu standart yaklaşım, belirli anatomik zorluklar nedeniyle kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki hedefler için zorlayıcı olabilir, çünkü bu bölgeler kafatası yer işaretlerinden uzaktır ve belirsizliğe yol açar. Burada, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki ayrı ilgi bölgelerini hedeflemek için kullanılan cisterna magna aracılığıyla alternatif bir stereotaksik yaklaşımı özetlemekteyiz. Sarnıç magna, oksipital kemikten atlasa (yani ikinci vertebral kemiğe) kadar uzanır, beyin omurilik sıvısı ile doldurulur ve dura mater ile kaplanır. Bu yaklaşım, anatomik engeller nedeniyle ulaşılması zor olan seçilmiş merkezi sinir sistemi (CNS) yapılarına yeniden üretilebilir bir erişim yolu sağlar. Ayrıca, beyin sapı işaretlerinin hedef bölgelere yakın bir yerde doğrudan görselleştirilmesine izin vererek, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordondaki sınırlı ilgi alanlarına küçük enjeksiyon hacimleri verirken doğruluğu arttırır. Son olarak, bu yaklaşım, motor ve sensorimotor çalışmalar için önemli olabilecek beyincikten kaçınmak için bir fırsat sağlar.

Giriş

Farelerde beyin bölgelerini hedeflemek için standart stereotaksik cerrahi¹ genellikle kafatasının bir dizi kulak çubuğu ve bir ağız çubuğu kullanılarak sabitlenmesini içerir. Koordinatlar daha sonra referans atlasları ^2,3 ve kafatası yer işaretlerine, yani bregma (frontal ve parietal kemiklerin dikişlerinin bir araya geldiği nokta) veya lambda (parietal ve oksipital kemiklerin dikişlerinin bir araya geldiği nokta; Şekil 1A,B). Tahmini hedefin üzerindeki kafatasına bir çapak deliğinden sonra, mikroenjeksiyonların verilmesi veya kanüller veya optik fiberlerle enstrümantasyon için hedef bölgeye ulaşılabilir. Bu dikişlerin anatomisindeki farklılıklar ve bregma veya lambda ^4,5'in lokalizasyonundaki hatalar nedeniyle^, sıfır noktalarının beyne göre konumu hayvandan hayvana değişir. Bu değişkenlikten kaynaklanan hedeflemedeki küçük hatalar, büyük veya yakın hedefler için bir sorun olmasa da, etkileri, anteroposterior veya dorsoventral düzlemlerdeki sıfır noktalarından uzak olan ve / veya yaş, gerginlik ve / veya cinsiyet nedeniyle değişen büyüklükteki hayvanları incelerken daha küçük ilgi alanları için daha büyüktür. Medulla oblongata ve üst servikal kordon için benzersiz olan birkaç ek zorluk vardır. İlk olarak, anteroposterior koordinatlardaki küçük değişiklikler, beyinciğin konumu ve şekli nedeniyle duraya göre dorsoventral koordinatlardaki önemli değişikliklerle ilişkilidir (Şekil 1Bi)^2,6,7. İkincisi, üst servikal kordon kafatası² içinde yer almaz. Üçüncüsü, oksipital kemiğin eğimli pozisyonu ve boyun kaslarının üst tabakası^2, beyin sapı ve omurilik arasındaki geçişin yakınında bulunan yapılar için standart stereotaksik yaklaşımı daha da zorlaştırmaktadır (Şekil 1Bi). Son olarak, kaudal beyin sapı ve servikal kordona ilgi duyan birçok hedef küçük^2'dir ve hassas ve tekrarlanabilir enjeksiyonlar gerektirir ^8,9.

Sarnıç magna aracılığıyla alternatif bir yaklaşım bu sorunları aşar. Sarnıç magna, oksipital kemikten atlasa kadar uzanan geniş bir alandır (Şekil 1A, yani ikinci omur kemiği)¹⁰. Beyin omurilik sıvısı ile doldurulur ve dura mater¹⁰ ile kaplanır. Oksipital kemik ve atlas arasındaki bu boşluk, kafayı anteroflekleştirdiğinde açılır. Longus capitis kasının üstteki eşleştirilmiş karınları arasında gezinerek ve kaudal beyin sapının dorsal yüzeyini açığa çıkararak erişilebilir. İlgilenilen bölgeler daha sonra sırt yüzeyinin yakınında bulunuyorlarsa, bu bölgelerin işaretlerine dayanarak hedeflenebilir; veya obeksi kullanarak, merkezi kanalın IV ventriküle açıldığı nokta, koordinatların daha derin yapılara ulaşması için sıfır noktası olarak. Bu yaklaşım, ventral solunum grubunu, medüller medial retiküler oluşumu, soliter sistemin çekirdeğini, alan postremasını veya hipoglossal çekirdeği hedeflemek için sıçan^{11, kedi 12}, fare ^8,9 ve insan dışı primat 13 dahil olmak üzere çeşitli türlerde başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, anatomi bilgisi, özel bir araç seti ve standart stereotaksik yaklaşıma kıyasla daha gelişmiş cerrahi beceriler gerektirdiği için yaygın olarak kullanılmamaktadır.

Burada, sarnıç magna yoluyla beyin sapına ve üst servikal kordona ulaşmak, yer işaretlerini görselleştirmek, sıfır noktasını ayarlamak (Şekil 2) ve mikroenjeksiyonların stereotaksik olarak verilmesi için hedef koordinatları tahmin etmek ve optimize etmek için adım adım cerrahi bir yaklaşımı açıklıyoruz (Şekil 3). Daha sonra bu yaklaşımla ilgili avantaj ve dezavantajları tartışacağız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Yazar, protokolün Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini izlediğini beyan eder.

1. Cerrahi aletlerin ve stereotaksik çerçevenin hazırlanması

NOT: Ameliyat aseptik koşullar altında yapılır. Sterilite steril uç tekniği kullanılarak korunur.

1. Stereotaksik kolu, stereotaksik çerçeveye enjekte edilebilir bir seçenek (adeno ilişkili virüs (AAV) veya geleneksel izleyici) ile doldurulmuş bir mikropipet veya şırınga ile takın ve fare adaptörünü hazırlayın (Şekil 2A).
2. Otoklavlanmış cerrahi aletler hazırlayın (Malzeme tablosu) ve steril bir yüzeye yerleştirin.

2. Anestezi indüksiyonu ve fare hazırlığı

1. O_2'yi 0,5 L/dak'da açın ve izofluran buharlaştırıcıyı 4,0'a ayarlayarak_O2 akışının indüksiyon kutusuna olduğundan emin olun.
   DİKKAT: İzofluran indüksiyon kutusunun bir davlumbaza yerleştirildiğinden ve izofluran'ın cerrahi bölgeden uzaklaştırıldığından emin olun.
2. Fareyi (10 haftalık erkek C57BL/6J) indüksiyon odasına yerleştirin.
3. Solunum yavaşladığında, indüksiyon odasını açın ve fareyi hafifçe kaldırın. Saçları baştan omuzlara çıkarmak için makas kullanın.

3. Farenin stereotaksik çerçevede konumlandırılması

1. Fareyi stereotaksik çerçeveye hareket ettirin ve burnu esnek bir burun konisine yerleştirin. Bu aşamada,_O2 akışının artık burun konisine yönlendirildiğinden emin olun.
2. Fareyi yalnızca kulak çubuklarını kullanarak stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
   NOT: Kulak çubuklarının düz ve başın düz olduğundan emin olun.
3. Anteroflex, burnu manuel olarak yönlendirerek farenin başını 90° açıyla bükün. Bu konumu korumak için, fare adaptörünün kulak çubuğu sütunları arasına, sütunlara paralel olarak plastik bir bariyer yerleştirin. Kafatasının düz kısmı, geleneksel stereotaksik cerrahideki düz kafatası yaklaşımına benzer şekilde referans görevi görür.
   NOT: Kafayı aşırı esnetmeyin (yani frontal kafatası kemiğinin düzlemi ile masanın yüzeyinin düzlemi arasındaki 90°'lik bir açının ötesinde), çünkü bu, üst solunum yolundan hava akışını engeller. Hava akımı engellenirse, fareyi yeniden konumlandırın, gövdenin gövdenin altında desteklendiğinden ve plastik bir kartın ön kafatası kemiğinin düzlemi ile Şekil 2A, C'de belirtildiği gibi tablonun yüzeyinin düzlemi arasında 90 ° 'ye ayarlandığından emin olun.
4. Isıtma yastığını farenin altına yerleştirin ve ardından boynun ve vücudun geri kalanının aynı seviyede (yani yaklaşık 180 ° veya masaya paralel olarak) konumlandırıldığından emin olun. Yaylı makası tutan alet kutusu, gövdeyi bu konuma kaldırmak için kullanılabilir.
   NOT: Bu adım, kaudal beyin sapı ve üst servikal kordon, kafatası tarafından yerinde tutulan CNS'nin daha fazla rostral kısmının aksine, pozisyona bağlı olarak hareket ettiğinden önemlidir.
5. 4 mg / kg'lık tek bir doz Meloksikam yavaş salınımlı (SR) deri altından (SC) 2 μL / g vücut ağırlığı hacminde enjekte edin ve gözlere kayganlaştırıcı yerleştirin.
6. Cerrahi kesi bölgesini önce %70 alkol hazırlama pediyle, sonra betadin hazırlama pediyle ve sonra tekrar alkol hazırlama pediyle temizleyin ve kurumaya bırakın.
7. Vücudun altına bir örtü yerleştirin.
8. Ellerinizi dezenfekte edin ve steril eldivenler giyin.
9. Cerrahi bölgeye bir örtü yerleştirin.

4. Sarnıç magnasına erişmek için ameliyat

1. Ayak parmaklarını sıkıştırarak veya kornea refleksini kontrol ederek farenin uygun şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
2. İzofluranı bakım seviyelerine indirin (2.0).
3. Oksipital kemiğin kenarından omuzlara doğru 10 numaralı cerrahi bıçakla tek bir yumuşak hareketle 1-1.2 cm'lik bir kesi yapın.
4. Trapezius kasının orta hat raphesinde bir kesi yapın. Bu, eşleştirilmiş longus kapitis kaslarını açığa çıkarır.
   NOT: Farelerde, trapezius kası çok ince, neredeyse şeffaf bir kastır. Orta hatta kaldığınızdan emin olun ve gereksiz kanamaya neden olacağından altta yatan kasları kesmeyin.
5. Her iki retraktör kancasını da eşleştirilmiş longus kapitis kasları arasına yerleştirin, biri sola, diğeri sağa yönlendirilmiştir. Hemostatların ağırlığı, hemostatların pozisyonunun yeniden ayarlanmasıyla değiştirilebilen retraktör kancalarına gerginlik sağlar.
6. Cerrahi alanı daha iyi görselleştirmek için cerrahi mikroskopu yerine yerleştirin.
7. Eşleştirilmiş longus kapitis kasının sol ve sağ karnını, orta hattın kolayca görülebildiği oksiputtan başlayarak ayırmak için künt laminektomi forsepslerini kullanın. Künt forsepsleri orta çizgideki oksiput kemiği boyunca sarnıç dura mater ile buluştuğu yere kadar yönlendirin ve ardından dura mater boyunca atlasa doğru devam edin.
   NOT: Eşleştirilmiş longus kapitis kaslarını kesmeye gerek yoktur, çünkü hiçbir şey onları orta hatta bir arada tutmaz; bunu yapmak gereksiz kanamaya neden olur.
8. Retraktörleri yeniden konumlandırın ve hemostatları yeniden konumlandırarak gerginliği ayarlayın, sarnıç magna görünümünü açın.
9. Beyin sapı ve beyinciğin iyi bir görüntüleme penceresini elde etmek için orta hatta kasları daha da ayırmak için künt laminektomi forsepslerini kullanın.
10. Beyincik ve beyin sapı duranın altında görünene kadar 4.7-4.9 arasındaki adımları gerektiği gibi tekrarlayın.
11. Künt laminektomi forseps kullanarak, forsepsleri orta hattan lateral yönde hareket ettirerek, beyin sapının net bir görünümü olana kadar ve hedef için gerektiği gibi daha fazla yanal alan oluşturmak için küçük bağ dokusu iplikçiklerinin durasını temizleyin.

5. Sarnıç zarının açılması

1. Oksipital kemikten atlasa kadar uzanan durayı yakalamak için açılı Dumont forsepslerini (#4/45) kullanın. Dura'yı oksipital kemiğin yakınında tutun ve durada küçük bir açıklık (~ 0,5 ila 1,5 mm) yapmak için yay makasını kullanın.
   NOT: Bu rostral konumda, beyin sapı ile üstteki dura arasındaki boşluk en geniştir ve duranın güvenli bir şekilde manipüle edilmesi için yeterli alan sağlar.
2. Durayı kaldırmak ve durayı daha da açmak için yaylı makası kullanın. Pencerenin boyutu hedefe bağlıdır.
   NOT: Birden fazla uzunlamasına enjeksiyon veya bilateral enjeksiyon yaparken daha büyük bir pencereye ihtiyaç duyulacaktır; tek taraflı veya orta hat enjeksiyonları yapılırken küçük bir pencere yeterli olacaktır.
3. Dura açıldıktan sonra, fazla beyin omurilik sıvısını steril bir ipucu ucu ile boşaltın.

6. Yer işaretlerinin ve sıfır noktasının tanımlanması

1. Beyin sapının sırt yüzeyini, açık dura boyunca ayrıntılı işaretlerle görüntüleyin. Merkezi kanalın IV ventriküle açıldığı nokta olan obeks, standart ön-arka ve mediolateral sıfır noktasıdır.

7. Hedef koordinatları

NOT: Çeşitli hedefler için, metodolojiler arasındaki geçişi kolaylaştırmak için sıfır noktası bregma'ya göre anterior posterior (AP) ve mediolateral (ML) koordinatları ve sıfır noktası obex'e göre AP ve ML koordinatları ile cisterna magna koordinatları içeren standart koordinatların bir listesini ekledik (Tablo 1). Dorsoventral (DV) koordinatlar, AP ve ML giriş noktasındaki beyin veya beyincik yüzeyine (standart yaklaşım) veya beyin sapı veya üst servikal kordonun yüzeyine (sarnıç magna yaklaşımı) göredir. Ameliyat öncesi planlama yapılmalıdır.

1. Hedefi belirlemek için üç koordinat kümesini kullanın: AP, ML ve DV. Baş pozisyonu nedeniyle, beyin sapı yapılarının göreceli oryantasyonu konuma göre değişir.
   1. Hedef mesafe >0,4 mm için kaudalden obekse (Şekil 1B, yeşil) aşağıdakileri gerçekleştirin.
      1. AP: Obex ve hedef arasındaki AP mesafesini tahmin etmek için herhangi bir standart stereotaksik referans atlası (örneğin, Paxinos ve Franklin atlas²) veya enine düzlemde kesilmiş doku serilerini kullanın.
      2. ML: Obex ve hedef arasındaki ML mesafesini tahmin etmek için enine düzlemde kesilmiş herhangi bir standart stereotaksik referans atlası veya doku serisini kullanın.
      3. DV: AP ve ML hedef noktasındaki beyin veya beyincik yüzeyine göre koordinatları tahmin edin. İstenilen AP ve ML koordinatlarındaki beyin sapı yüzeyi ile hedef arasındaki mesafeyi tahmin etmek için enine düzlemde kesilmiş herhangi bir standart stereotaksik referans atlası veya doku serisini kullanın.
   2. Hedef mesafe için <0,4 mm kaudalden obekse (Şekil 1B, turuncu) aşağıdakileri gerçekleştirin.
      1. AP: Beyin sapının anterofleksiyonunu hesaba katmak için koordinatları ayarlayın. Ventral ve rostral koordinatlar için, AP beyin sapı giriş noktası, standart düzlemdeki hedef AP koordinatına göre daha kaudal olacaktır.
      2. ML: Hedef koordinatları standart bir stereotaksik referans atlasından veya enine düzlemde kesilmiş doku serilerinden türetin. Koordinatlar, hedef AP düzeyinde görselleştirilmiş orta hatta göre olacaktır.
      3. DV: AP ve ML hedef noktasındaki beyin sapının yüzeyine göre koordinatları tahmin edin. DV'yi beyin sapının anterofleksiyonunu hesaba katacak şekilde ayarlayın. Ventral ve rostral koordinatlar için, DV koordinatları standart düzlemde beyin sapının dorsal yüzeyinden olan mesafeden daha büyük olacaktır.

8. Hedefin enjeksiyonu

1. Stereotaksik kolu kullanarak pipeti veya şırıngayı hedefe indirin ve standart stereotaksik yaklaşımlarda olduğu gibi çözelti enjekte edin. 3-50 nL arasındaki hacimleri kullanırken iğne izinden kaçınmak için enjeksiyondan sonra 1-5 dakika yerinde bırakın. Ardından, stereotaksik kolu kullanarak pipeti veya şırıngayı kaldırın.
2. 8.1. adımı yineleyin. birden fazla hedef için.

9. Cerrahi alanın kapatılması

1. Kancaları cerrahi alandan dikkatlice çıkarın. Eşleştirilmiş longus kapitis kasları, sarnıç magnasını tamamen kaplayan nötr bir pozisyona geri dönecektir. Trapezius kasını ve orta hatta dura mater'i kapatmayın, çünkü dikişleri tutmak için çok kırılgandırlar.
2. Cildi üç naylon veya polipropilen sütürle kapatın (5-0 veya 6-0).

10. Ameliyat sonrası bakım

1. İzofluranı kapatın ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın. Fareyi bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese yerleştirin ve uyanana ve hareket edene kadar gözlemleyin.
2. Ameliyat sonrası 1-3. günlerde sağlık durumunu, ağırlığı ve dikişleri izleyin. Dikişleri daha önce alınmamışsa 10. günde çıkarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sarnıç magna yaklaşımı, standart stereotaksik yaklaşımlarla ulaşılması zor olan veya tutarsız hedeflemeye eğilimli olan kaudal beyin sapı ve üst servikal kord yapılarını hedeflemeyi mümkün kılar. Sarnıç magnasına ulaşma ameliyatı, cildin insizyonlarını, ince bir trapezius kası tabakasını ve dura materin açılmasını gerektirir ve bu nedenle fareler tarafından iyi tolere edilir. Standart stereotaksik yaklaşımlarda olduğu gibi birden fazla çapak deliğinin delinmesini gerektirm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Standart stereotaksik cerrahi, CNS^1'deki hedef bölgelerin koordinatlarını hesaplamak için genellikle kafatası işaretlerine dayanır. Hedef bölgelere daha sonra kafatası^1'den delinen çapak delikleri aracılığıyla erişilir. Bu yöntem, kaudal beyin sapı için ideal değildir, çünkü hedef bölgeler anteroposterior ve dorsoventral düzlemlerdeki kafatası işaretlerinden uzakta bulunur² ve kafatası ve üstteki kasların anatomi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol pad	Med-Vet International	SKU: MDS090735Z	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Angled forceps, Dumont #5/45	FST	11251-35	only to grab dura
Betadine pad	Med-Vet International	SKU:PVP-PAD	skin preparation for the prevention of surgical site infection
Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	488: C34775, 594: C22842	Fluorescent tracer
Clippers	Wahl	Model MC3, 28915-10	for shaving fur at surgical site
Electrode holder with corner clamp	Kopf	1770	to hold glass pipette
Flowmeter	Gilmont instruments	model # 65 MM	to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane
Fluorescent microspheres, polystyrene	Thermo Fisher Scientific	F13080	Fluorescent tracer
Heating pad	Stoelting	53800M	thermoregulation
Induction chamber with port hook up kit	Midmark Inc	93805107 92800131	chamber providing initial anasthesia
Insulin Syringe	Exelint International	26028	to administer saline and analgesic
Isoflurane	Med-Vet International	SKU:RXISO-250	inhalant anesthetic
Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer	Midmark Inc	91305430	apparatus for inhalant anesthetic delivery
Laminectomy forceps, Dumont #2	FST	11223-20	only to clean dura
Medical air, compressed	Linde	UN 1002	used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection
Meloxicam SR	Zoo Pharm LLC	Lot # MSR2-211201	analgesic
Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube	Globe Scientific Inc	51628	for transfection of material to designated co-ordinates
Mouse adaptor	Stoelting	0051625	adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery
Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats	FST	91308-12	for suturing
Oxygen regulator	Life Support Products	S/N 909328, lot 092109	regulate oxygen levels from oxygen tank
Oxygen tank, compressed	Linde	USP UN 1072	provided along with isoflurane anasthesia
Plastic card	not applicable	not applicable	any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card)
Pneumatic PicoPump ( or similar)	World Precision Instruments (WPI)	SYS-PV820	For precision solution injection
Saline, sterile	Mountainside Medical Equipment	H04888-10	to replace body fluids lost during surgery
Scalpel handle, #3	FST	10003-12	to hold scalpel
Scissors, Wagner	FST	14070-12	to cut polypropylene suture
Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box	FST	15002-08	scissors only to open dura, box to elevate body
Stereotactic micromanipulator	Kopf	1760-61	attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates
Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate	Kopf	1730-B, 1711	frame for surgery
Sterile cotton tipped applicators	Puritan	25-806 10WC	absorbing blood from surgical field
Sterile non-fenestrated drapes	Henry Schein	9004686	for sterile surgical field
Sterile opthalmic ointment	Puralube	P1490	ocular lubricant
Stimulator & Tubing	Grass Medical Instruments	S44	to provide controlled presurred air for precision solution injection
Surgical Blade #10	Med-Vet International	SKU: 10SS	for skin incision
Surgical forceps, Extra fine Graefe	FST	11153-10	to hold skin
Surgical gloves	Med-Vet International	MSG2280Z	for asceptic surgery
Surgical microscope	Leica	Model M320/ F12	for 5X-40X magnification of surgical site
Suture 5-0 polypropylene	Oasis	MV-8661	to close the skin
Tegaderm	3M	3M ID 70200749250	provides sterile barrier
Universal Clamp and stand post	Kopf	1725	attached to stereotactic U frame and intracellular base plate
Wound hook with hartman hemostats	FST	18200-09, 13003-10	to separate muscles and provide surgical window