测量成年小鼠急性纹状体切片中的耗氧率

摘要

耗氧率（OCR）是线粒体功能的常见代理，可用于研究不同的疾病模型。我们开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR，该方法比其他方法更具生理相关性。

摘要

线粒体在细胞ATP产生，活性氧调节和Ca^{2 +} 浓度控制中起重要作用。线粒体功能障碍与多种神经退行性疾病的发病机制有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病。为了研究线粒体在这些疾病的模型中的作用，我们可以通过耗氧率（OCR）作为线粒体功能的代表来测量线粒体呼吸。OCR已经在细胞培养物以及分离的线粒体中成功测量。然而，与在急性脑切片中测量OCR相比，这些技术在生理上的相关性较低。为了克服这一限制，作者开发了一种使用Seahorse XF分析仪的新方法，直接测量成年小鼠急性纹状体切片中的OCR。该技术经过优化，重点是纹状体，纹状体是参与PD和亨廷顿舞蹈症的大脑区域。该分析仪使用24孔板进行活细胞测定，允许同时测量24个样品的动力学。该方法使用圆形打孔的纹状体脑切片作为样品。我们通过鉴定PD小鼠模型纹状体切片中较低的基础OCR来证明该技术的有效性。这种方法将引起从事PD和亨廷顿舞蹈症研究领域的研究人员的广泛兴趣。

引言

线粒体功能障碍与几种神经系统疾病有关，包括帕金森病（PD），亨廷顿病和阿尔茨海默病^1，2，3。PD模型如PINK1敲除（KO）小鼠和大鼠显示线粒体功能受损^{4，5，6，7，8，9，10，11}。从纹状体（STR）或老年PINK1 KO小鼠的全脑分离的线粒体在复合物I^{7，10，12，13}中表现出缺陷。直接测量耗氧率（OCR）是评估线粒体功能的最常用方法之一，因为OCR与ATP产生相结合，ATP是线粒体¹⁴的主要功能。因此，在疾病模型或患者来源的样本/组织中测量OCR可以帮助研究线粒体功能障碍如何导致疾病。

目前，测量线粒体OCR的方法有几种，包括Clark电极和其他_O2电极，O₂荧光染料，以及细胞外通量分析仪^{15，16，17，18，19}。作为一个优点，基于O₂电极的方法允许轻松添加各种基板。然而，它们不足以同时测量多个样品。与传统的基于O₂电极的方法相比，细胞外通量分析仪是细胞培养物或纯化线粒体中常用的OCR工具，可提高通量^15，18，20。然而，所有这些方法通常用于测量分离的线粒体或细胞培养物^{6，16，17，19，20，21}中的OCR。线粒体的分离导致无意的损害，并且提取的线粒体或细胞培养物在生理上的相关性低于完整的脑切片²²。即使将微电极用于切片中，它们也比培养细胞²³更不敏感且更难以操作。

为了应对这些挑战，我们开发了一种使用XF24细胞外通量分析仪的方法，该方法允许分析来自小鼠²⁴急性纹状体脑切片的多种代谢参数。该技术通过OCR提供线粒体呼吸的连续直接定量。简而言之，将小部分纹状体脑切片放入胰岛板的孔中，分析仪使用基于氧和质子荧光的生物传感器测量OCR和细胞外酸化速率，分别为^17，21，25。

分析仪的独特功能之一是四个进样孔，允许继续测量OCR，同时按顺序进样多达四种化合物或试剂。这样可以测量几个细胞呼吸参数，例如基础线粒体OCR，ATP连接OCR和最大线粒体OCR。在测量此处显示的方案期间注入的化合物是第一个溶液孔（端口A）中10 mM丙酮酸盐的工作浓度，第二个溶液孔（端口B）中20μM寡霉素的工作浓度，第三孔（端口C）中的10μM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）和第四孔（端口D）中20μM抗霉素A， 基于弗里德等人²⁵。必须注意的是，这些浓度是工作浓度，分别将10x，11x，12x和13x的储备溶液注入溶液端口A至D。使用每种溶液的目的是:1）丙酮酸盐是必要的，因为没有它，FCCP的添加将因可用底物的限制而降低OCR响应;2）寡霉素抑制ATP合酶并允许测量ATP连锁呼吸;3）FCCP将氧化与磷酸化解耦，并允许测量最大线粒体容量;4）抗霉素A抑制电子传递链中的复合物III，因此允许测量与线粒体无关的OCR。

根据以下原因确定使用的寡霉素浓度:1）大多数细胞类型（分离的线粒体或细胞培养物）的寡霉素推荐剂量为1.5μM。根据经验，通常将解离细胞剂量的3x-10x用于切片实验，因为可能存在梯度，并且切片中溶液的渗透需要时间。因此，浓度应在5μM至25μM的范围内。由于寡霉素的非特异性毒性，没有尝试更高的浓度。3）在Underwood等人的报告中^，作者对寡霉素进行了滴定实验，发现6.25，12.5，25和50μg/ mL的剂量导致类似的抑制。较高浓度的寡霉素（50μg/mL）不会抑制更多，但具有更大的差异。4）在我们的观察中，决定因素似乎是寡霉素的穿透能力。寡霉素很难穿透组织，这就是为什么至少需要7到8个周期才能达到平台，最大的反应。只要它到达高原，就假定抑制是最大的。

调整细胞外通量分析仪以测量纹状体切片中的OCR的一个关键技术挑战是防止组织缺氧。由于缓冲液在整个测量期间（约4小时）没有含氧，缺氧是一个核心问题。对于较厚的组织样品尤其如此，其中氧气不能扩散到整个样品中。为了克服这个问题，切片以150μm的厚度切片，以便环境氧气可以穿透大脑切片的中间。此外，将4 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）加入到预含氧人工脑脊液（ACSF）缓冲液中，这有助于测定最大OCR，如前所述²³。我们检查了细胞是否存活。首先，使用Hoechst 33258（10μM）和碘化丙啶（10μM）来检查细胞在这些条件下是否健康。然后，我们使用膜片钳记录检查中等多棘神经元的功能是否健康。我们通过使用快速扫描伏安法测量DA释放，进一步评估纹状体切片中的多巴胺（DA）末端是否功能健康。结果显示，未含氧的纹状体切片（ACSF/BSA组）与含氧对照组²⁴一样健康。

然后，我们测试了切片厚度和冲头尺寸的不同组合，以确定通量呼吸测定的最佳纹状体切片条件。使用分析仪对不同厚度（150 μm和200 μm）和冲头尺寸（直径为1.0 mm、1.5 mm和2.0 mm）的背纹状体切片进行OCR分析。直径为1.5 mm的纹状体切片厚150 μm，具有最高的耦合效率，OCR在分析仪²⁴的最佳范围内。

研究方案

包括动物工作在内的所有程序都是根据国家和国际准则进行的，并得到了托马斯杰斐逊大学动物护理和使用委员会的批准。使用3至14个月大的雄性FVB / NTac小鼠。以下步骤是在非无菌环境中执行的，但应谨慎行事，以保持一切尽可能干净。

注:此处介绍的方法已在Zhi等人报告的研究中建立^和使用。这里描述的实验使用了海马XF24细胞外通量分析仪（参见 材料表）。这些方法可以适用于XFe24分析仪，并且使用该分析仪证实了一些结果。

1. 水合物墨盒传感器（测定前 1 天）

1. 打开细胞外通量测定试剂盒（参见 材料表），取出传感器盒（绿色）和实用板（透明; 图 1A）。将传感器盒放在一边（传感器向上），不要触摸传感器。
2. 向实用板的每个孔中加入600μL校准液（pH 7.4）。将传感器盒放在实用板的顶部，然后将传感器浸入校准液中。确保实用程序和传感器盒板的三角形凹口正确对齐（图1B）。
3. 用密封膜密封细胞外通量测定试剂盒，以防止口径溶液蒸发，然后将其置于未补充CO₂ 或氧气的37°C培养箱中过夜。

2.准备组织板（在测定当天）

1. 打开胰岛捕获微孔板，取出胰岛板进行组织坐下。
2. 将适当体积（每孔625μL）的预氧改性人工脑脊液（ACSF，组成140mM NaCl，2.5mM氯化物，2.4mM氯化钙₂，1.3mMMgSO₄，0.3mM KH₂PO₄，25mM葡萄糖，10mM HEPES，pH 7.2）缓冲液在50 mL管中加热至37°C。然后将BSA加入终浓度为4mg / mL以制备呼吸缓冲液。一般来说，50 mL足以容纳一个板。
3. 小心地向胰岛板的每个孔中加入625μL呼吸缓冲液（具有25mM葡萄糖和4mg / mL BSA的预氧化ACSF缓冲液），并避免摇动板。确保传感器滤芯顶部没有残留液滴，并且每个孔的缓冲液中没有气泡。

3. 急性纹状体切片制备及切除切片放置

1. 颈椎脱位后将小鼠斩首，并立即在10mL冰冷的预氧切割液（125mM氯化钠，2.5mM KCl，26mM NaHCO 3，3.7mMMgSO₄，0.3mM KH₂PO₄，10mM葡萄糖，pH 7.4）中解剖大脑。
2. 使用振动仪在150μm的冰冷预含氧切割溶液中以150μm的厚度使用振动仪切片。
3. 在50毫升含氧的ACSF（125毫升氯化钠，2.5毫摩尔氯化物，26毫升纳氏_3，2.4毫升钙氯化_物2，1.3毫升MgSO₄，0.3米M KH₂PO₄，10毫升葡萄糖，2毫升HEPES，pH 7.4）中回收切片，并在室温（RT）下保持在溶液中长达30分钟。
4. 回收后，将切片转移到带有5 mL呼吸缓冲液的35 mm x 10 mm培养皿中。
5. 使用不锈钢活检冲头（例如，直径1.5毫米）在切片大脑的所需区域创建一个圆形组织块。将切片保持在缓冲液中，同时用冲头轻轻向下按压。确保将冲头向下推足够用力以切割组织。取出组织的其余部分，将冲头抬起，然后将圆形组织片取出到缓冲液中。
6. 切开1 mL移液器吸头的最末端，形成一个直径为1.5-2.0 mm的孔，并用它来固定并将打孔切片转移到捕获屏幕的顶部。抽取一块打孔的脑组织，并将组织小心地放在捕获屏幕的网状侧（图2A）。捕获屏幕将是一块圆形塑料，一侧连接有网格。
   注意:捕获屏幕包含在微孔板包装中（参见 材料表），类似于Schuh等人²³中使用的捕获屏幕。
7. 轻轻地使用纸巾短暂干燥捕获屏幕。随着水分的去除，组织变得粘稠，这使得切片附着在网的中心。不要将切片过多地干燥，否则会损坏。
8. 用镊子将捕获屏幕切片面朝下，然后将其放入孵育胰岛板的一个孔中（图2B）。注意不要掉落切片;如果是这样，请取出屏幕并在其上放置一个新切片。
   注意:不要将脑切片放入胰岛板中的两个背景校正孔（A1和D6）中。
9. 在运行测定之前，将胰岛板在37°C下孵育至少30分钟，以使温度和pH平衡。

4. 装载含有所需化合物的墨盒

1. 将所需化合物在改性ACSF（37°C）中稀释至最终储备浓度分别为端口A至D的工作浓度的10倍、11倍、12倍和13倍，并调节至pH 7.4。该测试将按从端口A到D的顺序管理化合物。对于该实验，使用以下溶液，其各自的工作浓度在它们之前提到:10mM丙酮酸盐（端口A），20μM寡霉素（端口B），10μM或其他浓度的FCCP（端口C）和20μM抗霉素A（端口D）。
2. 轻轻地将75μL稀释的化合物预装到传感器盒的适当进样口中。将吸头以45°角将吸头放在注射口的一半，吸头靠在注射口壁上。吸头不应完全插入注射口的底部，因为这可能会导致化合物通过进样口泄漏。
3. 小心地从端口中取出吸头，以避免产生气泡。请勿轻触滤芯的任何部分，以免产生气泡。
4. 目视检查注射口是否均匀装载。确保所有液体都在端口中，并且墨盒顶部没有残留物。
5. 将传感器盒放在实用板上，将其放入培养箱（非CO₂）中30分钟，使其再次加热至37°C。只需抓住实用板即可小心处理。尽可能少地移动。

5. 校准和执行测定

1. 在软件中加载测定模板。按绿色的 "开始" 按钮。
2. 确保加载正确的协议。该协议包含3分钟混合，3分钟等待和2分钟测量序列的组合（这三个步骤形成一个测量）。在仪器设置 25 下的硬件设置中，将探头的距离从 26，600 更改为²⁷，800。无需更换 XFe24 分析仪的探头。按 开始。
3. 将实用程序板上的传感器盒装入仪器托盘。缺口位于前方左下角。确保板正确放置且平整。将充满药物的电极盒装入分析仪进行校准。
4. 按照屏幕上的说明校准和平衡传感器。这大约需要30分钟。
5. 校准步骤完成后，取出校准板并用胰岛板（包含网状和组织切片）替换它。
6. 使用测定方案测量板每个孔中的氧气消耗量。该协议包含3分钟混合，3分钟等待和2分钟测量序列的组合（这三个步骤形成一个测量），此时计算OCR。
7. 对于整个实验，包括4x OCR测量以创建基线，然后以4x测量值注射端口A（丙酮酸盐），然后以8x测量值注射端口B（寡霉素），然后以5x测量值注入端口C（FCCP），最后以6x测量值注入端口D（抗霉素A）。
   注意:每次复合进样后的测量次数取决于测量到达平台的时间。
8. 分析OCR测量数据和耦合效率数据。

结果

本研究的第一步是优化切片厚度和冲头尺寸，用于从切片中切除纹状体的一部分（图3A）。厚度为 150 μm 的切片和 1.5 mm 的冲头尺寸可获得最佳结果，由耦合效率决定（图 3B-C）。如图3B所示，OCR在5小时内相对稳定，运行速度小于10%。此外，使用功能测量，以及纹状体中皮质神经元和中多棘神经元的膜片钳...

讨论

我们开发的方法允许使用XF分析仪在4小时的时间跨度内测量成年小鼠纹状体切片中的OCR。这种方法提供了一种测量从解剖学定义的大脑结构中切除的冲头中的细胞生物能量学的新方法。由于正在分析的组织样本相当小，因此可以研究与疾病有关的特定脑区域的代谢参数。此外，使用急性切片更接近于模拟生理细胞环境，这是分离的线粒体或培养的细胞和有机类型切片无法实现的。此外，在单个动?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions